Abstract

carcinoma epitelial do ovário (EOC) é um tumor agressivo frequentemente diagnosticada em um estágio avançado, quando há pouca ou nenhuma perspectiva de cura. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas e quimioterápicos, foram obtidos apenas melhorias marginais na evolução de pacientes. Assim, desvendar os mecanismos biológicos que sustentam a progressão EOC é fundamental para melhorar a sobrevivência dos pacientes. Recentemente, foi relatado que a CD157 (uma ectoenzima regulação diapedese de leucócitos) é expresso em alta EOC e que a expressão da molécula está negativamente correlacionada com a evolução da doença nos pacientes. Aqui, demonstramos que a sobre-expressão forçada de CD157 em OVCAR-3, TOV-21G, A2780 e OV-90 linhas celulares de cancro do ovário promove mudanças morfológicas e fenotípicas caracterizadas por perturbação das junções intercelulares, a regulação negativa de marcadores epiteliais e supra-regulação de uns mesenquimais. Estas mudanças na forma das células e fenótipo trazer a sensibilidade reduzida a anoikis, aumento do crescimento independente da ancoragem, a motilidade celular e invasão mesotelial. Por outro lado, knockdown de CD157 nas células de OV-90 e OC314 reverte o fenótipo mesenquimal e reduz o potencial de migração das células. análise de perfil transcriptoma destaque 378 genes diferencialmente expressos de forma significativa, o que representa a assinatura de células OVCAR-3 e OV-90 CD157-superexpressão. A modulação de genes seleccionados traduz-se em alteração da expressão de proteínas que dão um fenótipo de células altamente malignas. O quadro geral deduzida a partir da análise dos transcritos modulado é que a elevada expressão de CD157 reforça um número de processos biológicos para favorecer a progressão do tumor (incluindo o desenvolvimento e a motilidade celular), e enfraquece vários processos biológicos que impedem a progressão do tumor (tal como a apoptose, morte celular e resposta ao estresse). Juntos, estes resultados implicam CD157 na progressão da EOC para doença metastática e sugerem que CD157 pode representar um alvo terapêutico valioso

Citation:. Morone S, Lo-Buono N, Parrotta R, Giacomino A, Nacci G, Brusco A, et al. (2012) sobre-expressão de CD157 Contribui para epitelial de ovário Cancer Progressão através da Promoção da mesenquimais Diferenciação. PLoS ONE 7 (8): e43649. doi: 10.1371 /journal.pone.0043649

editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de abril de 2012; Aceite: 23 de julho de 2012; Publicação: 20 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Morone et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por doações da Associação italiana de Investigação do Cancro (AIRC, MFAG6312 e IG 11602 ao óxido de etileno), do Ministério italiano da Universidade e da Pesquisa Científica (PRIN e 60% Projetos de AF) e da Fundação Internacional para Pesquisa em Medicina Experimental. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial (EOC) é uma neoplasia ginecológica agressiva e letal. Mais de 70% dos pacientes apresentam doença avançada e, apesar do tratamento agressivo, os 5 anos taxa de sobrevivência de pacientes com EOC é abaixo de 50%. Este mau prognóstico resulta da dificuldade de diagnóstico nos estágios clínicos iniciais ea falta de uma terapia eficaz para tumores em estágio avançado. A compreensão dos mecanismos biológicos que regulam a progressão da EOC é, portanto, fundamental para a concepção de novas opções de tratamento e melhorando a sobrevida dos pacientes.

EOC é pensado para surgir a partir do epitélio de superfície do ovário que as linhas do ovário. células EOC pode lançar a partir do tumor primário e, porque nenhuma barreira anatômica está presente, transmitida diretamente em toda a cavidade peritoneal e, em seguida, divulgar, principalmente através do sistema linfático, desenvolvendo os mecanismos de defesa necessários para a sobrevivência em condições independente de ancoragem [1]. No ambiente do tumor, localizada a degradação proteolítica da matriz extracelular (MEC), facilita a migração de células flutuantes, o que lhes permite ancorar ao mesotélio e, subsequentemente, a invadem, que estabelece tumores em locais secundários. Tumor difusão implica uma conversão fenotípica de células epiteliais, que não são móveis, em células mesenquimais. Este processo tem semelhanças notáveis ​​com a transição epitelial-mesenquimal (EMT) que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário [2]. Na verdade, tipo 3 ou EMT oncogênico é cada vez mais reconhecida como um mecanismo dinâmico e transitório no qual as células em tumores não invasivos primários adquirir propriedades essenciais para a migração, invasão, disseminação e resistência metastático à apoptose [3]. O programa EMT pode ser induzida por uma variedade de sinais contextuais que as células podem ocorrer no microambiente tumoral; independentemente dos sinais de disparo, a activação da EMT está associada com o resultado clínico pobre em diferentes tipos de tumores, incluindo cancro do ovário [4]. moléculas da superfície celular envolvidas no controle de processos como a célula-célula, a célula-ECM adesão, migração intraperitoneal localizada e invasão do peritônio por células ou agregados celulares (esferóides) flutuante são acreditados para jogar um papel importante na progressão da EOC e, em última análise, , na evolução dos pacientes.

CD157 /BST-1, um membro do GPI-ancorada de uma família de NADase /ADP-ribosil ciclase, é uma ectoenzima que cliva extracelular nicotinamida adenina (NAD

+) , gerando ADP ribose cíclica (cADPR) e ADPR [5], [6]. Além disso, CD157 estabelece interacções funcionais e estruturais com outras moléculas transmembranares adquirindo assim a capacidade de transdução de sinais intracelulares [7] – [9]. Embora CD157 foi caracterizada inicialmente como uma estromal [10] e glicoproteína de superfície mielóide [11] envolvidas no controle da migração celular e a diapedese [12], recentemente demonstrado que CD157 também é expressa em 90% de EOC primária e que a alta níveis de CD157 está associada com recaída rápida do tumor em doentes com EOC. De forma consistente com estes resultados, a inibição da actividade de CD157, por um anticorpo monoclonal específico (mAb)

In vitro

ou por sua expressão fraco em pacientes, está associada com a invasão de células de tumor reduzida e migração. A associação de CD157 com a agressividade EOC foi fundamentada pela observação de que a expressão exógena de CD157 em células EOC mal motilidade, CD157-negativas aumenta substancialmente a motilidade celular, um pré-requisito para as células tumorais invasão nos tecidos circundantes [13].

a implicação de CD157 na motilidade tumor celular e capacidade de invasão, e sua associação com pior prognóstico em pacientes com câncer de ovário, nos levou a investigar seu papel biológico na progressão EOC utilizando linhas celulares de cancro do ovário projetados como modelo experimental. O objetivo final era entender como a função de CD157 pode contribuir para um câncer de ovário mais agressivo e se CD157 pode ser útil para ajudar a gestão desses pacientes.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares e reagentes

as linhas celulares EOC humanos OVCAR-3 e de OV-90 ea não-maligno pleural linha de células de mesotélio Met-5A foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As linhas celulares EOC TOV-21G e A2780 foram fornecidas por M. F. Di Renzo (Universidade de Turim, Itália) e OC314 foi fornecido por S. Ferrini (Institute for Cancer Research and Treatment, Génova, Itália). O mAb anti-CD157 (SY /11B5, gentilmente fornecida por F. Malavasi, Universidade de Turim, Itália) foi produzido em laboratórios e afinidade dos autores purificado em proteína G (Sigma-Aldrich). O F Alexa-488 marcados (ab ‘)

2 fração de anticorpos de cabra para IgG de rato ou a IgG de coelho eram de Molecular Probes (Milão, Itália). Anti-E-caderina foi de mAb da BD Biosciences (Milão, Itália), anti-Snail, anti-Zeb1, anti-EpCAM, anti-VCAN, anti-BMP7, anti-tubulina, anti-β-catenina, anti-N- caderina e anti-β-actina-peroxidase de rábano (HRP) mAb foram de Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), anti-lamina B1 foi de Abcam (Cambridge, Reino Unido). faloidina-TRITC marcado utilizado para detectar a actina F foi de Sigma-Aldrich. GM6001 (inibidor de metaloproteases de matriz) foi de Enzo Life Science (Vinci Biochem, Vinci, Itália).

CD157 Gene transfecção e shRNA Lentivirus Particle Transdução

As células foram transfectadas com a eucariótica pcDNA3 vector de expressão. 1, que contém o ADNc para a CD157 de comprimento completo ou sem inserto (simulação), como descrito [13]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 ou MCDB131 /M199 (vol /vol) de meio de cultura (Sigma-Aldrich, Milão, Itália) enriquecido com 10% de soro fetal de vitelo (FCS, Biochrom Seromed, Milão, Itália). As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO2 e testados para

Mycoplasma

contaminação.

expressão CD157 em células de OV-90 e OC314 foi silenciado pela entrega lentiviral do PLV-puro (Biosettia, San Diego, CA) que codifica um curto-gancho de cabelo de ARN (ARNsh) segmentação ARNm BST-1 (5′-sequências alvo GAGTCAGACTGCTTGTATA-3 ‘(shCD157) e 5′-CCTGAGCGATGTTCTGTAT-3’ (shCD157 # 2); mexidos sequência 5 ‘ -TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3 ‘). As partículas foram geradas como previamente descrito [14]. As células foram incubadas com sobrenadantes de lentivírus adequadas e polibreno (8 mg /mL, Sigma-Aldrich). As células transduzidas foram submetidos a selecção em 2 ug /ml puromycine (Santa Cruz Biotechnologies), durante 3 dias.

(A) sqrt-PCR da expressão de CD157 ectópica em OVCAR-3 células (topo). GAPDH foi usada como um controlo interno. A análise Western blot de CD157 em OVCAR-3 /CD157 e OVCAR-3 /células simuladas (parte inferior). O mAb anti-β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B-C) Morfologia do OVCAR-3 /simulação e OVCAR-3 /CD157 células. colónias representativos visualizadas após coloração com violeta de cristal utilizando um microscópio invertido IX70 equipado com uma câmera UC30 e o software de análise de CellF (Olympus Biosystems) são mostrados. (B, barra de escala: 200? M; C, barra de escala: 20 mM). (D) confocal microscopia análise de F-actina. As células foram cultivadas em lamelas revestidas com gelatina, fixadas com 2% de PFA, permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 e coradas com faloidina-TRITC. As amostras foram analisadas usando um Olympus FV300 de varredura a laser do microscópio confocal. As células foram fotografadas utilizando uma objectiva de imersão 60 × óleo (1,4 NA). (Barra de escala: 20 uM). Microfotografias em B, C e D foram então reproduzidas em preto e branco. (E) OVCAR-3 células foram sujeitas a um ensaio de adesão célula-célula e aglomerados ( 5 células) foram contadas em 20 campos diferentes /prato. Os resultados representam a média ± EPM de quatro experiências independentes. ** P 0,01, bicaudal teste t. (F) Os agregados gerados utilizando o método de gota suspensa e incubação durante a noite a 37 ° C foram dispersos mecanicamente e depois fotografadas com um microscópio de contraste de fase (barra de escala: 50 uM). (G) indução de anoikis em células OVCAR-3 /CD157 e OVCAR-3 /simulados após 72 h de cultura em placas de poli-HEMA-revestidos. As imagens de microscopia de contraste de fase mostram a formação de grandes agregados que flutuam em células OVCAR3 /mock e pequenos agregados ou células individuais isoladas em células OVCAR3 /CD157 (Barra de escala: 200 uM). (H) após 24, 48 e 72 h de crescimento independente de ancoragem, as células foram fixadas, permeabilizadas, coradas com iodeto de propidio e analisadas com um FACSCanto. A análise dos dados foi realizada com o software de análise do ciclo celular ModFit LT ™. Anoikis em OVCAR-3 /simulada e OVCAR-3 /CD157 células foi determinada através da medição da percentagem de células sub-G1. Os resultados representam a média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05; ** P 0,01, bicaudal teste t. (I) histogramas representativos do estado do ciclo celular de células simuladas e CD157-positiva OVCAR-3, após 48 h de crescimento independente de ancoragem. (J) o crescimento ancoragem independente de OVCAR-3 /CD157 e células falsamente foi analisada pelo ensaio de formação de colónia em agar mole. O gráfico representa o número médio de colónias formadas a partir de três experiências independentes ± SEM após 3 semanas de incubação de células em agar mole. * P . 0,05, bicaudal teste t

Análise Western Blot

lisados ​​celulares totais foram obtidos por incubação em tampão de lise RIPA (50 mM Tris HCl, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, EDTA 1 mM, SDS a 0,1% suplementado com 1 mM de Na

3VO

4, NaF 5 mM, 50 ug /ml de aprotinina e leupeptina). Os extractos citossólicos foram obtidas por incubação das células durante 10 minutos a 4 ° C com uma solução tampão hipotónico contendo Tris-HCl a 20 pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl 3 mM de

2 e 50 ug /mL de Inibidor de Protease Cocktail (Sigma-Aldrich ). A suspensão foi tratada com uma solução de NP40 a 0,5% e o homogenado obtido foi centrifugado (3.000 rpm, 10 minutos a 4 ° C). Os extractos nucleares foram preparados por incubação do sedimento obtido como descrito acima, em tampão de lise RIPA durante 30 minutos. Após 30 minutos de centrifugação a 14.000 rpm a 4 ° C, a concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [13]. Resumidamente, quantidades iguais (30 ug) de extractos de proteína a partir de células foram separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10% (PAGE) sob condições e em difluoreto de polivinilideno transferiu-electro não redutoras (PVDF) membranas, em seguida, bloqueadas e sondadas com o mAb indicado. Após incubação com os anticorpos conjugados com HRP apropriados (Santa Cruz Biotechnologies), as bandas imunorreactivas foram detectadas por quimioluminescência aumentada (Perkin Elmer, Monza). As imagens foram capturadas com uma análise ChemiDoc ™ XRS + Sistema e densitometria foi realizada com Image Lab ™ Software (Bio Rad, Milão, Itália).

celular Colony Scattering Ensaio e macio Agar Colony Formação

Células (500 /poço) foram semeadas em placas de 6 poços e mantidas em meio de cultura suplementado com 5% de FCS durante 14 dias, em seguida, lavadas, fixadas em metanol durante 30 minutos, coradas com violeta de cristal (Sigma-Aldrich) e visualizadas utilizando um IX70 microscópio invertido equipado com uma câmera UC30 e o software de análise de CellF (Olympus Biosystems).

em ensaios de agar mole 6 × 10

2 células foram misturados com solução de agar a 0,45% em meio RPMI contendo FCS a 10% e em camadas na parte superior da camada de base de agar a 0,9%, em placas de 24 poços. Os ensaios foram realizados em triplicado. Depois de 2-3 semanas a 37 ° C em um CO 5%

2 incubadora, as colónias foram visualizados com um microscópio invertido e contadas.

adesão célula-célula e célula de agregação Ensaios

experiências de adesão célula-célula foram realizadas como descrito [15]. Resumidamente, suspensões de células isoladas foram semeadas em placas de cultura de 0,5% de agarose revestidas com (1 ml /poço, a 30 minutos a 37 ° C) para evitar a adesão celular e, lentamente, agitou-se durante 2 h a 37 ° C.

os ensaios de agregação celular foram realizadas utilizando o método de gota suspensa, como descrito [16]. Resumidamente, as células (5 × 10

3/25 ul de meio RPMI 1640 com FCS a 5%) foram semeados sobre a superfície interna da tampa de uma placa de Petri. Para evitar a evaporação, 10 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) foram colocadas no prato. Após incubação durante a noite a 37 ° C, os agregados celulares foram mecanicamente disperso e fotografadas utilizando um microscópio de contraste de fase.

anoikis Ensaio

se as células (5 × 10

5 /poço) foram cultivadas em 20 mg /ml de poli-HEMA (poli-hidroxietilmetacrilato, Sigma-Aldrich) tenha sido tratada com placas de 6 cavidades, durante 24 a 72 h. Em seguida, os agregados de células foram dispersas e as células foram fixadas com etanol a 75% gelado (vol /vol) durante a noite a 4 ° C. As células foram tratadas com 100 ug /ml de RNase A (Sigma-Aldrich, 30 minutos a 37 ° C), coradas com 10 ug /mL de iodeto de propídio (10 minutos a 4 ° C) e as amostras foram analisadas com um FACSCanto (Becton Dickinson, mountain View, CA, EUA). A análise dos dados foi realizada utilizando software de análise de ciclo celular ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ME). Anoikis foi determinada pela medição da percentagem de células sub-G1.

Imunofluorescência coloração e microscopia confocal

Em experiências de microscopia confocal, as células foram cultivadas até à subconfluência em lamelas revestidas com gelatina, fixadas com 4% paraformaldeído (PFA) durante 30 minutos a 20 ° C, lavadas e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em solução salina tamponada com fosfato com soro de cabra normal a 1% e 1% de BSA durante 15 minutos a 20 ° C. As células foram incubadas com os anticorpos primários indicados seguido de anticorpos secundários fluoro-488-conjugados Alexa. As amostras foram analisadas com um microscópio confocal de varrimento laser Olympus FV300 equipado com um árgon azul (488 nm) de laser, um de néon hélio verde (543 nm) de laser, e software FluoView 300 (Olympus Biosystems, Hamburgo, Alemanha). As células foram fotografadas utilizando uma objectiva de imersão de óleo 60 × (1,4 NA) e 10 × lente ocular. Nomarski imagens foram obtidas por contraste de interferência diferencial (DIC) componentes ópticas instaladas num microscópio invertido IX71. A análise semiquantitativa da coloração juncional E-caderina foi realizada por contagem de um mínimo de 10 campos por amostra (mínimo de 200 células totais) e marcando como positivo o número de células restantes com duas bordas célula-célula fluorescentes.

ARN extracção e Transcriptase reversa-PCR

o ARN total (2 ig) extraído de 70-80% de culturas confluentes utilizando o reagente TRIzol ® (Invitrogen, S. Giuliano Milanese, Itália) foi transcritos de modo inverso com o M-MLV reversa transcriptase (Invitrogen) e iniciadores oligo-dT. O ADNc foi amplificado utilizando KAPA2G rápida HotStart ADN Polimerase (Kapa Biosystems, Cambridge, MA). Cada ciclo consistiu de uma desnaturação a 94 ° C durante 10 segundos, emparelhamento durante 10 segundos e extensão a 72 ° C durante 1 segundo. Na análise semi-quantitativa (sqrt-PCR), o número apropriado de ciclos para permanecendo dentro da fase exponencial foi determinada para cada substrato. Os iniciadores utilizados estão descritos na Tabela S1. Os produtos de PCR foram então analisados ​​por electroforese em gel de agarose.

SYBR Green em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milão, Itália ) de acordo com as instruções do fabricante. qRT-PCR foi realizada utilizando SYBR Green JumpStart Taq READYMIX (Sigma-Aldrich) e um sistema de detecção ABI 7500 sequência rápida (Applied Biosystems-, Foster City, CA, EUA). condições dos ciclos de PCR foram realizadas para todas as amostras como se segue: 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela S2. As reacções de PCR para cada modelo foram feitas em triplicado em placas de 96 poços. O método comparativo CT (Applied Biosystems) foi utilizado para determinar a expressão do gene em CD157-transfectadas em relação ao valor observado nas células de controlo correspondentes, utilizando como TBP controlo de normalização.

(A) análise de microscopia confocal E- caderina e (B) a expressão β-catenina em OVCAR-3 /CD157 e as células simuladas. As células foram cultivadas numa lamela revestida com gelatina, fixo, permeabilizadas e coradas com anticorpos anti-E-caderina, e anticorpos anti-β-catenina seguido por anticorpo Alexa Fluor-488-secundário marcado. As amostras foram analisadas com um Olympus FV300 de varredura a laser microscópio confocal e por Nomarski contraste de interferência diferencial (DIC) ópticas. Para E-caderina, uma imagem de fluorescência se fundiu com a imagem DIC é mostrado (barra de escala: 50 mM). A análise semiquantitativa da juncional coloração E-caderina foi determinada pela contagem de um mínimo de 10 campos /amostra (pelo menos 200 células totais) e marcando como células positivas com dois restantes fronteiras intercelulares fluorescentes. Para β-catenina, uma imagem fluorescente é mostrado. Detalhe: vista de um-3 OVCAR /CD157 célula individual exibindo coloração β-catenina difusa no plano de foco cortando o núcleo amplificado. Asteriscos correspondem a nucléolo. (C) Western blotting para E-caderina e β-catenina em OVCAR-3 /CD157 e as células simuladas. Densitometria quantifica o nível de E-caderina e β-catenina em relação à expressão de p-actina. níveis β-catenina em fracções nucleares e citoplasmáticos de (D) OVCAR-3 /simulada e OVCAR-3 /CD157 células foram determinados por análise de Western blot. α-tubulina e lamina B1 (LAMB1) foram utilizados como controlos de carga citoplasmática e nuclear, respectivamente. Densitometria quantifica o nível de expressão de β-catenina em relação ao controlo adequado. (E) sqrt-PCR para a E-caderina, N-caderina, β-catenina e a E-caderina repressores transcricionais em OVCAR-3 /CD157 e as células simuladas. Densitometria quantifica os níveis de expressão de E-caderina repressores relativos a GADPH. (F) qRT-PCR para Zeb1, Caracol e TWIST1. O método CT comparativo foi utilizado para determinar a expressão de genes em células transfectadas com CD157 em relação ao valor observado nas células simuladas, utilizando TBP como controlo de normalização. Histogramas relatar as médias ± SEM de três qRT-PCR experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. * P 0,05, *** P 0,001;

ns

, não significativo; Bicaudal teste t. (G) análise de Western blot que mostra o nível de Caracol e Zeb1 em OVCAR-3 /simulação e OVCAR 3 /CD157 células. Densitometria quantifica o nível de ambas as proteínas em relação à expressão de p-actina. Os resultados apresentados em cada painel são representativos de três experiências independentes com resultados semelhantes.

-cicatrização de feridas Ensaio

As células foram semeadas em placas de seis poços até à confluência e, em seguida, um arranhão foi feita através da monocamada, tal como previamente descrito [13]. Imagens da área feridos foram registrados nos horários indicados. Cada experimento foi realizado em quadruplicado e repetido pelo menos três vezes.

Transmesothelial Ensaios de Migração e Confocal análise de microscopia

células Met-5A (2 × 10

5) foram marcadas usando um CellBrite ™ Red citoplasmática membrana coloração kit de acordo com as instruções do fabricante (Biotium Inc. Hayward, CA), em seguida semeadas em (10 ug /ml) lamelas revestidas com fibronectina e deixou-se crescer até à confluência. células de cancro do ovário (1,5 × 10

5) foram coradas com 5 mM CFSE (éster de succinimidilo carboxifluoresceína, Molecular Probes) e semeadas na monocamada Met-5A durante 6 h (OVCAR-3 células) ou 2,5 h (OV-90 células) a 37 ° C. As células tumorais não aderentes foram cuidadosamente removidas, a amostra fixada com 2% de PFA e, em seguida, analisada utilizando um Olympus FV300 de varrimento laser microscópio confocal. As células foram fotografadas utilizando uma objectiva de imersão em óleo de 60 × (1,4 NA) por varrimento sequencial dos planos XY registadas ao longo do eixo Z (tamanho do passo: 1,25? M). As células foram contadas na parte superior, média e inferior fase e a proporção de células na fase inferior ao número total de células representa a percentagem de células que migraram através da monocamada [17]. Onde indicado, as células foram tratadas durante 1 h com o GM6001 (25 ug /ml) antes da semeadura sobre a monocamada de células mesoteliais Met-5A.

A gelatina e caseína zimografia Ensaios

OVCAR-3 e OV -90-transfectadas células foram semeadas em placas de 48 poços e cultivadas a 80% de confluência, em seguida, incubadas durante um período adicional de 48 h em meio livre de FCS. As metaloproteinases de matriz (MMPs) MMP2 e actividade MMP9 no meio condicionado foi analisado utilizando 10% de SDS-PAGE contendo 1 mg /mL de gelatina (zimografia) [18], e a actividade MMP7 foi visualizada utilizando 12% de SDS-PAGE contendo 1 mg /ml de caseína (caseína zimografia) [19]. Os géis foram corados com Azul Brilhante de Coomassie G-250 para visualizar a actividade da protease. As imagens foram capturadas com uma análise ChemiDoc ™ XRS + Sistema e densitometria foi realizada utilizando Software Image Lab ™.

Spheroid Desagregação Ensaio

Spheroids foram gerados com o método da gota de suspensão e sua desagregação em fibronectina revestido placas (10 ug /ml) foi medida após 12 h de incubação a 37 ° C, tal como descrito noutro local [13]. Resumidamente, placas de 96 poços foram revestidos com 10 ug /ml de fibronectina e bloquearam-se com BSA (1 mg /ml) durante 1 h a 37 ° C. Esferóides esferóides (8-10 /poço) foram cultivadas em meio RPMI-1640 isento de soro. Para rastrear esferóides individuais ao longo do tempo, cada poço foi fotografada 30 minutos após a sementeira (tempo 0) e após 12 h. A área de pixel dos esferóides foi medida no tempo 0 e 12 h, e a mudança na área de dobragem foi calculada como a razão entre a área de pixels dos esferóides em 12 h e no tempo 0.

Microarray hibridação, Recolha de dados e Análise

O RNA total foi extraído de linhas celulares duplicados controle confluentes 70-80% (/simulados e OV-90 /simulada OVCAR-3) linhas de células e ensaio (OVCAR-3 /CD157 e OV- 90 /CD157), preparação de micromatriz sonda, hibridação, a digitalização e análise de imagem foram realizados como previamente descrito [20]. Duas repetições, com permuta de corantes, foram realizadas para cada amostra. elaboração de dados em bruto foi efectuada com Bioconductor [21], utilizando linguagem R estatística [22] a aplicação de um corte no valor P, ajustado para testes múltiplos pela abordagem Benjamini-Hochberg ( 0,01), seguido por filtração em nível de expressão (logFC 1 ou -1 em, pelo menos, uma linha de células, excluindo transcritos com sinal oposto). Este critério permitiu a identificação de transcrições com modulação concordante e tomou em consideração as diferenças biológicas intrínsecas de linhas celulares distintas que podem ser refletidas na amplitude das mudanças dobra.

ontologia Gene, via canônica e análise de rede funcionais foram realizados utilizando tanto o DAVID Base de Conhecimento [23] e MetaCore software de GeneGo Inc., aplicando um corte em valores P de enriquecimento ( 0,05). conjuntos de dados de expressão de genes foram depositados no Omnibus (GEO) do banco de dados Gene Expression, ID: GSE36364.

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=flktjkcsuyygcrm acc=GSE36364).

Statistical Métodos e Análise de Dados

A menos que indicado de outra forma, os valores são expressos em média ± SEM. As comparações entre os dois grupos foram realizadas usando

t

teste de um estudante de duas faces não pareado para as variáveis ​​distribuídas normais. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS Statistics 17 software (Chicago, IL) e GraphPad Prism 5 software (San Diego, CA). Todos os testes estatísticos foram bilaterais. Para todas as análises, foram consideradas diferenças significativas a P 0,05 (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

contra

controle) e

ns Compra de não significativa .

(a) sqrt-PCR (esquerda) e western blot (direita) de CD157 em OV-90 /CD157 e OV-90 /células simulados. GAPDH e β-actina foram utilizados como controlos internos, respectivamente. (B) Morfologia de colónias formadas por OV-90 /simulada e 90-OV /CD157 células. colónias representativas visualizadas após coloração violeta cristal são mostrados. Barra de escala: 200? M. (C) sqrt-PCR A análise de E-caderina e N-caderina nas células de OV-90 /simulados e OV-90 /CD157. Densitometria quantifica os níveis de expressão de mRNA das moléculas indicados relativos a GAPDH. (D) Efeito de sobreexpressão de CD157 anoikis. Após 48, 96 e 72. 192 h de crescimento independente de ancoragem, as células foram fixadas, coradas com iodeto de propidio e analisadas com um FACSCanto. Anoikis em OV-90 /simulada e 90-OV /CD157 células foi determinada através da medição da percentagem de células sub-G1. Os resultados representam a média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05; ** P 0,01, bicaudal teste t. (E) o crescimento ancoragem independente de OV-90 /CD157 e células falsamente foi analisada pelo ensaio de formação de colónia em agar mole. O gráfico representa o número médio de colónias formadas a partir de três experiências independentes ± SEM após 3 semanas de incubação de células em agar mole. *** P 0,001, bicaudal teste t. (F) Efeito de expressão CD157 sobre a migração celular em um ensaio de ferida-zero em OV-90 /CD157 e as células simuladas. As células foram cultivadas como monocamadas, ferido, e fotografada no instante 0 e às 24 h. bordas da ferida são indicadas pelo preto linhas tracejadas (barra de escala: 200 m). (G) A capacidade das células para fechar a ferida foi calculada medindo 20 distâncias escolhidas aleatoriamente ao longo da borda da ferida ao tempo 0 e 24 h. Os resultados representam a percentagem de redução da largura média da ferida e são expressos como a média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05; Bicaudal teste t.

sqrt-PCR (esquerda) e análise de western blot (à direita) mostrando células (A) OV-90 retrovirally transduzidas com um shRNA que tem como alvo o mRNA CD157 humano, resultando em knockdown eficiente de expressão CD157. GAPDH e β-actina foram utilizados como controlos internos, respectivamente. (B) Morfologia de colónias formadas por OV-90 /corrida e OV-90 células /shCD157. colónias representativas visualizadas após coloração violeta cristal são mostrados. Barra de escala: 200? M. (C) sqrt-PCR para E-caderina, N-caderina e Caracol, TWIST1 e Slug repressores de transcrição no OV-90 /corrida e OV-90 /shCD157 células. Densitometria quantifica os níveis de expressão de mRNA das moléculas indicados relativos a GAPDH. ensaio (D) anoikis. Depois de 48, 72, 96 e 192 h, sob o crescimento independente de ancoragem, as células foram fixadas, coradas com iodeto de propidio e analisadas com um FACSCanto. A análise dos dados foi realizada com o software de análise do ciclo celular ModFit LT ™. Anoikis em OV-90 /precipitação e OV-90 células /shCD157 foi determinada pela medição da percentagem de células sub-G1. Os resultados representam a média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05; ** P 0,01, bicaudal teste t. (E) o crescimento Anchorage independente de OV-90 /corrida e OV-90 /shCD157 células foi analisada pelo ensaio de formação de colónias em agar mole. O gráfico representa a média do número de colónias /campo formado a partir de três experiências independentes ± SEM após 3 semanas de incubação de células em agar mole. * P 0,05, teste de duas caudas t. (F) Efeito da CD157 knockdown na migração celular OV-90 em um ensaio de ferida-zero. As células foram cultivadas como monocamadas, ferido, e fotografada no instante 0 e após 24 h (Barra de escala: 200 uM). bordas da incisão são indicadas por linhas a tracejado preto. (G) A capacidade de OV-90 /precipitação e OV-90 células /shCD157 para fechar a ferida foi calculada medindo 20 distâncias escolhidas aleatoriamente ao longo da borda da ferida ao tempo 0 e 24 h. Os resultados representam a percentagem de redução da largura média da ferida e são expressos como a média ± SEM de três experiências independentes. ** P . 0,01, teste t bicaudal

Resultados

CD157 Expressão Modula células cancerosas ovarianas Morfologia e interação célula-célula

Nós escolhemos OVCAR- 3 células de cancro do ovário como o modelo mais apropriado para estudar os efeitos induzidos pela expressão de CD157, uma vez que têm um fenótipo epitelial [24], são pouco invasiva, dificilmente móveis em plástico e quase independente de ancoragem [25]. Para explorar o significado biológico de CD157 na progressão do cancro do ovário, que transfectadas estavelmente CD157 de comprimento completo em células OVCAR-3 CD157-negativas (Figura 1A). As imagens de microscopia de luz revelou que as células simuladas cresceu aglomerados tão firmemente ligados composto de células com morfologia típica epitelial paralelepípedos-like. Em contraste, OVCAR-3 /CD157 células exibiam uma distribuição mais espalhada e forma alongada, uma característica distintiva das células semelhantes a fibroblastos, e formado junções mal organizadas entre as células adjacentes (Figura 1B, C).