Abstract

Distinctive características genotípicas e fenotípicas de câncer de ovário via epitelial-mesenquimal de transição (EMT) tem sido correlacionada com a resistência aos medicamentos e recorrência da doença. Nós investigamos se a reversão terapêutico de EMT poderia re-sensibilizar células de cancro do ovário (OCCS) à quimioterapia existente. Nós relatamos que epimorphin, uma proteína morfogénica, tem o controle central sobre mesenquimais contra decisão linhagem de células epiteliais dos OCCS putativos. A exposição a epimorphin induziu alterações morfológicas reminiscente de mesenquimais-epiteliais de transição (TEM), mas de um modo dependente da dose, isto é, a 10 ug /mL de células epimorphin obter uma morfologia mais mesenquimais semelhante, enquanto a 20 ug /mL de epimorphin células apresentam uma morfologia epitelial. As últimas alterações foram acompanhadas por supressão dos marcadores mesenquimais, tais como a vimentina (↓ ~ 8 vezes,

P

0,02), ↓ TWIST1 (~ 7 vezes,

P

0,03), dystroglycan (↓ ~ 4 vezes,

p Restaurant 0,01) e Palladin (↓ ~ 3 vezes,

p Art 0,01). Por outro lado, elevações significativas de KLF4 (↑ ~28 vezes,

p Art 0,002), β-catenina (↑ ~ 6 vezes,

p Art 0,004), EpCAM (~ ↑ 6 vezes,

p Art 0,0002) e ocludina (↑ -15 vezes,

p Art 0,004) mRNAs como parte do compromisso com a linhagem de células epiteliais foram detectados em resposta a 20 ng /mL de epimorphin exógeno. Alterações nos níveis de ARNm ocludina foram acompanhadas por uma paralela, embora a expressão mais fraca ao nível da proteína (~ 5 vezes ↑,

P

0,001). Da mesma forma, a aquisição de propriedades epiteliais-like, incluindo Mucina1, CK19 e expressão do gene β-catenina, também foi obtido após o tratamento epimorphin. Além disso, a produção MMP3 foi encontrado para ser reduzida enquanto a secreção de laminina foi fortemente amplificado sobre MET induzida por epimorphin. Estes resultados sugerem que há uma janela de dosagem para ações de epimorphin na diferenciação celular, em que ele pode suprimir ou aumentar a diferenciação epitelial de OCCS. É importante ressaltar que a indução de fenótipos epiteliais-como por epimorphin levou a uma maior sensibilidade à carboplatina. No geral, nós demonstramos que epimorphin pode reverter OCCS longe de seu fenótipo mesenquimal e em direção a um fenótipo epitelial, reforçando assim a sua sensibilidade a um agente quimioterapêutico de primeira linha

Citation:. Yew KH, Crow J, Hirst J, Pressetto Z, Godwin AK (2013) Epimorphin Induzida por MET sensibiliza células do cancro do ovário para Platinum. PLoS ONE 8 (9): e72637. doi: 10.1371 /journal.pone.0072637

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Abril 2013; Aceito: 11 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yew et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado em parte por uma concessão do projeto do programa do Fundo Ovarian Cancer Research (https://www.ocrf.org), uma bolsa do programa Acadêmico Kansas Bioscience eminente autoridade, e uma concessão do NCI (R01CA140323) para AKG Os autores também gostaria de reconhecer o apoio da Universidade de Centros Cancer Kansas (KUCC) (P30 CA168524) recursos compartilhados e da Universidade de Kansas Endowment Association. A.K.G é o Ilustre presidente Chanceleres em Ciências Biomédicas na KUCC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial (EOC) é a principal causa de morte em mulheres, muitas vezes devido ao reconhecimento em estágio final e reincidência do tumor agressivo. morbidade alta paciente é atribuível em parte ao crescimento recorrente de células tumorais de ovário residuais que se tornam resistentes aos tratamentos quimioterápicos padrão, e depois proliferam de forma agressiva e espalhar ou metástase para vários sites. Estudos recentes revelaram que as células de cancro do ovário com características epiteliais são, de facto, mais sensível a regimes de quimioterapia, em comparação com as células de tumor com traços mesenquimais [1], [2], [36]. No entanto, quando estas células sofrem epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), tornam-se menos sensível a regimes terapêuticos convencionais [1] – [3], [36]. EMT, induzida por uma grande variedade de estímulos e citocinas, tornou-se proeminentemente implicado como um meio pelo qual diferenciadas EOCs sofrer uma conversão fenotípica que está associado com a perda de características epiteliais (por exemplo, ocludina) e a aquisição de marcadores mesenquimais (por exemplo, vimentina). Portanto, a reversão da EMT (isto é, Met) pode tornar as células tumorais mais susceptíveis a primeira linha de drogas anti-cancerosas e potenciam os efeitos apoptóticos de certos agentes quimioterapêuticos.

Epimorphin, também conhecido como 2-sintaxina, é um mediador importante de numerosos processos fundamentais no desenvolvimento embrionário e, frequentemente, desempenham um papel crucial na região de interacções mesênquima-epitélio [4] – [8]. Estudos subsequentes mostraram também que medeia epimorphin padronização epitelial e morfogénese em muitos tecidos, tais como condutas de pancreáticas [5], glândula mamaria [6], pulmonares [7], e epitélio do intestino delgado [8]. Enquanto epimorphin parece ser expresso no ovário e testículos de mamífero [9], o mecanismo exacto pelo qual este morfogénio mesenquimais exerce o seu efeito regulador sobre gónadas humana permanece largamente desconhecido.

Embora o receptor cognato epimorphin e a sua sinalização a jusante mecanismo ainda não tenham sido identificados, epimorphin foi encontrado para se ligar a aV receptores de integrina nas células epiteliais mamárias [10] e receptores de EGF sobre células epiteliais intestinais [11] que activam factores de transcrição da proteína de ligação CCAAT /enhancer (C /EBPα e β) [12], [15] e NF-kB [13]. Curiosamente, krueppel-like factor de 4 (KLF4), um factor de transcrição dedo de zinco expressa em células epiteliais de vários órgãos [16], tem sido demonstrado que se ligam directamente ao promotor de C /EBP [17] e interagir com a subunidade de NF-kB p65 [18], que regulam a diferenciação epitelial pulmonar durante a organogénese [19] e epitelial mamaria ramificação [20], respectivamente. Investigações posteriores indicaram que epimorphin pode induzir morfogênese epitelial regulando ativador do plasminogênio tipo uroquinase (uPA) [13], [14], bem como involucrina e citoqueratina [15].

Dado o papel proposto para epimorphin como um factor de pró-epitelial em vários tecidos [5] – [8], avaliou-se epimorphin sinalização pode ser capaz de induzir as células de cancro do ovário com traços mesenquimais para a linhagem de células epiteliais e se essa conversão pode levar ao aumento da sensibilidade a agentes de quimioterapia convencionais .

Materiais e Métodos

Reagentes

de soro Fetal bovino, SYBR Green, corante de referência para a PCR quantitativa, e Cocktail de Inibidor de Protease foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Meio RPMI 1640 foi obtido a partir de Gibco /Invitrogen. RNeasy Mini Kit, Sensiscript® Transcriptase Reversa Kit, QIAamp DNA Micro Kit, e Kit QIAquick Gel Extraction foram todos adquiridos de Qiagen (Valencia, CA). AmpliTaq Gold com tampão de PCR GeneAmp 10X e MgCl

2 solução foram obtidos de Applied Biosystems (Foster City, CA).

Cultura de Células e

As células de cancro do ovário humanos Tratamento

(OCCS) , A1847, A2780 e OVCAR10 foram descritos anteriormente [21] e foram usadas em todas as experiências. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 0,2 unidades /insulina humana ml, 50 unidades /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C sob uma condição humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. A1847 e A2780 foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10

4 células /mL em placas de 24 poços e foram tratadas com 10 ug /mL ou 20 ug /mL de epimorphin (R D Systems, Minneapolis, MN) seguido de 3 dias de incubação em meio contendo soro a 1%.

SYBR Green real-Time PCR quantitativa

O ARN total foi extraído a partir OCCS epimorphin-tratados e não tratados e digerido com ADNase. O ARN foi submetido a transcrição reversa. O ADNc foi então amplificado utilizando um Bio-Rad CFX96 ™ (Hercules, CA), o sistema de detecção em tempo real. A menos que especificado de outra forma, cada mistura de reacção continha tampão 10X de ouro, 25 de MgCl

2, 2,5 de dNTPs mM, 10X de SYBR Verde, a polimerase AmpliTaq Gold, Referência tintura, dH

2O, molde de ADN e 10 ^ M de cada iniciador. A amplificação foi realizada através da activação da polimerase inicial durante 10 min a 95 ° C, e 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 20 seg e alongamento durante 30 segundos a 72 ° C (Tabela S1). O valor do limiar de fluorescência foi calculada utilizando o software do sistema ™ em tempo real CFX96. O cálculo da variação relativa dos níveis de mRNA foi realizada utilizando o método delta-delta [22], com a normalização para o RPL13A gene housekeeping.

fluorescência de células activadas (FACS)

Epimorphin-tratada e células de cancro do ovário não tratados foram fixadas com paraformaldeído a 2% tamponado com fosfato durante 30 min a RT. Após a fixação, as células foram permeabilizadas com 1X FACS ™ permeabilização de Solução 2 (BD Biosciences, San Jose, CA) durante 30 min à temperatura ambiente, bloqueadas com albumina de soro de bovino durante 30 min e, em seguida, incubadas com rato FITC-conjugado anti-humano-EpCAM (BD Biosciences, San Jose, CA) e rato FITC-conjugado anti-humano-vimentina (Abcam, Cambridge, MA) no escuro durante 30 min à TA. As células foram enxaguadas com PBS e imagens digitais de fluorescência foram capturadas utilizando BD Biosciences LSR II. BD FACSDiva ™ Version 6 software foi aplicado para caracterizar e monitorar o desempenho dos citómetros. software FlowJo foi então utilizada para a análise de citometria de fluxo de dados. controles single-coradas foram usadas para definir os parâmetros de compensação e amostras não coradas usados ​​para definir portões negativos.

Imunomarcação

Se não for tratada e células epimoprhin tratados cultivadas em lamelas não-revestido de vidro (Fisher Scientific, Pittsburgh , PA) a uma densidade de 4 x 10

4 células foram fixadas com etanol durante 30 min a 4 ° C. Após a fixação, as células foram permeabilizadas com frio (-20 ° C) de acetona durante 3 minutos à temperatura ambiente, bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino durante 1 hora, e, em seguida, incubadas com β-catenina (L54E2) mAb de ratinho (Alexa Fluor® 488 conjugado;. Cell Signaling tech, Danvers, MA) numa câmara húmida durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as células foram lavadas com PBS. Depois de várias lavagens, lamelas contendo células foram montadas em lâminas em VECTASHIELD® meio de montagem com DAPI (Vector Labs, Inc, Burlingame, CA). imagens digitais de fluorescência foram capturadas usando um microscópio Nikon Eclipse 80

i

(Melville, NY) ligado com um adaptador de câmera Nikon Q-imaging. Metamorph software de análise de imagens (versão 7.7.0.0) foi usado para a aquisição e análise de imagens.

de SDS-PAGE e análise por Western blot

As proteínas foram separadas em tampão de Tris-HCl Pronto Gel 10% ( bio-Rad, Hercules, CA), transferidos para membranas de nitrocelulose, e incubados com anticorpo monoclonal de ratinho [ab6276] para a p-actina, a uma diluição de 1/5000, monoclonal de ratinho [ab28081] para mucina-1 a uma diluição de 1/1000 , anticorpo monoclonal de ratinho [ab7754] para citoqueratina 19 (CK-19) a uma diluição de 1/1000 ou policlonal de coelho [ab31721] a ocludina a uma diluição de 1/250, durante 2 h à TA. Todos os anticorpos de Western blot foram obtidos a partir de Abcam (Cambridge, MA). Após a incubação, as membranas foram lavadas 3x durante 15 minutos em tampão de lavagem (PBS-0,05% Tween 20) e incubou-se com um anti-murganho secundário (β-actina, mucina-1, vimentina, palladin, e citoqueratina 19) ou anti- anticorpo (ocludina) de coelho acoplado a peroxidase de rábano (Vector Labs, Burlingame, CA) durante 1 h à TA. Em seguida, as membranas foram lavadas 3x durante 15 minutos em tampão de lavagem, e a imunorreactividade foi normalizada por quimioluminescência (kit Amersham ECL + Plus) de acordo com as instruções do fabricante. As membranas foram expostas a filmes de imagiologia científicos Kodak (Rochester, NY) dentro de 1 min para a detecção. densidades de pixel de imagens blot foram calculados usando o software Imagem-J (NIH). Alterações nos níveis de proteína foram normalizados para controles e expressa como alteração vezes em relação aos controles.

Medição de citocinas

À tela para a secreção de matriz extracelular induzida epimorphin-, A1847 OCCS (4 × 10

4 células /ml em placas de 24 cavidades) foram incubadas com meio isolado (controlo negativo), 10 ug /mL ou 20 ug /mL de epimorphin durante 3 dias. Laminina (Millipore, Temecula, CA) e MMP3 (R D Systems, Minneapolis, MN) secreção para os sobrenadantes de cultura foram medidos por ELISA em sanduíche de acordo com o protocolo dos fabricantes. Os pontos de dados são expressos como a concentração média de ensaios em duplicado a 450 nm

tratamentos com drogas, celular Viabilidade Ensaio e nexina Cell Death Ensaio

A1847, A2780 OVCAR10 foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10

4 células /mL em placas de 48 poços e foram cultivadas com epimorphin a uma concentração de 20 ug /ml durante 3 dias. Epimorphin-tratadas e células não tratadas foram depois cultivadas com uma dose de carboplatina de série (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA) durante mais 3 dias. intervalo de doses para a carboplatina epimorphin-tratados e não tratados A1847 foram de 1 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 200 uM e 400 uM. intervalo de doses para a carboplatina epimorphin-tratados e não tratados A2780 foram de 1 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 150 uM e 200 uM. intervalo de doses para a carboplatina epimorphin-tratados e não tratados foram OVCAR10 50 uM, 100 uM, 150 uM, 200 uM, 400 uM e 500 uM. A viabilidade celular foi determinada medindo a actividade metabólica utilizando CellTiter-Blue® pela Promega e as placas foram fotografadas no Tecan Fluorómetro. Os dados foram então normalizados para a percentagem de inibição e IC

50 concentrações de carboplatina foram determinados para epimorphin-tratadas e células não tratadas pelo programa de gráficos SigmaPlot (Systat Software). A morte celular ou apoptose foi quantificada utilizando o ensaio de goiaba nexina Anexina V por meio de um fluxo de goiaba EasyCyte HT citómetro (goiaba Technologies, Hayward, CA). O ensaio utiliza dois corantes nexina: 7-AAD, um corante impermeabilizante celular, como um indicador da integridade estrutural da membrana e Anexina V-PE para detectar a fosfatidilserina na membrana externa das células apoptóticas. As amostras foram preparadas de acordo com as especificações do fabricante. Os dados foram normalizados para os controles e são representados como meios ± S.D.

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​usando o Microsoft Office Excel 2010 e expressos em média ± S.D. onde apropriado. Duas comparações entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student não pareado. Os valores de p 0,05. Foram considerados estatisticamente significantes

Resultados

morfológicos e moleculares Efeitos da Epimorphin Associated com MET em células de cancro do ovário

Os trabalhos anteriores têm implicado epimorphin como mediadores de morfogénese epitelial em vários órgãos e células [4] – [13]. No entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo pelo qual epimorphin mediar tais efeitos em células de cancro do ovário. Em primeiro lugar temos utilizado um kit de ELISA para comparar os níveis de epimorphin em várias linhas celulares de cancro do ovário com as células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo, que foram utilizados como controlos positivos. A produção endógena epimorphin foi relativamente baixa (intervalo: 0,1-0,3 ng /ml) em todas as linhas celulares de cancro do ovário testadas em comparação com as células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo (gama: 10-12 ng /ml) (dados não mostrados). Em seguida, determinou-se a tempo óptimo e a dose de tratamento para induzir epimorphin MET na linha celular de cancro ovariano, A2780. Estudos recentes têm mostrado que a 20 ug /ml de epimorphin foi capaz de activar MEK-ERK1 via 2 /(11) e induzir a diferenciação de MMPs (13). Para avaliar a resposta dependente da dose em células de cancro do ovário, que em primeiro lugar realizada uma ampla resposta-dose (2 a 20 ug /ml) de epimorphin usando células A2780. Descobrimos depois de 3 dias a 20 ug /mL de epimorphin, as células A2780 foram submetidos a alterações morfológicas significativas (de mesenquimais para epitelial) tal como analisado por microscopia óptica de contraste de fase, imunotransferência e em tempo real quantitativa de RT-PCR, enquanto que 2 g /ml de epimorphin eliciada não há respostas celulares (dados não mostrados). A seguir avaliou a dose óptima de epimorphin e descobriram que tanto A2780 e A1847 tratados com a dose mais baixa (10 ng /mL) de epimorphin exibiu uma mais alongada e estreladas-mesenquimal como aparência (Fig 1B . 1E). Em comparação, a dose mais elevada (20 ug /mL) para levar um epitelial semelhante em forma como visualizado por microscopia de contraste de fase de exame mais arredondada (Figura 1C . 1F). Estes resultados sugerem um efeito bifásico de epimorphin e uma janela estreita de dosagem para otimizar reverter células mesenquimais a uma morfologia mais epitelial. Para além disso, removeu-se a epimorphin exógeno, substituindo a cultura de células com meio fresco após TEM induzida por epimorphin para uma incubação adicional de 3 dias. O MET de células de cancro do ovário induzida por epimorphin permaneceu fenótipo epitelial tal como analisado por um microscópio óptico de contraste de fase e PCR em tempo real quantitativo (dados não mostrados). Para analisar melhor a natureza deste efeito, foram medidos os níveis de aV-integrina, um “receptor epimorphin” em A1847 e descobriu que os níveis de estado estacionário de aV-integrina foram baixas, mas foram induzidos 9 vezes em 20 mcg /mL epimorphin (Fig. 2A). Semelhante aos níveis de receptores aV-integrina, os mediadores a jusante, por exemplo, fatores de transcrição C /EBP (↑ ~ 9 vezes,

p Art 0,056) (Fig. 2B) e KLF4 (~28 vezes ↑ ,

p

. 0,002) (Fig 2C), foram encontrados para ser significativamente elevados, sugerindo que C /EBP e KLF4 pode ser reguladores-chave da epimorphin mediada TEM. Do mesmo modo, os níveis de ARNm de β-catenina (↑ ~ 6 vezes,

P

0,004) (Fig. 2D), ocludina (↑ -15 vezes,

P

0,004 ) (Figura 2E) e EpCAM (↑ ~ 6 vezes,

P

.. 0.0002) (Figura 2F) foram encontrados para ser fortemente regulada positivamente na maior dose de epimorphin, novamente indicando apoio a uma conversão -epitelial como fenótipo. Os marcadores moleculares de fenótipo mesenquimal, tais como TWIST1 (Fig. 2G), vimentina (Fig. 2H), distroglicana (fig. 2i) e palladin (Fig. 2J), foram suprimidos em 20 ug /epimorphin ml mas aumentou significativamente após estimulação de A1847 com uma dose mais baixa de epimorphin, o que implica que o interruptor de entre mesenquimais e epiteliais fenótipos é provável que seja dependente da dose.

A2780 e A1847 foram incubadas com 10 ug /mL ou 20 ug /mL de 3 para epimorphin dias. A-F: Epimorphin (20 ug /ml) induziu um paralelepípedo arredondada, a aparência do epitélio semelhante em ambos A2780 (C) e A1847 (F). Em comparação, epimorphin a 10 ug /ml de levar a uma morfologia mais alongada mesenquimal em ambas A2780 (B) e A1847 (E), em comparação com controlos não tratados (A D). Imagens de morfologia celular foram capturados em aumento de 10x, com pelo menos 3 imagens por bem, usando um microscópio de contraste de fase vertical (T3.15A; Fisher Scientific)

A e B:. AV-integrina do receptor (a) e C /EBP p (B) mostrou elevação acentuada dos níveis de ARNm em resposta a 20 ng /mL de epimorphin. C-F: marcadores epiteliais, tais como KLF4 (C), β-catenina (D), ocludina (E), e EpCAM (F) foram encontrados para ser regulada positivamente por exógena 20 ug /mL de epimorphin. G-J: Expressão de marcadores mesenquimais TWIST1 (G), vimentina (H), distroglicana (I) e palladin (J) foram regulados negativamente após o tratamento com epimorphin (20 ug /ml). No entanto, todos os quatro marcadores mesenquimais (G-J) foi encontrado para ser regulada positivamente por 10 ug /mL de epimorphin (médias ± DP, n = 3) [*

P

0,05 comparado com o controlo].

efeitos de epimorphin sobre fenótipos expressão gênica em A1847

em um esforço para confirmar ainda mais os efeitos indutivos de epimorphin em modificações fenotípicas, immunoblotting e ELISA foram realizados para determinar o perfil da expressão da proteína ambos os marcadores epiteliais e mesenquimais. Análise quantitativa da proteína ocludina em A1847 mostrou que o tratamento com a dose mais elevada epimorphin expressão aumentada ocludina por cinco pregas (Fig. 3) em comparação com não tratado, consistente com o resultado observado com os níveis de ARNm (Fig. 2E). Do mesmo modo, os aumentos semelhantes foram obtidos para CK-19 e mucina-1 (Fig. 3), o que implica que novamente A1847 epimorphin tratados sofrem alterações fenotípicas associadas com MET. No entanto, a expressão de genes mesenquimais, palladin e vimentina (Figura S1) aumentaram de 1 e 2 vezes, respectivamente, em A1847 tratadas com 10 ug /ml epimorphin, novamente sugerindo que a indução de EMT ou Met em resposta a epimorphin é bidirecional dependendo da dose aplicada. A seguir, realizados ensaios ELISA para determinar a libertação de proteínas associadas com fenótipos epiteliais e mesenquimais. Curiosamente, a secreção de laminina (Fig. 4A), uma glicoproteína extracelular essencial para o desenvolvimento da polaridade celular epitelial, foi encontrada para ser significativamente elevados mediante tratamento de A1847 com epimorphin. Por outro lado, a produção de MMP3 (Fig. 4B), um marcador mesenquimais importante para a invasão de células de cancro e de migração, foi encontrada para ser diminuída após 20 ug /mL tratamento epimorphin mas fortemente supra-regulada em 10 ug /mL. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que há um compromisso progressiva de células do tumor dos ovários para uma linhagem epitelial, quando cultivadas com uma dose suficiente de epimorphin.

A expressão de proteínas dos marcadores associados-epiteliais, por exemplo, mucina-1, CK -19 e ocludina foram avaliadas por immunoblotting e densidades da banda foram quantificados por programa Image-J. Fold aumentos na expressão de proteínas de tratamento (20 ug /ml epimorphin) versus A1847 não tratada: aumento de 2,5 vezes para CK-19; aumento de 1,5 vezes para mucina-1, e aumento de 4,5 vezes para ocludina. β-actina serviu como controlo de carregamento. (Média ± D.P., n = 3). [*

p Art 0,05 comparado com o controle]

A secreção de laminina (marcador epitelial) e MMP-3 (marcador mesenquimais) foi medida por ELISA após o tratamento de câncer de ovário A1847. as células cancerosas com epimorphin durante 3 dias (a 10 ou 20 ug /ml). A exposição a epimorphin (/ml 20? G) aumentaram significativamente a produção de laminina e levar a uma diminuição na secreção de MMP-3, quando comparado com o controlo. Em comparação, a MMP-3 de libertação foi maior quando A1847 tratado com a concentração mais baixa de epimorphin (10 ug /ml), sugerindo novamente epimorphin pode induzir alterações fenotípicas em células de cancro do ovário de um modo dependente da dose (média ± DP, n = 3 ) [*

p Art 0,05 comparado com o controle]

epitelial Diferenciação em resposta a exógena Epimorphin

β-catenina, um fator chave no Wnt. via de sinalização, foi mostrado para determinar o destino das células epiteliais durante o desenvolvimento embrionário do ovário [23]. Perda de β-catenina no final do desenvolvimento embrionário resultou em defeitos profundas na maturação do epitélio na idade adulta [24]. Para investigar se o TEM mediadas por epimorphin está associada com aumento da expressão endógena de β-catenina, que utilizado para a imunocoloração β-catenina para avaliar a diferenciação de células epiteliais de A1847-epimorphin tratada. Ambos A1847 não tratada e OVCAR10 teve poucas células-β-catenina positiva; mas mostraram expansão proeminente da região em torno da junção célula-célula, mais notavelmente em A1847 epimorphin-tratada e OVCAR10 (Fig. 5). Um aumento nas células-β-catenina positivos observados em epimorphin-tratada A1847 e OVCAR10 representada uma forma de dose-resposta destas células a 20 ug /mL epimorphin. Esta evidência experimental aponta para um papel para epimorphin de sinalização na indução da diferenciação β-catenina, que pode ser um determinante importante do comprometimento de linhagem epitelial em células do tumor dos ovários. Além disso, a análise de FACS identificou uma sub-fracção de células A1847 com EpCAM regulada positivamente (marcador epitelial) e regulados negativamente vimentina (marcador mesenquimais) após o tratamento com 20 ug /mL epimorphin (Figura S2 S3).

e não tratada 20 ug /mL epimorphin-tratada A1847 e OVCAR10 foram analisados ​​para β-catenina, um marcador de diferenciação epitelial, por imunocoloração. β-catenina (verde), DAPI (azul) e merge (verde neon) em A1847 não tratada (A-C) e OVCAR10 (G-I); A1847-tratada epimorphin (D-F) e OVCAR10 (J-L). análise de imunomarcação mostraram um aumento da expressão das células-β-catenina positiva em A1847-tratada epimorphin (D F) e epimorphin-tratada OVCAR10 (J L). Havia células positivas abundante β-catenina em e em torno das junções célula-célula de A1847 induzida por epimorphin e OVCAR10 (F L) em comparação com os controles não tratados (C I).

viabilidade celular e anexina-V Atividade durante a apoptose induzida por carboplatina em OCCS tratados Epimorphin

para determinar se a carboplatina pode preferencialmente matar células de câncer de ovário, com mais morfologias epiteliais-like, que comparou a capacidade de carboplatina para induzir a morte celular após epimorphin- tratamento. Como mostrado na Figura 6, a exposição às carboplatina a uma diminuição significativa no número de células viáveis ​​a seguir epimorphin induzida por TEM A1847 (

P

= 0,005) (Fig. 6A) e A2780 (

p

= 0,007) (Fig. 6B), em comparação com os controlos. Embora a tendência foi semelhante, a alteração na sensibilidade ao OVCAR10 (Fig. 6C), com ou sem epimorphin não era estatisticamente diferente (

P

= 0,170), possivelmente devido à falta de escala de dose no ponto mais alto de o intervalo para plotagem e modelar os dados de resposta. Fluorocromo marcado com Anexina V foi usada para identificar células apoptóticas [25], [26]. Como mostrado na Figura 6D-6F, foi observada a indução de apoptose nas três OCCS tratados com epimorphin, incluindo a linha celular de carboplatina mais resistente, OVCAR10 em comparação com as não tratadas OCCS. A percentagem de células apoptóticas aumento nas células tratadas com epimorphin com concentrações crescentes de carboplatina (Fig. 6D-6F). Estes resultados sugerem que os OCCS com características mesenquimais se tornam mais sensíveis a apoptose induzida por carboplatina após epimorphin associado a um estado diferenciado epitelial semelhante. Importantemente, quando avaliadas utilizando 10 ug /ml de epimorphin, que não induziu MET, as três linhas de células de cancro do ovário avaliada (isto é, A1847, A2780 e OVCAR10) mostraram resistência aumentada a carboplatina como medido por CellTiter® azul (Figura S4). Estes resultados enfatizam que a reversão da EMT pode servir para ajudar ainda mais a sensibilizar doença recorrente às terapias de primeira linha. Uma vez que a proliferação de células elevada, pode ter um impacto dramaticamente de resistência de platina carboplatina e drogas só danificam as células durante a fase S do ciclo celular, a contagem de células utilizando um hemocitómetro manuais foram realizados para monitorizar a proliferação no final da cultura. Pouco ou nenhuma alteração nas taxas de crescimento celular foi observado para epimorphin-tratados, em comparação com OCCS não tratadas (dados não mostrados)

AF:. A1847, A2780, e OVCAR10 foram tratadas com 20 ug /mL para epimorphin 3 dias. Após 3 dias, epimorphin-tratados e não tratados OCCS foram cultivadas em triplicado com doses seriadas de carboplatina durante mais 3 dias. A viabilidade celular foi quantificada utilizando um ensaio CellTiter Blue® (A-C). A apoptose foi quantificada utilizando um ensaio de goiaba nexina (D-F). A-C: CI

50 valores indicam carboplatina induzida perda mais a viabilidade celular em todas as três OCCS tratados com epimophin do que os controlos não tratados de uma forma dependente da dose. D-F: Detecção de respostas apoptóticas foi encontrado para aumentar em todos os três OCCS tratados com epimorphin com o aumento das concentrações de cisplatina, em comparação com os dos controlos não tratados. Os dados foram normalizados para os controlos e são representados como a média ± S.D. [*

p Art 0,05 comparado com o controle]. Imagens de células em apoptose foram capturados em aumento de 10x, com pelo menos 3 imagens por bem, usando um microscópio vertical de contraste de fase. (T3.15A; Fisher Scientific)

Discussão

evidências crescentes suporta o papel crítico na orquestração de EMT embriogénese, a regeneração dos tecidos, e a metástase de cancros [1] – [3], [16], [27], [30] – [35]. alteração genética e alterações morfológicas são modulados durante a metástase do cancro, tais como a perda de identidade de células epiteliais (por exemplo, ocludina e EpCAM) e aquisição de características mesenquimatosas (e.g., vimentina e TWIST1) [1] – [3], [27]. No desenvolvimento, a EMT e o processo inverso, MET constituem um mecanismo essencial na regulação da plasticidade fenotípica que se caracteriza como os eventos celulares e moleculares envolvidos na interconversão entre epitélio e mesênquima durante a montagem e remodelação embrionário. No entanto, no cancro, plasticidade fenotípica pode afectar a progressão do tumor e a eficácia do fármaco através da manutenção do mesenquimal, fenótipo invasivo de células tumorais que tenham sido submetidos a EMT em resposta a um conjunto diversificado de estímulos extracelulares ou derivados de crescimento.

ovário epiteliais primárias cancros são, na maior parte extremamente sensível às terapias à base de platina. Além disso, doença recorrente freqüentemente responde a rodadas adicionais de quimioterapia; No entanto, o intervalo livre de doença torna-se mais curto depois de cada ciclo, como quimiorresistência aumenta até que a doença torna-se incurável. Os mecanismos que levam à resistência aos medicamentos são complexas; No entanto, estudos recentes sugerem que a EMT está intimamente associada com a resposta à terapia e a sobrevida livre global ou progressão. Pensa-se que os factores intrínsecos derivados do microambiente do tumor induzir OCCS epiteliais se submeter profunda conversão fenotípica de epitelial (rodada em forma) para mesenquimal (fusiforme) morfologia consistentes com EMT [16], [27], [30] – [ ,,,0],35]. Estudos recentes revelaram que os OCCS com características epiteliais são mais sensíveis a regimes de quimioterapia, em comparação com células de tumor de origem mesenquimal [1], [2]. No entanto, os OCCS epiteliais em EMT são susceptíveis de induzir a resistência adquirida e ficar sem resposta a tratamentos com drogas convencionais [1] – [3], [35]. Assim, a hipótese de que a reversão da EMT fenótipo poderia ajudar a superar a resistência associada à platina.

Algumas estratégias foram utilizadas para promover a conversão das células cancerosas mesenquimais para um fenótipo mais epitelial-like como caracterizada pela perda de mesenquimais traços fenotípicos e a aquisição de marcadores epiteliais [28] – [30]. Park e colaboradores [28] demonstraram que a expressão de microRNAs ectópicas (miARNs), tais como o miR-200, podem conduzir a sobre-regulação de E-caderina em linhas celulares de cancro e motilidade reduzida através da segmentação dos repressores transcricionais de caderina-E,

ZEB1

(TCF8 /δEF1) e

ZEB2

(1 [SIP1] /ZFXH1B proteína-interagindo SMAD) transcrições. Eles também relataram uma correlação significativa entre E-caderina e miR-200 em dois conjuntos de amostras de pacientes derivados de câncer primário seroso papilífero ovário [28]. Resultados semelhantes foram relatados quando miR-429 é abundante em células de câncer de ovário metastático [29].