Abstract

Fundo

O estrogênio (E2) e progesterona (P4) são actores fundamentais na maturação do endométrio humano. Os moduladores de hormonas esteróides correspondentes, o tamoxifeno (TAM) e mifepristone (RU486) são amplamente utilizados na terapia do cancro da mama e para fins de contracepção, respectivamente.

Metodologia /Principais descobertas

perfil da expressão gênica a linha celular de cancro do endométrio humano de Ishikawa tratados com E2 e P4 durante 3 h e 12 h, e TAM e RU486 durante 12 h, foi realizado utilizando ARN-sequenciação. Altos níveis de mRNA foram detectados por genes, incluindo

PSAP, ATP5G2, ATP5H

, e

GNB2L1

após o tratamento E2 ou P4. Um total de 82 marcadores para biologia endometrial foram identificados entre os genes induzidos E2, e 93 entre os genes responsivos P4. biomarcadores identificados foram:

EZH2, MDK, MUC1, Slit2,

e

IL6ST

, que são genes previamente associados com a receptividade endometrial. Além disso, 98,8% e 98,6% de E2 e P4 genes responsivos em células de Ishikawa, respectivamente, foram também detectados em duas amostras de biópsia do endométrio secretor mid-humanos. tratamento TAM exibiu efeitos antagonistas tanto agonistas e de E2 e também regulado um subconjunto de genes de forma independente. A ciclina regulador do ciclo celular D1 (

CCND1

) mostrou significativo aumento da regulação após o tratamento com a TAM. RU486 não parecem actuar como um antagonista puro de P4 e uma análise funcional de genes RU486 resposta identificados relacionados com a adesão e a apoptose, incluindo genes regulados negativamente associados com os contactos célula-célula e adesão como

CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1,

e

COL2A1.

Conclusões

as mudanças significativas na expressão gênica pela linha celular Ishikawa foram detectados após tratamentos com E2, P4, TAM e RU486 . Estes dados de transcriptoma fornecer informações valiosas sobre potenciais biomarcadores relacionados com a receptividade endometrial, e também facilitar o entendimento das alterações moleculares que ocorrem no endométrio nas fases iniciais do tratamento do câncer de mama e uso de contracepção

Citation:. Tamm -Rosenstein K, J Simm, Suhorutshenko M, Salumets a, Metsis M (2013) Mudanças do transcriptoma da linha de células do endométrio humano Cancer Ishikawa induzida por estrogênio, progesterona, Tamoxifen, e Mifepristone (RU486) como detectado por RNA-Sequencing. PLoS ONE 8 (7): e68907. doi: 10.1371 /journal.pone.0068907

editor: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2013; Aceito: 07 de junho de 2013; Publicação: 16 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tamm-Rosenstein et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho tem sido apoiada pela Universidade de Tecnologia de Tallinn (. alvejado projeto não B611), estoniano Ministério da Educação e Ciência (Targeted projeto não SF0180044s09.) e Enterprise Estonia (Grant não EU30020.)

Conflito de interesses:. o os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

a e progesterona hormônios esteróides ovarianos, estrogênio (E2) (P4), desempenham um papel crucial na regulação das funções normais do endométrio humano. Por exemplo, durante um ciclo menstrual normal de, proliferação, diferenciação, e degeneração do endométrio ocorre em resposta a diferentes níveis de E2 e P4. Na fase proliferativa, E2 estimula a proliferação de células epiteliais e do estroma componentes do endométrio. Na fase secretora, P4 modula diferenciação glandular e uma inibição da proliferação mediada por estrogénio [1]. É durante a fase mid-secretora que o endométrio atinge um fenótipo compatível com a implantação do embrião bem sucedido.

Uma melhor compreensão da biologia e funcionamento do endométrio humano é vital para melhorar o nosso conhecimento sobre a infertilidade feminina, e por a concepção de tratamentos para estas condições. Correspondentemente, uma busca por marcadores da receptividade endometrial e novas abordagens para melhorar as taxas de implantação durante tratamentos de infertilidade têm sido conduzidos. Nos últimos anos, numerosos estudos que envolvem a análise de expressão de microarray identificou uma vasta gama de genes para cima ou para baixo-regulado no endométrio humano durante o tempo de implantação do embrião [2] – [10]. Cada estudo identificou vários genes candidatos que se acredita ser fundamental para o processo de implantação do embrião. No entanto, alguns genes foram consistentemente relatados.

As atividades genômicos de E2 e P4 são mediadas principalmente por receptores nucleares. Quando E2 ou P4 estão ligados aos seus receptores, eles podem ligar-se elementos de resposta no ADN com elevada afinidade e regulam a transcrição de genes alvo. Nos seres humanos, existem dois tipos de receptores de estrogénio, RctE e RpE, e estes são codificadas por genes distintos [11], [12]. RctE e RpE é expresso em todos os tipos de células endometriais ao longo de todo o ciclo menstrual, e submeter-se as alterações na expressão e actividade. Por exemplo, RctE e RpE são expressos em níveis mais elevados durante a fase proliferativa, ainda exibem a actividade mais baixa durante a fase de secreção quando eles estão sujeitos aos efeitos supressivos de P4. É após a fase proliferativa que P4 medeia priming baseado em E2 do endométrio para um estado de receptividade.

Em contraste com ERa e ERP, os receptores de progesterona (RP), PRA e PRB, são codificados pelo mesmo gene (

PGR

), ainda são transcritos a partir de diferentes promotores. Como resultado, PROBLEMA inclui um amino ácidos 164 adicionais na sua extremidade N-terminal [13], [14]. Ambas as isoformas são expressas no estroma e epitélio do endométrio durante a fase proliferativa. No entanto, a expressão de ambos os receptores diminui acentuadamente no epitélio durante o início e meados de secretora fase [15]. receptividade endometrial parece estar fortemente associada com a sub-regulação de RP epiteliais, enquanto que o estroma só mantém expressão de PRA durante a fase secretora [16]. A expressão de genes PR no epitélio glandular do endométrio é controlado por E2 e P4, com E2 induzir a síntese de PR e P4 para baixo-regulação da expressão do seu próprio receptor [1].

moduladores selectivos de ER (SERMs) têm a capacidade para interagir com ERs como agonistas ou antagonistas, dependendo do tecido alvo e para modular as vias de transdução de sinal dos genes E2-responsivas [17]. Por exemplo, o tamoxifeno (TAM) liga-se com elevada afinidade a ERs, bloqueando, assim, a acção de E2 nativo. Devido à sua actividade antagonista de E2, a TAM tem sido amplamente usado na terapia do cancro da mama. No entanto, um dos efeitos colaterais mais incômodos de tratamentos contra o cancro da mama com TAM parece ser o seu efeito proliferativo no endométrio [18], [19]. Por exemplo, patologias do endométrio, associados com os tratamentos TAM incluem hiperplasia, pólipos, carcinomas, sarcomas e [20]. Semelhante a SERMs, moduladores selectivos do receptor da progesterona (SPRMs) foram desenvolvidos processos para antagonizar activados por P4. A mifepristona (RU486) é um antagonista P4 P4 que compete com a ligação ao receptor endógeno para [21] e é usado para terminar uma gravidez precoce. RU486 também exibe um vezes de 2 para 10 maior afinidade para PRs em comparação com P4 [22].

A base exata para o diferencial, a sinalização específica de tecido de E2 e P4 ainda não é totalmente compreendido, e uma melhor compreensão das acções de E2 e P4 é necessário para avaliar o seu papel na regulação da expressão do gene do endométrio. Neste estudo, a linha celular de cancro epitelial derivada-uterino humano, Ishikawa, foi usado. É uma das linhas de células do endométrio humano mais bem caracterizados actualmente disponíveis. As células Ishikawa foram derivadas de um adenocarcinoma bem diferenciado do epitélio do endométrio humano que expressa receptores de esteróides funcionais de E2 e P4 [23] – [25]. Como resultado, estas linhas de células representa um modelo ideal para o estudo da resposta do epitélio do endométrio para E2 e P4. Neste estudo, de alto rendimento de sequenciação de ARN (ARN-SEQ) foi aplicado a estudos de E2- e dependente transcriptomes-P4 em um contexto do endométrio. Os moduladores do receptor de hormonas esteróides, a TAM e RU486, também foram utilizados para estudar transdução de sinal dependente do receptor, e para avaliar a actividade agonista ou antagonista na linha celular Ishikawa. Finalmente, o E2- significativa e genes P4-dependentes identificado na linha celular Ishikawa foram ensaiados em amostras de biópsias endometriais recolhidas na fase mid-secretora receptivo.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

A linha celular Ishikawa foi fornecida pelo Prof. Anneli Stavreus-Evers (Universidade de Uppsala, Suécia). As células foram cultivadas em meio DMEM (PAA, Pasching, Austria), suplementado com soro fetal bovino a 5% (FBS; PAA) e 1% de penicilina /estreptomicina (PAA), a 37 ° C e 5% de CO

2. Para tratamentos hormonais, E2 (β-estradiol) ou P4 (4-pregneno-3,20-diona) foram adicionados ao meio de cultura a uma concentração final de 10

-8 M. Os moduladores de hormonas esteróides, o tamoxifeno (TAM , 4-hidroxitamoxifeno) e mifepristona (RU486), foram adicionados aos meios de cultura a uma concentração final de 1 uM. Todas as hormonas e moduladores foram encomendados a partir da Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Alemanha), com E2 e P4 dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e TAM e RU486 em etanol (EtOH). As amostras de controlo foram tratados apenas com veículo. Para culturas com suplementos hormonais, revestido com dextrano, FBS e meios de comunicação, sem vermelho de fenol foram utilizados 48 h antes de experimentos para evitar uma possível atividade hormonal-like de fenol vermelho tratado com carvão vegetal.

RNA Extração

O ARN total foi extraído a partir de células não tratadas e células após 3 h e 12 h de tratamento com a hormona utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, EUA). As biópsias do endométrio foram coletadas de dois pacientes (idades, 34 e 38 anos) com infertilidade inexplicada tratados no Vita Clinic Nova. As biópsias foram coletadas nos dias LH + 7 a LH + 9 de acordo com testes de ovulação de urina. As amostras de tecido foram homogeneizadas com Lyzer Tecidual (Qiagen) e o RNA total foi extraído a partir de (3,7%) biópsias endometriais previamente fixadas em formalina, utilizando um kit RNeasy FFPE (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O estudo foi realizado em conformidade com os padrões éticos locais e foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Tartu, com o consentimento escrito obtido a partir de ambos os participantes do estudo.

RNA Biblioteca Preparação

bibliotecas de ARN para a linha de células e as amostras endometriais foram preparados utilizando um Kit Ilumina TruSeq ARN Amostra Prep (FC-122-1001, Illumina, San Diego, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para as amostras de linha de células, o ARNm foi purificado utilizando selecção poliA, e foi, subsequentemente, fragmentadas quimicamente. Para amostras de tecido, o ARN total foi recolhido sem selecção poliA e o passo de fragmentação foi encurtado com base no tratamento com formalina prévia das amostras. Em todas as amostras, RNAs foram convertidos em ADNc de cadeia simples usando escorva hexâmero aleatório. Multiplexing com diferentes índices de adaptador foi realizada ea qualidade da biblioteca resultante foi verificado usando um Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemanha).

RNA-Seq e Análise de Dados

Single-end (SE ) sequenciação de 75 pb foi realizada utilizando um Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, EUA). programação gravata borboleta foi usado para fornecer um alinhamento inicial de sequências de genoma humano 19 (Hg19), com configurações padrão usado para localizar correspondências única perfeitos. fragmentos sequenciados foram alinhadas ao

H. Sapiens

genoma de referência (Hg19) fornecido pela Universidade da Califórnia em Santa Cruz (UCSC) navegador Genoma usando um algoritmo TopHat v1.2.0 com as configurações padrão [26]. O alinhados leituras foram posteriormente transformados em transcrições usando abotoaduras v1.1.0 [27], com abundâncias estimadas e analisados ​​para examinar os padrões de expressão diferencial entre as amostras de linha celular. Abotoaduras construído um conjunto mínimo de transcrições para melhor descrever o lê no conjunto de dados. A correcção Benjamin-Hochberg para múltiplos testes foi aplicada aos valores de P de genes significativas com um valor de taxa de detecção falsa (FDR) de 0,05. foram utilizadas as contagens de fragmentos de RNA-Seq normalizados indicando a abundância relativa das transcrições. Abundâncias foram comunicados em unidades de FPKM (por exemplo, fragmentos por quilobases de transcrição por milhão de fragmentos mapeados). Os arquivos de abotoaduras de saída foram analisadas com Cuffcompare juntamente com a referência da Tabela navegador UCSC (Homo sapiens GRCh37 /Hg19) [28]. Cuffcompare classifica cada transcrito como conhecido ou novo. Cuffdiff re-estimativas da abundância de transcrições listados por Cuffcompare e ensaios para expressão diferencial entre as experiências selecionadas. Se uma das experiências (tanto de controlo ou de tratamento) teve 0 FPKM, tornou-se a alteração de registo de infinito. Nós expressa a mudança de registo, nestes casos, como +14 para up-regulação e -14 para baixo-regulação.

Análise Funcional

Para a classificação funcional de genes que exibiram perfis de expressão diferencial significativas em foi usada resposta aos diferentes hormônios esteróides e seus tratamentos analógicos, Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 9,0 software (Ingenuity Systems). O módulo de fator de transcrição IPA foi utilizado para prever as mudanças de expressão de genes detectados em relação a possíveis ligações de ERs e PRs. Além disso, o IPA filtros de análise de biomarcadores identificados potenciais biomarcadores em tecidos selecionados.

Data Visualization

Estatísticas de I software (versão 2.14.0) (https://www.R-project.org/) foi usado para processar e visualizar os resultados de análises de botão de punho. Cálculo das estatísticas gerais, incluindo contagens comuns e únicas de genes significativamente afetados, foram realizados em R usando um script personalizado. Para visualizações HeatMap, foram utilizados os gplots pacote R (versão 2.10.1) (https://CRAN.R-project.org/package=gplots). Além disso, as diferenças em valores de FPKM as amostras tratadas em comparação com as amostras não tratadas foram calculados na mapas térmicos. A maior diferença FPKM absoluta para cada gene foi identificado, e foi usado para normalizar os dados FPKM para cada gene. Assim, os valores resultantes encontram-se entre -1 e 1 e um valor de 0 corresponde a uma ausência de mudança em comparação com a amostra não tratada. Com base nestes valores de expressão normalizados, os genes foram posicionados no heatmap por agrupamento hierárquico.

Resultados

O transcriptoma da linha celular Ishikawa antes e após tratamento com E2, P4, e moduladores respectivos

poliA-ARN seleccionado a partir da linha de células do endométrio humano, Ishikawa, foi submetido a sE-sequenciação com 75 pares de bases de comprimento lê. medições de referência para cada amostra foram então feitas com base na 8-11 × 10

6 lê-se que foram obtidos. O objectivo deste esforço sequenciação foi proporcionar um perfil global de expressão do gene da linha celular Ishikawa, a fim de identificar as alterações na expressão de genes que ocorrem durante a resposta precoce desta linha de células para hormonas esteróides e os seus moduladores. No total, foram analisadas sete amostras, e estas incluíram células não tratadas, células tratadas com E2 ou P4 durante 3 e 12 horas, e as células tratadas com TAM ou RU486 moduladores durante 12 h. A maioria das leituras de cada amostra (por exemplo, 70%) foram alinhados com êxito para o genoma humano versão 19 (Hg19). Os valores estatísticos destes alinhamentos e o número de genes identificados, incluindo ambos os genes conhecidos e desconhecidos, estão listados na Tabela 1. As abundâncias relativas dos fragmentos foram calculados utilizando botões de punho, e foram apresentados em unidades de FPKMs, a fim de descrever os genes expressos (por exemplo, , fragmentos) observada a partir de experiências de RNA-Seq. Na Tabela 1, o número de genes com diferentes abundâncias FPKM, bem como o número de genes que exibiram alterações significativas na expressão a seguir ao tratamento hormonal /modulador, foram comparados com as células não tratadas. Além disso, os genes mais responsivos identificados a partir da linha celular Ishikawa foram comparadas com amostras de biópsias do endométrio humano (n = 2) recolhidas durante o tempo de implantação do embrião. Uma lista completa dos genes expressos identificados e os seus valores FPKM estão disponíveis na Tabela S1.

Uma das vantagens de uma análise de RNA-Seq é a capacidade para detectar os níveis de expressão relativamente elevados de genes. Um subconjunto de genes da linha celular Ishikawa tinham valores FPKM que eram maiores do que 1000 após tratamentos hormonais /moduladores (Tabela 2). Estes genes que codificam incluídos prosaposina (

PSAP

), ATP sintase,

ATP5G2

e

ATP5H

e proteína de ligação ao nucleótido guanina (

GNB2L1

). Estes genes foram muito altamente expressa em resposta a E2 ou P4 tratamento. As expressões de

ATP5G2

,

ATP5H

e

GNB2L1

não demonstraram estar relacionado com endométrio antes. Alternativamente, os genes que codificam as proteínas S100 ligação A2 cálcio (

S100A2

) e A6 (

S100A6

), proteína de choque térmico de 90 kDa alfa (

HSP90AA1

) e HSPA8, bem como de piruvato-quinase no músculo (

PKM2

), exibiram elevados níveis de expressão de 12 horas após o tratamento com a TAM. Entre estes genes apenas a expressão de

S100A2

tem sido relacionada ao tratamento TAM no tecido do cancro da mama, mas não no endométrio [29]. Além disso, o gene para o polipéptido luz ferritina (

FTL

), também não foi detectado no endométrio, em estudos anteriores, verificou-se ser altamente expressa 12 h depois do tratamento com E2, P4, e TAM (Tabela 2).

Alterações Gene expressão significativa na linha celular Ishikawa Depois de E2 e P4 Tratamentos

os níveis de expressão de mRNA relativa (em unidades de FPKM) para E2- e células tratadas com P4 foram comparados com células não tratadas usando software Cuffdiff (versão 1.1.0) e um FDR 5%. O número de genes que exibiram alterações significativas na expressão após respectivos tratamentos estão listados na Tabela 1. Além disso, os genes conhecidos apenas foram incluídos nas análises subsequentes de dados de expressão de gene.

Um total de 1691 genes conhecidos (Tabela S2 ) foram encontrados para ser significativamente afectada em células de Ishikawa seguintes tratamentos com E2 durante 3 h (n = 1084) e 12 h (n = 1121) em comparação com células não tratadas. Desses genes, 614 foram significativamente regulada para cima, e 470 foram significativamente regulada para baixo após 3 h de tratamento E2. Quando o tratamento com E2 foi estendido para 12 h, indução de 715 genes, e supressão de 406 genes, foi detectado.

Na maioria dos genes 12 h tratamento TAM apresentou atividade antagonista da E2. Doze horas de tratamento com a TAM resultou em níveis baixos ou não detectáveis ​​de mRNA de 654 (91,5%) dos 715 genes de genes que exibiram os níveis mais elevados de ARNm após o tratamento com E2 durante 12 h. Um adicional de 406 genes foram encontrados para ser regulada negativamente após o tratamento com E2 durante 12 h, e 75,1% (n = 305) destes genes exibiram apenas pequenas alterações na actividade do gene, ou foram associados a uma ausência de regulação, 12 h depois tratamento com TAM.

com base nos dados obtidos, a TAM não agiu como um antagonista puro da E2 na linha celular Ishikawa. Por exemplo, dos 715 genes sobre-reguladas após o tratamento com E2 durante 12 h, 61 (8,5%) foram também significativamente regulada para cima a seguir ao tratamento com a TAM. Além disso, entre os 406 genes que se verificou serem regulados negativamente após o tratamento com E2 durante 12 h, 101 (24,9%) foram igualmente regulado negativamente após o tratamento com a TAM. Em conjunto, estes dados demonstram que a TAM é ao mesmo tempo antagonista e agonista para E2 na linha celular Ishikawa (Figura S1).

A seguir ao tratamento com P4, um total de 1692 genes conhecidos exibiu diferenças significativas na expressão (Tabela S3 ). Destes genes, 1082 exibiu alterações após 3 h de tratamento, e 1097 foram detectados após 12 h de tratamento, tanto em comparação com células não tratadas de Ishikawa. Destes genes, 592 (54,7%) foram significativamente regulada para cima, e 490 (45,3%) foram regulados negativamente 3 h após o tratamento com P4, enquanto que 631 (57,5%) foram supra-regulados e 466 (42,5%) foram baixo -regulated 12 h após o tratamento com P4.

Quando as células Ishikawa foram tratados com RU486 durante 12 h, níveis baixos ou não detectáveis ​​de mRNA foram detectados para 84,0% (n = 530) de genes que foram significativamente sobre-regulada a seguir ao tratamento com P4 durante 12 h (n = 631). Outro 466 genes foram encontrados para ser regulada negativamente após o tratamento com P4 durante 12 h, e, destes, 88,2% (n = 411) exibiu menor regulação negativa, ou não mostrou qualquer regulação, após o tratamento com RU486 durante 12 h.

dos 631 genes que foram sobre-reguladas em resposta a 12 h de tratamento P4, 101 (16,0%) destes genes foram também significativamente regulada para cima após o tratamento com RU486. Alternativamente, dos 466 genes regulada para baixo em resposta ao tratamento com P4 durante 12 h, 55 (11,8%) apresentaram uma diminuição da regulação semelhante a seguir ao tratamento com RU486. Além disso, semelhante a TAM, RU486 exibiu tanto a atividade agonista e antagonista de P4 em células de Ishikawa (Figura S2).

Dos 1691 genes significativamente respondem a E2, e os 1692 genes significativamente respondem a P4, 1051 eram comuns para ambos os grupos, sugerindo que eles são regulados por ambos os hormônios. maioria relativa dos genes identificados com mudanças significativas no pós E2 e P4 tratamento, não foram mencionados no contexto endometrial antes.

Potenciais ER e PR Metas Entre os genes E2 e P4 significativos identificados

Um a análise de IPA genes encontrados para ser responsivo a E2 revelou 20 genes alvo potencial para o receptor de E2, ERa (

ESR1

), com base em uma base de dados de interacções receptor observados experimentalmente. Por exemplo,

ABCA3, CELSR2, CYP1A1, DDX17, EFEMP1, ENO1, FOSL2, GREB1, KCNK6, MAPK12, MYC, PDCD4, PGR, SHANK3, TGFA,

e

TPM1

foram significativamente up -regulated após o tratamento com E2 durante 12 h. Por outro lado,

CCNG2, KCTD6, LDLR,

e

PRLR

foram regulados negativamente. Destes produtos de genes, PGR e MAPK12 participar na sinalização do receptor glucocorticóide, enquanto MYC e CYP1A1 estão envolvidas no receptor de hidrocarboneto aromático (AHR) de sinalização (Figura S3).

Depois de 12 h de tratamento com P4, expressão de

CDKN1C, F3, FKBP5, Gas6, IL1R1, NQO2, PFKP, TSC22D3

e

PGR

foram encontrados para ser regulada para cima, enquanto o

EZR

,

ACSL1, AKAP13, CCNB2, GLUL, MYCN, PPIF,

e

SNTB2

foram encontrados para ser regulada para baixo. Destes, CDKN1C, FKBP5 e PGR contribuir para a sinalização do receptor glucocorticóide, enquanto ACSL1 e PFKP têm papéis na gliconeogênese (Figura S4).

Análise de Biomarcadores de E2 e P4 significativas Genes do celular Linha Ishikawa

Em seguida, potenciais biomarcadores entre o E2 (n = 1691) e P4 (n = 1.692) genes responsivos foram examinados. Somente moléculas detectados anteriormente no endométrio humano foram considerados para a análise IPA biomarcador realizada, e as moléculas foram posteriormente filtrada para incluir aqueles relacionados a doenças do sistema reprodutivo ou distúrbios do sistema endócrino.

análise IPA biomarcador identificado 82 potenciais biomarcadores entre E2 genes significativos e 93 biomarcadores potenciais significativas entre os genes P4. Havia 62 potenciais moléculas de biomarcadores comuns a ambos os grupos. Uma lista completa de biomarcadores expressos no útero humano é comparado com biomarcadores identificados em células de Ishikawa 3 h e 12 h após a E2, P4, e respectivos moduladores tratamentos (Tabela S4). Selecção de E2 e P4 única biomarcadores dependentes que têm sido relacionados com a receptividade endometrial e a implantação do embrião estão listados na Tabela 3. No que diz respeito ao anterior, estes incluíram os seguintes genes relacionados com a implantação do embrião e endométrio:

MUC1, EZH2, HMGCR, MDK, PRDM2, PXN,

e

Slit2

(Tabela 3). Para genes comuns aos dois genes responsivos E2 e P4, foram identificadas potenciais biomarcadores que estavam relacionados com a receptividade endometrial ou endometriose, e estas incluem:

ARG2, ANXA1, AR, BMPR2, CDKN1C, CXCL16, EGFR, FGFR1, HMGA1, IGFR2 , IL1R1, JAG1, deixe-7, MCAM, NCOA3, NOTCH1, PDCD4, PGR, RACGAP1, TMSB10,

e

TNC

(Tabela S4).

Da mesma forma, entre os genes responsivos P4, foram identificadas potenciais biomarcadores que estavam relacionados com o desenvolvimento do endométrio ou gravidez precoce:

CTNNA1, ErbB3, FGFR2, IGFBP5, IKBKB, IL6ST, KCNMA1, NOTCH3, S100A4, STAT3, TCF7L2, TGFB1,

e

TGFBR3

(Tabela 3).

uma comparação das significativa E2 e P4 genes responsivos identificado na linha celular Ishikawa com um Humano endometrial transcriptoma

Para prever se os genes responsivos E2 e P4 identificados em células Ishikawa foram também expressas num endométrio humano, e /ou têm um papel no processo de implantação de embriões, a expressão destes genes foram testadas em duas amostras de tecidos endometriais humanos recolhidos de endométrio mid-secretora. De acordo com os dados de RNA-Seq, 1671 (98,8%) dos genes responsivos a E2, e 1668 (98,6%) dos genes responsivos a P4, identificados na linha celular Ishikawa também foram encontrados para ser expresso em amostras de endométrio humanos obtidos a partir de dois pacientes que foram submetidos biópsia do endométrio. Estas amostras de endométrio humanos foram utilizados apenas para fins comparativos. Na Tabela 1, as abundâncias Expressional (por exemplo, FPKMs) de E2 e P4 biomarcadores detectados em amostras de biópsias endometriais humanas são comparadas com as células de Ishikawa não-tratados. Entre os IPA-identificados biomarcadores E2 e P4 presentes nas células de Ishikawa,

EZH2, MDK, MUC1, Slit2,

e

IL6ST

também foram encontrados para estar presente em transcriptomes endometriais humanas (Figura 1) .

vermelhas genes regulados positivamente em E2 e P4 tratadas células de Ishikawa em comparação com células não-tratadas; genes verdes regulada para baixo. Os genes situados no lado esquerdo da linha diagonal mostram maior abundância relativa (FPKM) na amostra de biópsia do endométrio humano em comparação com células não tratadas de Ishikawa. Genes situados no lado direito da linha diagonal mostram menor abundância relativa (FPKM) na amostra de biópsia de endométrio humano em comparação com células não tratadas de Ishikawa.

TAM genes responsivos na linha celular Ishikawa que estão relacionados para doenças do sistema reprodutor

Seguindo o tratamento de células de Ishikawa com a TAM durante 12 h, foram encontrados a expressão de genes de 1013 para ser significativamente alterada em comparação com células não tratadas de Ishikawa. Destes genes, 432 foram up-regulada e 581 foram regulados negativamente (Tabela S5). Estes resultados demonstram que a TAM tem tanto actividade antagonista e agonista em relação E2 em células de Ishikawa. Além disso, além de influenciar genes E2 regulamentados, a TAM alterou significativamente a expressão de 789 genes independentemente de E2 (Figura 2A).

Um único e genes comuns após 12 h E2 e tratamento TAM. B original e genes comuns após 12 h P4 e tratamento RU486. Os números indicados dentro de cada um dos círculos representa o número de genes significativamente alterados únicas para o tratamento, e as setas mostram a maneira como são regulamentados (para cima ou para baixo-regulação em comparação com células não tratadas Ishikawa). Sobreposições indicam o número de genes comumente alterados.

Usando uma análise do núcleo IPA, foi obtida a função prevista de genes responsivos TAM. Foram encontrados um total de 168 genes para estar relacionadas com diferentes doenças do sistema reprodutor incluindo, uterino, ovariano, e cancro do colo do útero, bem como tumores genitais, amenorreia, metrorragia, e síndrome do ovário policístico (Tabela 4).

Uma das principais vias de sinalização identificados a partir de genes responsivos a TAM foi associada com a regulação da replicação de ADN, a recombinação e reparação, assim como a progressão do ciclo celular, e a montagem e organização celular. Além disso, os genes responsivos TAM codificado moléculas que directamente ou indirectamente, foram associados com o regulador do ciclo celular, ciclina D1 (

CCND1

). Correspondentemente,

CCND1 foi encontrada para ser significativamente regulada para cima 12 h após o tratamento com a TAM (Figura 3).

moléculas vermelhas representam regulada para cima e para baixo verdes genes regulados entre 12 h TAM genes significativos em células de Ishikawa. As redes foram gerados através do uso de IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

RU486 Genes significativas na linha celular Ishikawa estão relacionados com doenças do sistema reprodutor

o tratamento de células de Ishikawa com o antagonista P4, RU486, durante 12 h resultou em alterações significativas na expressão de genes de 546 em comparação com células não tratadas, com 255 genes sobre-regulada e 291 genes regulados negativamente (Tabela S6). Semelhante a TAM, exposições RU486 ambas as actividades agonistas e antagonistas para P4 em células de Ishikawa. Por exemplo, 377 genes responsivos a RU486 após 12 horas não mostraram alterações significativas na expressão após tratamento com P4 durante 12 h. Por isso, estes genes são regulados independentemente por RU486 e na ausência de P4 em células de Ishikawa (Figura 2B).

Dos 546 genes que se encontram a ser responsivos ao tratamento com RU486, 86 moléculas codificadas relacionadas com doenças do sistema reprodutivo. Por exemplo, as moléculas relacionadas com a adenomiose, os tumores gonadais, metrorragia, e leiomioma uterino foram identificados (Tabela 4). Com base nos genes que eram sensíveis ao tratamento com RU486, uma via de sinalização relacionados com a expressão do gene, célula-a-célula sinalização e interacções, e o desenvolvimento do tecido foi identificado. As moléculas centrais nessa rede, incluindo caderina 2 (CDH2) e um complexo entre AR e NFkB, mediar interacções directas e indirectas com genes responsivos RU486 (Figura 4). Por exemplo, o gene co-repressor da transcrição,

NCOR2

, foi regulada como foi o receptor de andrógeno (

AR

) gene. No entanto, o fator de transcrição, FOXA1, foi regulada para baixo. Genes associados à célula para contato e adesão celular também foram regulada para baixo, e incluiu:

CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1,

e

COL2A1

alternativa,

PDK1

e

ADAM15

foram supra-regulados, e têm um papel na indução de degradação de tecido. A maioria das moléculas desta rede também foram associadas a morte celular e apoptose.

As moléculas centrais na rede foram caderina 2, Ar e NFkB complexo (CDH2). As redes foram gerados através do uso de IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Discussão

O objetivo deste estudo foi definir a resposta da transcrição de um modelo endometrial ao tratamento com E2, P4, TAM e RU486. Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição do pedido de RNA-Seq para o estudo dos efeitos do genoma início em uma linha de células do endométrio humano. Além disso, a maioria dos genes que foram encontrados como sendo significativamente responsivo a E2 e P4 na linha celular Ishikawa foram também detectadas em biópsias endometriais humanos recolhidos na implantação do embrião.

Durante a última década, microarrays de ter sido a mais