Abstract

A quimioterapia é uma opção importante para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão. Contudo, a resistência do tumor em relação a quimioterapia citotóxica tornou-se mais comum. Tem sido relatado que a autofagia é um dos processos que contribuem para esta resistência. No presente estudo, verificou-se que o anti-câncer de drogas 5-fluorouraci (5-FU) poderia induzir a autofagia em células A549. 5-FU tratamento pode levar à conversão de LC3 I /II, a sobre-regulação de beclin-1, a regulação negativa de p62 e a formação de organelos vesiculares ácidas (avos) em células A549. Pré-tratamento de células cancerosas com 3-MA ou siAtg7 poderia intensificar a apoptose induzida por 5-FU através da activação de caspases, e o inibidor de caspases Z-VAD-fmk resgatado a redução da viabilidade celular. Além disso, a inibição da autofagia também estimulou a formação de ROS e eliminação de ROS por NAC antioxidante inibia a actividade da caspase-3, impedida a libertação de citocromo-c a partir da mitocôndria e, eventualmente, salvado células cancerosas de apoptose 5-FU-mediada. Estes resultados sugerem que a resposta autophagic 5-FU provocou desempenha um papel protector contra a apoptose das células e a inibição da autofagia poderia sensibilizar para 5-FU induziu apoptose dependente da caspase através da estimulação da formação de ROS.

Citation : Pan X, Zhang X, Sun H, Zhang J, Yan M, Zhang H (2013) Autophagy Inibição Promove 5-Fluorouraci Induzida por apoptose por Formação Estimulante ROS in Human células não pequenas do pulmão Cancer A549 Cells. PLoS ONE 8 (2): e56679. doi: 10.1371 /journal.pone.0056679

editor: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 13 de outubro de 2012; Aceito: 12 de janeiro de 2013; Publicação: 18 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Pan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por um projeto de Programa Província de Shandong Superior de Educação Ciência e Tecnologia (J10LC66) ea National Science Foundation Natural da China (Grant Nos. 81102828, 81273037, 81202516). Os autores também queria mostrar a apreciação para a província Natural Science Foundation de Shandong da China (No. ZR2011HM011). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais comuns no mundo e a principal causa de morte relacionada ao câncer em muitos países. Aproximado de 85% dos casos de cancro do pulmão pertencem ao cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) [1], [2]. A quimioterapia é uma opção importante na cura ou controlar o cancro do pulmão. 5-fluorouracilo (5-FU), que exerce os seus efeitos anti-cancro através da inibição da timidilato-sintase e a incorporação dos seus metabolitos activos em RNA e DNA de modo a influenciar o metabolismo do uracilo e eventualmente conduzir à apoptose em células de cancro [3] . Nas últimas décadas, as terapias de combinação à base de 5-FU são tratamentos padrão para muitos pacientes com diagnóstico de vários tumores malignos, incluindo NSCLC [4] – [6]. No entanto, juntamente com a sua utilização, a resistência ao 5-FU, tornou-se comum e tem sido reconhecida como uma causa de falha muitos cancros terapia de [7], [8]. Portanto, muitas tentativas foram efectuadas a fim de reduzir a resistência e melhorar a sua eficácia terapêutica. Embora muitas terapias agressivas, tais como novos medicamentos combinados com 5-FU, têm melhorar a sobrevivência pacientes, o efeito destas terapias permanece longe de ser satisfatória no presente. Por conseguinte, é desejável encontrar oportunidades terapêuticas mais adequadas para NSCLC. Relata-se a indução de autofagia por 5-FU em células A549 NSCLC humanas.

Nas últimas décadas, a indução de apoptose tem sido a principal consideração no desenvolvimento de drogas anti-câncer. No entanto, as células cancerosas desencadear múltiplos caminhos para escapar da apoptose [1]. Recentemente, a autofagia tem sido amplamente estudado na terapia do cancro. Além de seu papel de limpeza na remoção de proteínas deformadas ou agregados, limpando organelas danificadas e eliminar patógenos intracelulares, a autofagia tem múltiplas funções fisiológicas e fisiopatológicas na terapia do câncer. Muitos estudos têm-se centrado sobre a relação entre a autofagia e patogénese do tumor, desenvolvimento e tratamento. No entanto, autofagia parece desempenhar um papel paradoxal na sobrevivência de células de cancro e morte. Em quimioterapia, quando as células encontrar alguns fármacos anti-cancro, autofagia é induzida para proteger as células cancerosas contra a apoptose para a sobrevivência da célula. Os mesmos autofagia é reconhecida como um processo citoprotector [7], [9] – [11]; Enquanto isso, os estudos recentes têm demonstrado que a inibição da induz autophagy reduzido nível de apoptose, portanto, autofagia participa na regulação positiva de apoptose [12], [13]; Além disso, como apoptose, autofagia também é uma via alternativa de morte celular programada, denominado tipo-II, a morte celular programada [14] – [16]. Presumivelmente, o papel de autofagia pode depender do tipo de tumor e os estímulos, o estágio de desenvolvimento de neoplasias e o estado apoptótico em células tumorais. modificação apropriada de autofagia, a inibição da autofagia citoprotector para aumentar a apoptose de células tumorais em resposta a agentes anti-cancro pode melhorar os efeitos da quimioterapia [9]. Assim, em adição à resposta apoptótica, o estudo de autofagia é uma direcção potencial para o desenvolvimento de drogas anti-cancro.

espécies reactivas de oxigénio (ROS) desempenham um papel importante numa variedade de programas celulares durante fisiológica bem como as condições patológicas. Quando produzido em quantidades moderadas, ROS agem como moléculas de sinalização em vias de transdução de sinal para regular o crescimento celular, diferenciação, sobrevivência, a inflamação e a resposta imune [17]. Por outro lado, quando produzido em excesso, que partilham a capacidade de infligir danos oxidativos para moléculas biológicas vitais, como o DNA, lípidos e proteínas, o que altera a sua funcionalidade e causa prejuízo da integridade celular [18]. Nos últimos anos, a evidência de montagem indica que as ROS estejam implicadas na indução autofagia na terapia do cancro [19] – [21], sugerindo que as ROS desempenha um papel crucial na resposta à terapêutica do cancro, a desregulação da formação de ROS está associado com a iniciação do cancro, progressão e resistência aos medicamentos.

neste estudo, nós investigamos o mecanismo subjacente os efeitos anti-câncer de 5-FU em carcinoma A549 pulmão. Verificou-se que 5-FU autofagia induzida em células A549 e a inibição da autofagia poderia levar ao aumento da apoptose 5-FU-mediada. Além disso, foi demonstrado que a inibição do mecanismo de autofagia sensibilizados células à morte celular por apoptose foi aumentando a formação de ROS que, eventualmente, facilitou a libertação de citocromo c de mitocôndrias, que subsequentemente aumentada apoptose dependente da caspase.

Materiais e Métodos

cultura celular

as células NSCLC humanas A549 foram obtidos a partir do Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As células foram cultivadas com meio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina) a 37 ° C sob uma atmosfera humidificada de 95 % de ar e 5% de CO

2. As células na fase logarítmica de crescimento foram utilizados neste estudo.

Reagentes e anticorpos químicos

5-FU, 3-MA, 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-diphnyl-2H-tetrazólio (MTT), 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolyl iodeto de carbocianina (JC-1) e 5- (e 6) -carboxi-2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFDA) foram todos comprados em Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Anti-LC3, anti-Beclin1, anti-p62, anti-citocromo C, anti-clivada caspase9, anti-clivada caspase8, anti-clivada anticorpos PARP anti-clivados caspase3 e foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) . O anticorpo anti-actina e os segundos anticorpos foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA).

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano a uma densidade de 1 x 10

4 células /ml com 100 ul por poço, incubou-se durante 24 h e, em seguida, expostas às concentrações indicadas de 5-FU para os tempos indicados . Após o tratamento, a solução de MTT de 20 ul (5 mg /ml) foi adicionado a cada poço e incubados numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C durante 4 h. Os cristais foram então dissolvidos em 100 ul de sulfóxido de dimetilo /poço. A absorvância da solução foi medida a 490 nm com um leitor de placas de microtitulação (Bio-Tek ELX800). A viabilidade celular foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = A490 (amostra) /A490 (controlo) × 100. Pelo menos três repetições foram realizadas para cada tratamento.

Imunofluorescência para LC3

O nível de LC3 foi examinada utilizando um ensaio de imunofluorescência de acordo com nosso relatório anterior [22]. Resumidamente, as células A549 foram semeadas em lamelas de vidro. Após o tratamento com 5-FU (10 uM) durante 48 h na presença ou na ausência de 3-MA (5 mmol /L), as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 min. Após a fixação, as células foram permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 durante 30 min e, em seguida, bloqueadas com BSA a 2% durante 1 h à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as células foram incubadas com anti-LC3 (1:400 diluído em tampão de BSA) de anticorpo, a 4 ° C durante a noite e, em seguida, feito reagir com isotiocianato de fluoresceína (FITC) de IgG de cabra anti-coelho -conjugated (1:100 diluída em tampão de BSA) durante 1 h a 37 ° C. O núcleo foram coradas com 1 umol /L DAPI (Sigma-Aldrich) durante 5 min. Então puncta LC3 e núcleo corado foram detectados sob um microscópio de fluorescência e fundiu (Olympus, Japão).

Detecção de organelas vesiculares ácidas (avos)

Para quantificar o desenvolvimento da AVOS, células A549 foram semeadas em placas de 24 poços de microtitulação de fundo plano a uma densidade de 1 x 10

4 células /ml com 1 ml por poço e incubou-se durante 24 h. Após o tratamento com 10 uM de 5-FU durante 48 h na presença ou na ausência de 3-MA (5 mmol /L), as células foram coradas com laranja de acridina de 1 uM a 37 ° C no escuro durante 15 min, depois foi lavada duas vezes com PBS. Imagens de coloração AO foram visualizados imediatamente, usando microscópio de fluorescência. Para quantificar o número de vesículas ácidas nas células tratadas, outras células foram semeadas em placas de 6 poços. Após a coloração com AO em PBS a 37 ° C durante 15 min, as células foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em 200 ul de PBS, em seguida, analisadas por citometria de fluxo de ensaio. Verde (500-550 nm, canal FL1) e vermelho ( 650 nm, FL3 canal) de fluorescência, a qual foi iluminada com azul (488 nm) da luz de excitação, foi medida utilizando citometria de fluxo com o software de análise CellQuest (Becton Dickinson)

detecção da apoptose por citometria de fluxo

a detecção foi realizada pela detecção de apoptose Kit AnnexinV-FITC (BD Biosciences, San Diego, EUA). Breifly, as células foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24 h e, em seguida, expostas a 10? M de 5-FU durante 48 h na presença ou na ausência de 3-MA (5 mmol /L). Após o tratamento, aproximadamente 1 × 10

6 as células foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS, e depois coradas com anexina V-FITC e PI de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência resultante foi detectada por citometria de fluxo com o software de análise CellQuest.

mitocondrial potencial de membrana (MMP) Análise

Os valores de potencial de membrana mitocondrial foi determinada por citometria de fluxo utilizando coloração de JC-1 de acordo com a as instruções do fabricante. Resumidamente, as células tratadas foram recolhidas, lavadas com PBS, e incubadas com 10 uM JC-1 durante 30 min a 37 ° C no escuro. As células positivas foram então detectadas por citometria de fluxo com o software de análise de CellQuest.

Medição de espécies reactivas de oxigénio (ROS)

níveis de ROS foram determinadas usando o marcador fluorescente 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA). Resumidamente, as células tratadas foram tripsinizadas, lavadas e incubadas com 10 uM DCFH-DA, durante 30 min no escuro, e a intensidade de fluorescência foi seguido por citometria de fluxo com o software de análise CellQuest.

Medição do citocromo C Lançamento

A fração mitocôndria e fracção de citosol foi preparado por centrifugação diferente, Jie Li, MD descrito [3]. Resumidamente, as células tratadas foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS, em seguida, foram novamente suspensas num tampão de sacarose (sacarose 250 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 suplementado com PMSF 1 mM, 1 ug /mL de leupeptina, 1 ug /mL de pepstatina a, 5 ug /mL de aprotinina e DTT 5 mM) em gelo durante 30 min. As células foram homogeneizadas e depois centrifugadas a 1000 g durante 10 min a 4 ° C para remover núcleos e células inteiras. A fracção de mitocôndrias foi então sedimentado por centrifugação a 10000 g durante 20 min a 4 ° C. O sobrenadante foi centrifugado adicionalmente a 100.000 g durante 60 min a 4 ° C para obter a fracção de citosol.

a actividade da caspase ensaio

A actividade de caspases-3 foi medido utilizando disponível comercialmente caspase ensaio colorimétrico kits (Beyotime, China). Resumidamente, após o tratamento com agentes indicados, as células A459 foram colhidas e lavadas com PBS por centrifugação a 600 g durante 5 min a 4 ° C. Os sedimentos de células foram ressuspensos em tampão de lise e deixadas em gelo durante 15 min. Os lisados ​​foram centrifugados a 160.000 g durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante foi recolhido para a caspase 3 ensaio de actividade no tampão de lise contendo Ac-DEVD-pNA de acordo com as instruções dos kits. A concentração do pNA foi medida a 405 nm com um leitor de placas de microtitulação, que utilizado como um indicativo de actividade de caspase 3.

análise Western blot

células A549, incubadas com as respectivas condições, eram colhidas e lisadas. Uma quantidade igual de proteína foi separada por SDS-PAGE (5-15%) e transferidas para membranas de PVDF. As membranas manchadas foram bloqueados com leite desnatado a 5% durante 1 h e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários (diluição desejados 1:1000) durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as bandas imunorreactivas foram visualizadas por quimioluminiscência aumentada utilizando anticorpos secundários IgG conjugados com peroxidase de rábano. Para quantificar o carregamento igual, a membrana foi sondado com anticorpo β-actina.

Exame de autophagosome por TEM

células A549 foram fixados em glutaraldeído a 2,5% a 4 ° C durante a noite, e pós-fixados com 1% OsO

4 durante 1,5 h. Em seguida, as células foram coradas com 70% de etanol saturado com acetato de uranilo, seguido por desidratação com gradiente de etanol-acetona, e, finalmente, embebidas em resina epóxi para secção. Os cortes ultrafinos foram duplamente coradas por acetato de uranilo e citrato de chumbo e analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

RNA de interferência de Atg7

interferência Atg7 RNA foi realizada por transfecção de células A549 com o Atg7- alvo ARNsi e o ARNsi de controlo universal (Invitrogen; 100 pmol /cavidade). Curtas oligo-RNAs foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas de transfecção, as células foram tratadas com 5-FU durante um adicional de 48 h. Em seguida, as células foram recolhidas e os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunotransf erência de Atg7, LC3 e PARP. As células também foram processadas para análise de viabilidade celular e a apoptose.

A análise estatística

Os resultados são expressos como a média ± DP (n≥3). A análise estatística entre os dois grupos foi calculada utilizando o teste t de Student, e vários grupos foram realizadas pelo programa SPSS 10.0.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

5-FU inibe a proliferação celular em células A549

A fim de investigar 5-fluorouracil de inibição do crescimento celular em células A549 potencial, o efeito do tratamento com 5-FU nas células foi examinada com um ensaio MTT. Como mostrado na Fig. 1A, 5-FU (0-200 uM) produziu uma redução dependente da dose e tempo-no crescimento de células A549. O IC50 para 48 h de tratamento com 5-FU em células A549 foi de 10,32 ± 0,69 uM. Com base no resultado, 10 uM de 5-FU durante 48 horas em células A549 foi usado para outras experiências. Além disso, as alterações morfológicas também indicou que o tratamento com 5-FU diminuição da densidade celular. Curiosamente, 5-FU tratadas com células não surgiu personagens apoptóticos muito óbvio, mas muitos vacúolos no citoplasma (Fig. 1B). Isto levou-nos a examinar se o 5-FU autofagia induzida também foi incluída em células de cancro de pulmão.

(A) a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT após tratamento com diferentes concentrações de 5-FU durante 24 h e 48 h . IC50 foi calculada pelo programa de software de IC50. (B) As alterações morfológicas foi observada após tratamento de células com 10 mmol /L 5-FU por 48 h por microscópio invertido (Olympus, Japão). Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

5-FU induz a autofagia em células A549

Posteriormente, microscopia eletrônica de transmissão foi utilizado para verificar a formação de autofagossomas em 5- FU células tratadas. Como mostrado na Figura 2A, o tratamento com 5-FU para 6-48 h causou a acumulação de vacúolos autofágicos, que exibiu autophagosome e /ou autolysosomal características, enquanto que apenas alguns vacúolos foram observados em células de controlo. -específica Autophagy marcadores LC3, beclin-1 e p62, também foram utilizados para examinar os níveis autofágicos e o fluxo autophagic neste processo por análise de imunotransferência. Como mostrado na Fig. 2B, a sobre-regulação de beclin-1, a regulação negativa de p62 e a conversão de LC3 I /II demonstrou aumentar a formação de autofagossomas de uma forma dependente do tempo em células A549.

células A549 foram tratados com 10 pmol /L de 5-FU para horário diferente, tal como indicado, em seguida, os autofagossomas e os níveis autofágicos foram detectados. (A) A formação de autofagossomas em células tratadas foram verificadas por TEM. (B) LC3, beclin-1 e p62 foram analisados ​​por Western blot. β-actina foi um controlo de carga. Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

Em seguida, no fim de demonstrar ainda mais a autofagia induzida por 5-FU, introduzimos 3-MA, o qual é um inibidor popular de autofagia [3 ]. 5 mM de 3-MA foi adicionado a células A549 para a exposição de 1 h antes do 5-FU. As células foram divididas em quatro grupos: controlo (sem tratamento), 3-MA (tratada com 3-MA), 5-FU (tratada com 5-FU), e combinação (tratados com ambos de 5-FU e 3-MA) . citometria de fluxo foi realizada após a coloração das células com laranja de acridina para a quantificação de avos. Os resultados mostraram que o número de vesículas ácidas no grupo 5-FU aumentou obviamente, que foi inibida por 3-MA, confirmando a indução de autofagia (Fig. 3A e C). Resultados semelhantes também foram obtidos no exame microscópico de fluorescência. Como mostrado na Fig. 3B, as células A549 tratadas com 5-FU durante 48 h apresentado um grande número de vesículas fluorescentes no citoplasma, ao passo que apenas algumas das vesículas fluorescentes foram observadas no grupo de controlo, grupo 3-MA e o grupo de combinação. Além disso, também foram realizados LC3 imunofluorescência e imunotransferência. A microscopia de fluorescência revelou a distribuição pontuada de LC3 fluorescência aumentada em 5-FU grupo (Fig. 3D). Western blot indicaram também que a expressão de LC3 no grupo de combinação parcialmente revertida para o estado original, ao mesmo tempo, o que reflecte o efeito da inibição eficaz de 3-MA (Fig. 3E). Estes resultados comprovaram que a autofagia foi induzida em células A549 5-FU-tratados. Por isso, nós decidimos investigar se a inibição da autofagia afecta a sensibilidade de células A549 para o tratamento com 5-FU.

As células foram pré-tratadas com 5 mmol /L de 3-MA durante 1 h antes de exposição a 10 umol /L 5-FU durante 48 h, em seguida, acridina laranja foi utilizado para corar avos, as células activadas por fluorescência foram analisados ​​por citometria de fluxo (a). Após o tratamento, as células foram coradas com laranja de acridina para observação AVO. As células foram visualizados sob um microscópio de fluorescência do filtro vermelho (B). A quantificação de células em desenvolvimento AVO em células A549, a percentagem de avos desenvolvido foi calculada com base nos resultados de células activadas por fluorescência de ensaio (C). microscópio de fluorescência por coloração de imunofluorescência para a LC3 em células A549 tratadas (D). A análise por Western blot foi efectuado para detectar os níveis de proteína LC3. As manchas foram re-provado com anti-β actina como um controlo de carga (E). Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

inibição Autophagy melhora induzida por 5-FU celular por apoptose morte

Em primeiro lugar, examinar se a inibição da autofagia sensibiliza células A549 para morte celular 5-FU-induzida, o efeito do tratamento foi examinada com ensaio de MTT (Fig. 4A). No grupo de combinação, a viabilidade de células A549 diminuíram mais rapidamente do que no grupo 5-FU, o grupo de combinação manada 65,75% das células para a morte, um aumento de cerca de 39,28% em relação ao que no grupo 5-FU. Embora a viabilidade celular no grupo 3-MA também diminuída, na medida em não foi significativa. Estes resultados indicam que a 3-MA aumenta a morte celular induzida por 5-FU em células A549. Em seguida, para validar a observação de que a inibição da autofagia afecta a sensibilidade das células a 5-FU, anexina V-FITC e PI coloração foi realizada. Análise de fluxo de citometria mostrou que o número de células AV- e AV /PI-positivas aumentou significativamente no grupo de tratamento combinado de 5-FU único grupo de tratamento (Fig. 4B). Para confirmar ainda mais este, os executores, caspase-8, caspase-9, caspase-3 e PARP foram então examinados. Em 5-tratadas-FU grupos, todos eles foram clivados nas suas formas activas específicas, e a actividade nas células tratadas com 5-FU com autofagia inibido era significativamente maior do que nas células tratadas apenas com 5-FU (Fig. 4C).

As células foram pré-tratadas com 5 mmol /L de 3-MA durante 1 h antes de exposição a 10 umol /L de 5-FU durante 48 h. (A) A viabilidade celular foi medida com um ensaio MTT. Os dados representam as médias de quatro experiências independentes. (B) taxa de morte celular foi analisada pelo ensaio de Anexina V por citometria de fluxo, tal como descrito nos Materiais e Métodos. (C) Os lisados ​​celulares foram preparados e sujeitos a imunotransf erência com anticorpos anti-caspase-9, caspase-8, caspase-3, PARP, e β-actina. Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

O papel da autofagia na citotoxicidade de 5-FU-mediada foi ainda estudada por derrubando a expressão Atg7 usando siRNA. Como mostrado na Fig. 5, a expressão de Atg7 foi marcadamente suprimida em células A549 transfectadas com ARNsi Atg7 mas não aqueles com ARNsi de controlo (Fig. 5A). Por conseguinte, as células transfectadas com ARNsi Atg7 mostraram uma redução do nível de acumulação LC3-II e aumento do nível de clPARP após o tratamento com 5-FU (Fig. 5A). Além disso, o efeito citotóxico de 5-FU aumentou significativamente bloqueando a expressão Atg7 e o inibidor pancaspase z-VAD-fmk resgatados da morte celular (Fig. 5B). Da mesma forma, o grau de apoptose induzida por 5-FU foi também melhorada quando derrubar a expressão Atg7 e z-VAD-fmk reduziu significativamente a apoptose de células (Fig. 5C). Conforme resumido na Fig. 5, knockdown de Atg7 também acelerar a apoptose induzida por 5-FU. Estes resultados eram consistentes com a utilização de 3-MA, o que demonstra que a autofagia induzida por 5-FU desempenha um papel de protecção das células contra a apoptose de tumor, e o bloqueio de autofagia subsequentemente reforçada a apoptose através da activação de caspases em células A549.

as células foram transfectadas com ARNsi-alvo Atg7 e o ARNsi de controlo, durante 24 h antes de exposição a 10 mmol /L de 5-FU durante 48 h. (A) Os lisados ​​celulares foram preparados e sujeitos a imunotransf erência com anticorpos contra a LC3, Atg7, PARP, e b-actina. viabilidade (B) celular foi medida utilizando um ensaio MTT. morte celular (C) apoptótica foi analisada pelo ensaio de anexina V /PI. Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

Alterações de mitocondrial potencial de membrana e libertação do citocromo c das mitocôndrias

Estudos anteriores mostraram que a ativação de caspases foi impulsionado por cit -c através de via intrínseca mitocondrial apoptose [23], [24]. Portanto, o impacto de inibido autofagia na libertação de 5-FU-mediada de citocromo-c das mitocôndrias em citosol foi investigada utilizando fraccionamento celular. Os resultados obtidos revelaram que a inibição da autofagia em 5-FU-tratados células levaram a um aumento drástico na acumulação de citocromo C no citosol (Fig. 6A). O efeito sobre mitocôndrias também foi confirmada por uma queda no potencial de membrana mitocondrial. Como mostrado na Fig. 6B, a inibição da autofagia em 5-FU-tratados células induzida uma redução óbvia do potencial de membrana mitocondrial. Estes dados sugerem que a perda de potencial de membrana mitocondrial pode ser necessário para o 5-FU combinados 3-MA-induziu libertação de citocromo c em citosol, que depois provocou a activação e clivagem de caspases e resultou apoptose celular.

Células eram tratados como na Fig. 3. (A) As mitocôndrias e as fracções de citosol foram isolados como descrito nos Materiais e métodos, e em seguida foram submetidos a imunomancha para a detecção de citocromo c. (B) A mudança de MMP foi avaliada por coloração de JC-1 por citometria de fluxo, tal como descrito nos Materiais e Métodos. Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

A inibição da autofagia estimula a formação de ROS, que é necessária para a apoptose 5-FU-mediada em células A549

Recentemente, vários relatórios forneceram evidências para o envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ROS) na indução de autofagia e apoptose e demonstrou a importância de ROS na libertação de citocromo-c a partir da mitocôndria [25], [26]. Portanto, decidimos analisar se a inibição da autofagia poderia estimular a geração de ROS em células A549 5-FU-tratados. As células tratadas foram coradas com clorometil-2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (CM-H2-DCFDA), um corante fluorescente permeável célula que reage a um amplo espectro de ROS. Como mostrado na Figura 7A, os níveis de ROS foram aumentadas, obviamente, em que as células tratadas com 5-FU combinado com 3-MA em comparação com 5-FU sozinho por citometria de fluxo, e este aumento foi atenuado eficientemente quando as células foram pré-tratadas com 10 mM de N- acetilcisteína (NAC) durante 1 h. Uma vez que o nível de ROS foi elevada em células com autofagia suprimido, foram analisados ​​adicionalmente se a inibição da morte celular ROS influenciada 5-FU-mediada. Para este efeito, a formação de ROS foi inibido por NAC e a apoptose foi medida por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 7B, a sensibilização de células à apoptose celular induzida por 5-FU foi completamente bloqueados, prevenindo a formação de ROS. Finalmente, foi investigado se a inibição de ROS influenciou a actividade da caspase e a libertação de citocromo-c. Com efeito, a limpeza de ROS inibiu a actividade da caspase-3, impedida a libertação de citocromo-c das mitocôndrias, e resgatado a partir de células A549 apoptose 5-FU-mediada (Fig. 7C e D). Estes resultados indicam claramente que a geração de ROS desempenha um papel importante na regulação da morte celular em resposta a 5-FU.

As células foram pré-tratados com NAC 10 mM durante 1 h antes de 10 umol /L de 5-FU ( 48 h) tratamento na presença ou na ausência de 3-MA. (A) A geração de ROS foi detectada utilizando DCFDA por um citómetro de fluxo. Os dados foram processados ​​com o software CellQuest e analisados ​​por densitometria. morte (B) celular foi medida por coloração de anexina V /PI. ensaio de actividade de (C) da caspase-3 foi realizada tal como descrito nos Materiais e Métodos. (D) O nível de cit-c na fracção de citosol foi detectada por imunotransferência. Todos os dados são representativos de pelo menos três experiências independentes.

Discussão

No cancro do pulmão, a quimioterapia é amplamente utilizado para curar e prolongar a sobrevivência pós-operatória nos pacientes. 5-fluorouracilo (5-FU) é efectivamente utilizada como um medicamento no tratamento de uma variedade de cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão. O principal mecanismo subjacente à sua actividade anti-tumoral tem sido atribuída à interferência de ADN e síntese de ARN. Nas últimas décadas, a indução de apoptose por 5-FU tem sido a consideração importante na terapia do cancro [27] – [29]. Recentemente, tem sido extensivamente autofagia observada no tratamento com 5-FU [3], [7], [30] – [32]. No nosso estudo, verificou-se que 5-FU pode inibir a proliferação de células A549, obviamente, (Fig. 1A), que incluiu autofagia celular e a morte celular por apoptose (Fig. 2,3,4 e 5). Os nossos resultados também mostraram que tanto a LC3-II e Beclin1, que foram considerados o marcador de autofagia [33], foi aumentada de forma significativa após o tratamento com 5-FU em células A549 acompanhada por sub-regulação da expressão de p62 (Fig. 2B). Enquanto isso, o aumento da formação de autofagossomas e /ou autolysosomal com o tempo detectado por MET (Fig. 2A) e o aumento da formação de avos característica em citoplasmática fornecida outra evidência dois (Fig. 3A-C). Todos estes resultados indicaram que a autofagia foi induzida por 5-FU.

Autophagy é um sistema de degradação em massa que intracelular ubíqua é encontrada em eucariotas, que é responsável pela degradação da maior parte das proteínas de longa duração e alguns organelos. constituintes citoplasmáticos, incluindo organelas, são sequestradas em autofagossomas dupla membranados e depois se fundem com os lisossomos para formar autolysosomes onde os seus conteúdos são degradados. Os produtos degradados são reciclados para o citoplasma para reutilização [34]. A autofagia é estimulada em resposta a estressores externos e necessidades internas para manter o metabolismo celular, bem como a sobrevivência. No entanto, a autofagia pode também resultar em morte celular chamado de “morte celular autofágica” (Programmed Cell Death Tipo II) através da auto-digestão excessiva e degradação de componentes celulares essenciais em determinadas circunstâncias [18], [35]. Recentemente, um corpo crescente de provas indica o papel de autofagia na propagação do cancro e, em resposta à terapia. No entanto, na quimioterapia do cancro, autofagia parece desempenhar um papel em conflito, provavelmente promover ou inibir a apoptose, na sobrevivência de células de cancro e morte [9]. A fim de investigar a contribuição de autofagia no processo de apoptose de células A549 induzida por 5-FU, foi utilizado inibidor autofagia 3-MA, um inibidor específico do processo autophagic na fase inicial, no presente estudo. Como esperado, 3-MA-autofagia inibida induzida por 5-FU (Fig. 3). Autophagy inibição aumentada de apoptose celular induzida por 5-FU, através da activação de caspases em células A549 (Fig. 4). Para esclarecer melhor o papel da autofagia na morte celular A549 induzida por 5-FU, usamos Atg7 siRNA para derrubar Atg7 e avaliado o papel da autofagia mais diretamente. Consistente com os resultados utilizando 3-MA, a transfecção de Atg7 siARN que inibia eficazmente a acumulação LC3-II, o aumento da produção clPARP e reforçada a morte celular por apoptose induzida por 5-FU em células A549 (Fig. 5). 6 e fig.