Sumário

Salinomicina levantada esperança para ser eficaz em terapias anti-cancro devido à sua capacidade para superar a resistência a apoptose em diversos tipos de células cancerosas. Recentemente, sua eficácia contra células de carcinoma hepatocelular humano (HCC), tanto

in vitro

e

in vivo

foi demonstrada. No entanto, o mecanismo de acção ainda não está claro. Últimos estudos implicados interferência com a via de degradação da autofagia. Este estudo teve como objetivo determinar o impacto de salinomicina em HCC-autofagia e se hepatócitos primários humanos (PHH), também são afetados. Após a exposição das linhas celulares de carcinoma hepatocelular Huh7 HepG2 e de concentrações variáveis ​​de salinomicina (0-10 uM), a análise exaustiva da actividade autophagic usando western-blot e citometria de fluxo foi realizada. efeitos de drogas foram analisadas nas configurações de estimulação autofagia por fome ou PP242-tratos e correlacionada com a viabilidade celular, proliferação, indução de apoptose, acúmulo de massa mitocondrial e espécies reativas de oxigênio formação (ROS). Impacto na indução de apoptose celular e função da PHH foi analisada.

constitutivo e estimulado atividades autofágicos ambos foram efetivamente suprimida em HCC por salinomicina. Esta inibição foi associada com a acumulação de mitocôndrias disfuncional, apoptose aumentada e diminuição da proliferação e viabilidade celular. Efeitos de Salinomicina e foram dose dependente do tempo e pode ser facilmente replicado por inibição farmacológica e genética de sozinha HCC-autofagia. exposição salinomicina a PHH resultou em alteração transitória da função de síntese e viabilidade celular, sem indução de apoptose. Em conclusão, nossos dados sugerem que a salinomicina suprime estágios tardios da HCC-autofagia, levando a reciclagem prejudicada e acumulação de mitocôndrias disfuncionais com o aumento da ROS-produção todos os quais estão associados a indução de apoptose

Citation:. Klose J , Stankov MV, Kleine M, Ramackers W, Panayotova-Dimitrova D, Jäger MD, et al. (2014) A inibição da autofagia Flux por Salinomicina Resultados em Anti-Cancer efeito em células de carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 9 (5): e95970. doi: 10.1371 /journal.pone.0095970

editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Reino Unido

Recebido: 10 Janeiro, 2014; Aceito: 01 de abril de 2014; Publicado em: 09 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Klose et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Heidelberger Stiftung Cirurgia e Gesellschaft der Freunde für Chirurgie (JK), KFO 250 (GB, MVS), Rebirth EXC 62/1 (GB), e Else Kröner-Fresenius-Stiftung (FWRV; 2010_A49). Os autores reconhecem apoio financeiro por parte da Deutsche Forschungsgemeinschaft e Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg dentro do programa de financiamento Open Access Publishing. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

salinomicina (Sal) é um antibiótico poliéter amplamente utilizado como anticoccidianos em aves de capoeira [1] e suplemento dietético na raça ruminantes e porcos ” [2], [3] devido à sua atividade antimicrobiana. Recentemente, o potencial do Sal como um agente anti-cancro tem sido elucidado [4]. Gupta et ai. demonstrou uma eficiência mais do que 100 vezes de Sal em comparação com paclitaxel para matar as células-tronco do cancro da mama em ratinhos [5]. Mais tarde, a eficácia do Sal contra células de tumor foi confirmada em várias linhas celulares de cancro de origem diferente, incluindo doenças malignas sólidas e não sólidas, [6] – [9]. Sal também representa um candidato promissor para o tratamento de doenças malignas hepatobiliares como demonstrado para HCC

em

vitro e

in vivo

[10]. Também demonstramos recentemente que Sal é viável para quebrar a resistência a apoptose em colangiocarcinoma humana (CC) células [11]. No entanto, o modo preciso de acção do Sal como um agente anti-cancro permanece obscura. Vários mecanismos como o bloqueio via Wingless-type (Wnt) /β-catenina [12] ou a activação das caspases convencional conduzidos vias apoptóticas [13] têm sido propostas. Ultimamente, foi sugerido um novo mecanismo responsável pelo efeito anti-cancro do Sal envolvendo alterações mediadas por actividade de droga autophagic célula cancerosa. A autofagia é um caminho de reciclagem de proteínas existentes, organelas ou danos celulares. Em células tumorais autofagia é assumido para promover a sobrevivência. Dependendo do sistema experimental, tanto a inibição [14] ou ativação [15] – [17] por Sal desta via degradação celular foram relatados

Assim, o objetivo deste estudo foi verificar o anti-câncer. Propriedades do Sal relativa HCC e para elucidar o seu efeito sobre o mecanismo de pró-sobrevivência de autofagia destas células cancerosas. Dado que os efeitos pro-apoptóticos de Sal têm sido sugeridos para poupar as células benignas [9], que ainda estavam interessados ​​no seu impacto sobre os hepatócitos humanos primários (PHH). Nós mostramos que salinomicina parece suprimir fases tardias da HCC-autofagia, levando a reciclagem prejudicada e acumulação de mitocôndrias disfuncionais com o aumento da ROS-produção e indução de apoptose. Além disso, foi demonstrada uma redução temporária da função celular em PHH após a exposição a salinomicina.

Materiais e Métodos

salinomicina

Sal foi adquirido de Sigma-Aldrich e dissolvido em DMSO . As soluções-mãe foram armazenadas a -20 ° C. concentrações da droga estavam na faixa de

In vitro

experimentos semelhantes [10], [11], [14].

isolamento de hepatócitos

O isolamento de hepatócitos primários humanos (PHH ) foi realizada pela técnica de colagenase perfusão 2-step conforme relatado anteriormente [18] (ver informações de apoio). Todos os doadores de tecidos deu consentimento informado por escrito para uso experimental de amostras de fígado. O protocolo foi aprovado pela comissão de ética da Hannover Medical School.

cultura celular

linhas de células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 (American Type Culture Collection (ATCC), número de ordem HB-8065) ​​e Huh7 [ ,,,0],19] foram cultivadas em DMEM (PAA) suplementado com FCS a 10%, penicilina (50 U /ml) e estreptomicina (50 mg /L) (Invitrogen). O meio foi trocado a cada 48 h. Para estudos autophagy ambas as linhas celulares foram mantidas em EMEM suplementado ATCC-formulado como anteriormente descrito [20]. inibidores estabelecidos e ativadores de autofagia foram usados ​​em concentrações reportados anteriormente na análogas

in vitro

experimentos: 3 MA (0,4-10 mM), LY294002 (0,8-20 mM), vinblastina (0,5-10 mM), nocodazole (0,5-10? M), PP242 (5 uM), a cloroquina (CQ) (5-100? M) e cloreto de amónio (ACH) (1-20 mM) [21]. indução fisiológica de autofagia foi realizada utilizando HBSS contendo glicose 6 mM (meio de fome)

PHH isolada de fresco com uma viabilidade . 90% foram inoculadas em placas de 6 e de 96 poços revestidas com colagénio a 1,5 e 0,05 x 10

6 células viáveis ​​/poço, respectivamente, e cultivadas utilizando Williams Meio e tal como anteriormente descrito [18]. Após a exposição a concentrações variáveis ​​de Sal (0-10 uM) de 24/48 h, foram ainda cultivadas com meio normal durante mais 5 dias. O meio foi trocado diariamente. Sobrenadantes e as células aderentes foram coletadas para análise em dias 1/3/5.

A viabilidade celular

PHH e células HCC humanos foram investigadas para

in vitro

a viabilidade celular em CellTiter 96AQueous Uma solução de células Ensaio de Proliferação (Promega) tal como previamente descrito [18]. Além disso, a morte celular foi também analisada utilizando propidiumiodite (PI) e ensaio de exclusão de citometria de fluxo. Alternativamente apoptose foi analisada utilizando alterações na FSC celular vs. gráfico de pontos SSC como descrito anteriormente [20].

ensaio Proliferação

células

HepG2 e Huh7 foram cultivados a 1 × 10

3 /bem em meio sozinho ou com 1-10 uM Sal em placas de 96 poços durante 24 h. Para as últimas 16 h de cultura de células foram pulsadas com 1 uCi

3H-timidina e incorporação detectada por um contador-β como previamente descrito [11].

Anexina-V analisa

as células HepG2 e Huh7 foram analisados ​​para a indução de apoptose após exposição a 1-10 ^ M durante 24 h Sal aplicando o kit de detecção de apoptose Anexina-V (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [11].

Constructos e infecção retroviral

O plasmídeos pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B e pBABEpuro GFP-LC3 (N # 22418 e 22405), projetado pela Jayanta Debnath [21], foram obtidos a partir Addgene. transdução celular e selecção foram realizados como previamente descrito [20], [22]. inibição genética de autofagia foi conseguida usando

ATG7

shRNA mediada knock down (Santa Cruz). shRNA não específico (controlo), bem como copGFP foram aplicados de acordo com as instruções do fabricante (Santa Cruz). A transdução foi realizada utilizando partículas lentivirais com até cinco de expressão constrói distinta, tal como descrito noutro local [20]. eficiência de transdução foi quantificada pelo número de células positivas para GFP e, em geral, excedeu 94%, no final de selecção de puromicina.

efeitos Análise de salinomicina mediadas sobre a actividade autophagic HCC

compartimentos autophagic ( pré-autofagossomas, autofagossomas e autophago-lisossomos) representam componentes intermediários de um processo de degradação dinâmica e seu montante total em um ponto de tempo específico é determinada pela dinâmica da sua criação e da degradação [23]. Realizamos estudos que medem o fluxo autofágica acordo com as diretrizes recentes [23]. fluxo autofágica refere-se a todo o processo de autofagia, incluindo a entrega de cargas e subsequente degradação autolysosomal. Medição do fluxo autofágica permite a discriminação entre indução e inibição final de maturação autophagosome como ambos são caracterizados com um aumento da presença de autofagossomas [23], [24]. Conversão de GFP-LC3-I para GFP-LC3-II foi determinada por transferência de Western utilizando anticorpo anti-LC-3B (Sigma-Aldrich) [23]. fluxo autofágica foi avaliada como acúmulo de não degradada GFP-LC3-II após o bloqueio degradação autophagosomal usando ACH. Densitometria bandas LC3-II foi realizada usando software LabImage1D (Soluções Kapelan Bio-Imaging) e normalizado para a densidade óptica (OD) da actina [24]. Além disso, o fluxo autophagic em linhas celulares de carcinoma hepatocelular foi analisada por detecção de alterações no sinal total de GFP-LC3 celular ou mCherry-GFP-LC3 utilizando citometria de fluxo, como previamente descrito [20]. Em resumo, o aumento de fluxo autophagic corresponde a uma entrega progressiva de GFP-LC3 para autolysosomes para a degradação e o desaparecimento do sinal. Além disso, o fluxo autophagic inibida se traduz em redução desaparecimento GFP-LC3 e devido à produção constitutiva celular é detectada como um sinal celular total aumentou [20]. A análise foi feita em LSR-II (BD Biosciences). autophagic fluxo foi também determinada usando o cito-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [25]. Este ensaio baseia-se um corante específico que cora selectivamente compartimentos autofágicos. fluxo autofágica, portanto, é quantificada como a acumulação de compartimentos autofágicos em condições básicas ou activadas (HBSS- ou PP242-incubação) após o bloqueio da degradação autophagolysosomal por CQ ou ACH. É calculado subtraindo-se o valor cito-ID MFI da amostra sem CQ /ACH do valor cito-ID MFI da amostra com CQ /ACH para cada condição utilizando a fórmula: ΔMFI cito-ID = MFI cito-ID (+ CQ /ACH) -. MFI Cyto-ID (-CQ /ACH)

mitocondrial massa

massa mitocondrial foi determinada por citometria de fluxo utilizando MitoTracker verde FM (MTR verde) coloração de acordo com o fabricante do instruções (Molecular Probes) como descrito anteriormente [26].

espécies reativas de oxigênio (ROS)

ROS foram determinadas por citometria de fluxo aplicação 5- (e-6) -Clorometil-2 ‘ , 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetato, éster de acetilo (CM-H2DCFDA) coloração de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen) como descrito anteriormente [20].

Aspartato aminotransferase-fugas e ureia formação

como medida para o grau de danos celulares a actividade da aspartato-aminotransferase (AST) foi determinada para culturas PHH. Além disso, a formação de ureia como um indicador para a função das células foi investigada. Ambos os parâmetros foram detectados em sobrenadantes da cultura por ensaios de atividade enzimática padronizado (Roche Molecular Diagnostics) realizados pelo laboratório central da Hannover Medical School.

síntese de albumina

A síntese de albumina pela PHH foi avaliada usando a albumina ELISA a quantificação Set Humano (Bethyl Laboratories) como descrito anteriormente [27].

In vitro

morfologia

a morfologia da PHH anexado às placas revestidas com colagénio tratado com /sem Sal foi avaliada diariamente durante todo o período de cultura através de microscopia de contraste de fase.

imunofluorescência

PHH foram cultivadas em lâminas de câmara revestidos com colagénio em 5 × 10

4 células /câmara. Após 24 h-incubação com concentrações variáveis ​​de Sal (0-10