Sumário

18β-glycyrrhetinic ácido (18β-GA) é um componente bioativo de alcaçuz. A actividade anti-cancro de 18β-GA foi estudado em diversos tipos de cancro, enquanto que os seus efeitos no cancro do pulmão permanecem em grande parte desconhecida. Em primeiro lugar, mostrou que 18β-GA eficazmente suprimiu a proliferação celular e inibiu a expressão, bem como a actividade de sintase de tromboxano (TxAS) no cancro do pulmão de células não-pequenas células (A549 NSCLC) e NCI-H460. Além disso, a administração de 18β-GA não tem qualquer efeito inibitório adicional sobre a diminuição da proliferação de células induzida por transfecção com TxAS pequena interferência de ARN (ARNip). Além disso, 18β-GA não conseguiu inibir a proliferação celular nas células epiteliais brônquicas humanas imortalizadas outra linha de células NSCLC NCI-H23, ambos os quais expressa nível mínimo de TxAS em comparação com A549 e NCI-H460 16HBE-T e. No entanto, 18β-GA aboliu o aumento da proliferação de células induzida por transfecção de NCI-H23 com o plasmídeo pCMV6-TxAS. Outras estudo verificou que a activação de ambos regulada por sinal extracelular quinase (ERK) 1/2 e elemento de resposta cíclico de adenosina monofosfato de proteína (CREB) induzida por cDNA TxAS transfecção de ligação pode ser totalmente bloqueado pela 18β-GA. No total, temos delineado que, através da inibição TxAS e sua sinalização ERK iniciada /CREB, 18β-GA suprime a proliferação de células NSCLC. Nosso estudo destacou a importância do 18β-GA no que diz respeito à prevenção e tratamento do NSCLC

Citation:. Huang R-Y, Chu Y-L, Huang Q-C, Chen X-M, Jiang Z-B, Zhang X, et al. Proliferação Celular (2014) 18β-glicirretinico Ácido Suprime através da inibição de sintase de tromboxano em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (4): e93690. doi: 10.1371 /journal.pone.0093690

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de dezembro de 2013; Aceito: 09 de março de 2014; Publicação: 02 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio : Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.302.799), China Pós-Doutorado Science Foundation (No. 2013M531838) e 2012 Excelente Jovem Fundação cientista da Universidade de Guangzhou de Medicina chinesa (No. KAB111133K08). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As ervas usadas na medicina tradicional proporcionar um reservatório rico para extrair compostos biologicamente ativos. Por exemplo, alcaçuz tem sido frequentemente utilizada na medicina oriental por milhares de anos, e o seu principal componente ácido glicirrízico bioactivo possui diversas actividades biológicas, farmacológicas, e medicinais, que são semelhantes aos dos retinóides e esteróides [1]. ácido glicirrízico é prontamente hidrolisado para 18β-GA no corpo humano, exercendo assim os seus anti-inflamatórios, anti-virais e anti-cancro mesmo efeitos [2] – [4]. Embora potencial quimiopreventivo de 18β-GA tem sido documentada em muitos tipos de células cancerosas, tais como o carcinoma humano epitelial do ovário, cancro da mama e glioblastoma [5] – [7], pouco se sabe sobre os efeitos de 18β-GA no crescimento do tumor de pulmão .

o cancro do pulmão é o crescimento descontrolado de células anormais no tecido do pulmão. Mais de 1,5 milhões de mortes em todo o mundo são de câncer de pulmão, que excedam as de quaisquer outras doenças malignas [6]. Entre os muitos subtipos, NSCLC é responsável por 80% de todos os casos de câncer de pulmão [8]. Até recentemente não havia estratégias terapêuticas satisfatórias para a gestão das NSCLC. TxAS foi observada a ser sobre-expressos em amostras de NSCLC, em comparação com tecidos normais do pulmão [9] – [11]. Em tecidos de cancro, TxAS está localizado a jusante de ciclooxigenases (COX-2), e pode sintetizar tromboxano A2 (Tx) a partir da prostaglandina (PG) H2, o qual é convertido por COXs a partir de ácido araquidónico (AA) [12]. A meia-vida biológica de TxA2 é de cerca de 30 s em modelos in-vitro, de modo TxA2 é rápida e não-enzimaticamente degradado para uma forma inactiva de TxB2 em solução aquosa [12], [13]. Assim, TXA2 actua como um parácrino /hormona autócrino com efeitos potentes da agregação de plaquetas, a vasoconstrição, proliferação de células tumorais e invasão [12], [14]. Os efeitos de TxA2 são mediadas através da interacção com o seu receptor específico, o receptor de tromboxano (TP), que é um membro da família de receptores da superfície celular acoplado à proteína G [12], [13]. Durante os últimos 5 anos, TxAS e seu TP relacionada têm sido extensivamente estudadas na pesquisa do câncer. O papel positivo de TxAS e TP na patologia tumoral é, por conseguinte, estabelecido, e os seus inibidores /antagonistas têm sido sugeridos para ser os agentes anti-cancerígenos promissores [10], [15]. Recentemente, foi relatado que tanto a montante e a sua TxAS COX-2 são controlados por TP, e TxAS é capaz de promover o crescimento do tumor de pulmão através deste circuito de realimentação de auto-regulação [16]. Curiosamente, em células endoteliais humanas, os efeitos de agonista de TP pode ser mimetizado por 18β-GA com um curso de tempo similar eficácia e [17], o que sugere uma associação entre TxAS moleculares 18β-GA e.

Assim, nós investigaram o possível efeito an-câncer do 18β-GA em células NSCLC. Relatamos aqui que 18β-GA poderia suprimir a proliferação celular e induzem a apoptose em células NSCLC através, pelo menos em parte, inibindo a expressão e actividade TxAS. Tais efeitos podem vir a ser de grande relevância clínica.

Materiais e Métodos

cultura de células e substâncias químicas

As linhas de células de adenocarcinoma de pulmão humano NCI-H23, NCI-H460 e A549, assim como uma linha brônquica humanas imortalizadas de células epiteliais 16HBE-T foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). Ambas as células NCI-H23 e 16HBE-T foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), e NCI-H460 e A549 células foram cultivadas em meio RPMI 1640. Todas as células foram mantidas em meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) numa atmosfera contendo 5% de CO2 a 37 ° C.

18β-GA e ácido araquidónico foram comprados na Sigma-Aldrich, e cisplatina foi fornecido por ALADDIN Chemical Co. (Xangai, China)., Ltd.

proliferação celular ensaio

As células foram semeadas a 5000 células por poço em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. Após o tratamento apropriado, o número de células viáveis ​​foi quantificado nos pontos de tempo indicados, utilizando o ensaio de MTS, realizada em quadruplicado, de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI). A absorvância foi determinada utilizando um leitor de placas de micro no comprimento de onda de 492 nm.

análise de citometria de fluxo

As células foram semeadas a 1 x 10

5 células /10 ml em placas de 6 poços e incubadas durante a noite. As células vivas foram recolhidas e lavadas duas vezes por PBS gelado. As células foram coradas com corante de fluoresceína Anexina V e iodeto de propídio (PI) à temperatura ambiente no escuro durante 15 min. As células foram depois recolocadas em suspensão em 400 de tampão de ligação a Anexina ul (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). As células coradas foram mantidas em gelo e analisadas por Beckman Fluxo Citómetros.

Ensaio imunoenzimático (EIA) ensaio de actividade

TxAS foi monitorizada testando o nível de tromboxano B2 (TxB2), um produto estável da hidratação não-enzimática de TxA2 [12]. As células A549 e NCI-H460 foram semeadas à mesma densidade de 1 × 10

5 células /10 ml de meio numa placa de cultura de 6 poços. O sobrenadante da cultura foi recolhido e centrifugado, seguido do tratamento adequado. TxB2 foi detectada pelos conjugados marcados com peroxidase TxB2 utilizando um kit de imunoensaio enzimático de acordo com as instruções do fabricante (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

transfecções transientes

As células foram semeadas à mesma densidade de 1 × 10

5 células /10 ml de meio numa placa de cultura de 6 poços. 10 nM TxAS siRNA e não-alvo ARNsi (controlo) foram transfectados em A549 e NCI-H460, enquanto 2 ug pCMV6 vazio (controlo) ou o plasmídeo pCMV6-TxAS foi transfectado em NCI-H23, com o auxílio de reagentes Lipofectamine 2000 (Invitrogen , Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante (tecnologias OriGene, Rockville, MD). A extensão do silenciamento de genes específicos ou a sobre-expressão foi detectada por ensaio PCR em tempo real.

A sequência de TxAS siARN é rGrUrArArCrUrUrUrArCrCrArArCrArGrArArUrGrGrCrGTC. As condições para transfecções siRNA são como segue: As células foram cultivadas a uma densidade de 70% com a forma padrão. Após remoção do meio, as células foram incubadas com DMEM (sem antibióticos) pré-misturado contendo siARN (10 nM) e 7,5 ul de Lipofectamina reagente de 2000, e foram ainda incubadas durante 72 h.

transcriptase reversa (TR) -PCR e PCR em tempo real quantitativo

RT-PCR e PCR em tempo real quantitativa foram realizados como previamente descrito [16]. Foram usadas as seguintes sequências iniciadoras específicas do gene: 5′-AATAAGAACCGAGACGAACT-3 ‘(sentido) e 5′-GGCTTGCACCCAGTAGAG-3′ (anti-sentido) para TxAS humanos; 5’-GGAAATCGTGCGTGACATT-3 ‘(sentido) e 5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’ (anti-sentido) para β-actina humana. PCR em tempo real foi realizado utilizando o CFX96 toque profundo Bem ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Berkeley, CA). A mudança de dobragem de controlo da expressão de ARNm TxAS foi calculada pela 2

-ΔΔCT método.

Análise Western Blot

de proteína total (20 ug) foi resolvido por SDS-7% electroforese em gel de poliacrilamida e sujeito a análise western blot utilizando o sistema de detecção quimioluminescente mais avançada (Bio-Rad Laboratories). As transferências de Western foram sondadas com um anticorpo monoclonal de ratinho contra TxAS (tecnologias OriGene), um anticorpo policlonal de cabra contra β-actina (Santa Cruz Biotechnology), e os anticorpos policlonais de coelho contra a GAPDH, PARP, ERK1 total e fosforilada /2, bem como o total e CREB fosforilada (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Para garantir um carregamento de proteína igual, as membranas foram retirados e subsequentemente sondadas com anti-GAPDH ou anticorpos anti-β-actina.

Análises Estatísticas

Os dados são representados como média ± DP a partir de pelo menos três independente experimentos. O teste t de Student foi utilizado para as comparações entre dois grupos, enquanto a One-way ANOVA seguido pelo teste de Dunnett foi adotada para comparar as diferenças entre mais de dois grupos. As análises estatísticas foram realizadas por SPSS 11.6 software estatístico (SPSS, Chicago, IL). Um valor P bicaudal de . 0,05 foi considerado estatisticamente significante para todos os experimentos

Resultados

18β-GA suprimiu a proliferação celular através da indução de apoptose

Ambos A549 e NCI-H460 são linhas celulares de NSCLC. O primeiro pertence ao adenocarcinoma, e o último é uma linha celular de cancro de pulmão de células grandes. A avaliação do número de células viáveis ​​por ensaio MTS demonstrou que 24 horas de tratamento 18β-GA suprimiu a proliferação celular em ambas as linhas celulares de um modo dependente da dose (Figura 1A). Anterior estudo in vitro mostraram que o IC

50 valor de 18β-GA para inibir o crescimento de células de cancro de pulmão era 145,3? M [18]. Como mostrado na Figura 1A e 1B, 18β-GA em 160 uM diminuiu significativamente a percentagem de células viáveis ​​para cerca de 40,5 ± 10,5%, em A549 e 38,3 ± 4,6% em NCI-H460 (p 0,01, respectivamente). Quando as células foram tratadas com 320 uM 18β-GA, um maior efeito inibitório sobre a proliferação de células foi demonstrado, como a percentagem de células viáveis ​​foi inferior a 30% em comparação com controlos não tratados (p 0,001). Portanto, verificou-se que 160 uM 18β-GA era uma concentração óptima para atingir uma supressão significativa da proliferação celular em células NSCLC.

A e B, as experiências mostraram que MTS 18β-GA inibiu a proliferação celular de A549 e NCI -H460 células de uma forma dependente da dose. Além disso, 18β-GA aumentou a citotoxicidade de cisplatina agente quimioterapêutico. Os dados são expressos como média ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. * P 0,05, ** p 0,01. C, a análise Western blot demonstrou o aumento da PARP clivada (85 kDa) com a diminuição da PARP comprimento total (116 kDa) em A549 e as células NCI-H460 tratadas com 18β-GA. GAPDH (37 kDa) serviu como o controlo da carga. D, citometria de fluxo e apoptose celular. Percentagem de células em apoptose precoce ou tardia é fornecida nos quadrantes inferiores e superiores do direita, respectivamente. Os números são o resultado representante selecionado entre três experiências independentes.

A cisplatina é parte do padrão de cuidados para pacientes com câncer de pulmão. Para determinar a possibilidade de que 18β-GA poderia ter um efeito aditivo à cisplatina na proliferação de células tumorais, ambas as linhas de células testadas foram cultivadas na presença de 5 ug /mL de cisplatina isoladamente ou 5 ug /cisplatina ml junto com 80 uM 18β-GA. Quando tratados com cisplatina isolada, a percentagem de células viáveis ​​foi apenas diminuiu em 20,5 ± 6,8% na A549 e 38,7 ± 6,0% em NCI-H460 em comparação com o controlo (p = 0,076 e 0,041, respectivamente, a Figura 1A e 1B). No entanto, quando combinado com 80 uM 18β-GA, que tinham um efeito sinérgico em ambas as linhas celulares. tratamento em ambas as linhas celulares, a taxa de supressão depois combinada foi inferior a 40% dos controlos (p 0,01)., semelhante à eficácia de 160 uM por si só 18β-GA

Para confirmar os dados observados por ensaios de MTS e para determinar se a supressão da proliferação de células foi, em parte, devido a um aumento da apoptose, PARP clivada foi medido por transferência de Western utilizando um anticorpo policlonal de coelho PARP detecção tanto de comprimento completo e formas clivadas. Tal como ilustrado na figura 1C, o tratamento com 18β-GA em 160 uM e 320 uM diminuiu os níveis de PARP de comprimento completo e aumentaram os níveis de PARP clivada pela. Este resultado foi ainda confirmada por análise de citometria de fluxo que foi utilizado para medir a rotulagem anexina-V a fosfatidilserina, um fosfolípido de membrana expostas na superfície de células apoptóticas [19]. Após 24 h de tratamento com 160 uM 18β-GA, as células foram coradas com anexina-isotiocianato de fluoresceína-V e PI. Tal como ilustrado na figura 1D, a fracção de células em apoptose precoce, indicados por células PI-positivas, foi significativamente maior nos grupos tratados com 18β-GA (cerca de 3,5 vezes superior para A549, e cerca de 3,9 vezes para NCI-H460, respectivamente ; P 0,001). Além disso, as células mais apoptóticas foram encontrados no tratamento de cisplatina combinada com 18β-GA do que o tratamento da cisplatina isoladamente, apoiando ainda mais que 18β-GA tem um efeito aditivo à cisplatina.

18β-GA inibiu a expressão e actividade TxAS

estudos anteriores implicado um papel potencial de TxAS na patogênese de vários tipos diferentes de câncer, incluindo NSCLC [10], [16]. Estudámos, portanto, se 18β-GA poderia afetar TxAS expressão e atividade. A análise Western blot mostrou que 18β-GA diminuiu o nível de proteína TxAS no tempo e um modo dependente da dose (Figura 2A e 2B). Consistente com efeito apoptótico de 18β-GA mostrado na figura 1, 12 h de tratamento 18β-GA em 160 uM e 320 uM diminuiu dramaticamente os níveis TxAS. Além disso, 18β-GA (160 uM) inibiu o nível de TxAS tão cedo quanto 3 h em NCI-H460 e A549 em 6 h após o tratamento. mRNA também foi extraído a partir de células tratadas com 160 uM 18β-GA durante 6 h, 12 h e 24 h e posteriormente submetido a real-time PCR experiências. Figura 2C demonstrou que o nível de ARNm TxAS foi significativamente diminuído por 18β-GA de uma maneira dependente do tempo, o que está em conformidade com os dados observados por análise de Western blot.

A e B, análise de transferência de Western verificou que 18β -GA inibiram a expressão da proteína de TxAS (60 kDa) de uma maneira dose e dependente do tempo. Actina (45 kDa) serviu como o controlo da carga. A figura mostrada é representativa de três experiências independentes, e para densitometria blots foi mostrado no painel da direita da fig A e o painel inferior de fig.B. * P 0,05 e ** P 0,01 em relação ao controle. C, PCR em tempo real revelou que a expressão de ARNm TxAS poderia ser reduzida por 18β-GA de um modo dependente do tempo. Se atreve são expressos como a dobra de controlo, o qual foi calculado por 2

-ΔΔCT método baseado nos dados observados a partir de três experiências independentes realizadas em triplicado. * P 0,05 e ** P 0,01. D e E, os ensaios EIA TxB2 demonstraram os efeitos de 18β-GA em actividade TxAS em ambas as células A549 e NCI-H460 na ausência ou na presença de 0.4μM AA. Os dados são expressos como média ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. ** P 0,01 quando comparado com o controlo, # p 0,01 quando comparado com o tratamento de AA

Além disso, o efeito de 18β-GA em actividade TxAS foi medida subsequentemente.. Como referido acima, TxA2 é quimicamente instável in vitro, actividade TxAS é, portanto, monitorizado testando o nível de TxB2, um produto estável da hidratação não-enzimática de TxA2 [16]. Ambas as células A549 e NCI-H460 foram tratados com 160 ^ M 18β-GA durante 24 h, e o meio de cultura foi recolhido para executar o TxB2 ensaio EIA. Nestas experiências, as células tratadas com 0,4 uM de AA que é o precursor de TxA2 serviu como controlo positivo, e as células tratadas com inibidor específico TxAS furegrelate (1 mM) serviram como controlos adicionais. As doses seleccionadas destes produtos químicos são comparáveis ​​com as concentrações utilizadas no in-vitro experiências relatadas em outros estudos [16], [20]. Como mostrado na Figura 2D e 2E, em ambas as linhas celulares, a biossíntese de TXA2 foi significativamente suprimida por 18β-GA na ausência ou na presença de AA. 0,4 mM AA induzida TxB

2 por 1,8 vezes-em células A549 (p 0,01) e 2,8 vezes em células NCI-H460 (p 0,01) em relação ao controle. No entanto, a adição de 160 uM 18β-GA atenuou significativamente TxB

2 induzida-AA em cerca de 91% na A549 e 89% em NCI-H460 (p 0,001, respectivamente). Importante, 18β-GA a 160 uM é equivalente em termos de eficácia para furegrelate 1 mM. Estes resultados sugerem fortemente que o 18β-GA é capaz de revogar atividade TxAS em células NSCLC.

Em conjunto, os dados de que 18β-GA pode inibir significativamente a expressão e atividade da TxAS implica que 18β-GA pode suprimir celular a proliferação através da inibição de ação TxAS.

18β-GA não teve efeitos adicionais sobre a proliferação celular quando TxAS foi derrubado

Para verificar a possibilidade de que 18β-GA pode suprimir a proliferação celular através da inibição TxAS, nós derrubado TxAS expressão em células A549 e NCI-H460 utilizando siRNA transfecção e 160 uM 18β-GA foi subsequentemente adicionada, durante 24 h. Não-alvo ARNsi também foi transfectada em ambas as linhas celulares para servir como controlo. PCR em tempo real indicaram que a expressão de TxAS em ambas as linhas celulares foi significativamente suprimida por 24 h a transfecção de TxAS siRNA, com cerca de 90% de eficácia de supressão (Figura 3A). A eficácia da transfecção foi ainda confirmada por análise de Western blot (Figura 3B). Após a adição de 160 uM 18β-GA durante mais 24 h, os ensaios de MTS foram realizados e os resultados mostraram que as taxas de proliferação de células A549 tratadas com 18β-GA, TxAS siRNA, e a combinação de ambos foram 41,7 ± 1,7%, 38,3 ± 4,4% e 35,4 ± 6,4% do controlo, respectivamente (Figura 3C). Em células NCI-H460, que eram de 38,9 ± 3,7%, 31,1 ± 3,4% e 28,4 ± 8,0% do controlo, respectivamente (Figura 3D). Parece que, em comparação com TxAS-siRNA transfecção, a administração adicional de 18β-GA não tem quaisquer efeitos adicionais significativos sobre a proliferação celular.

A e B, a eficácia supressora de siRNA na expressão TxAS foi revelado pelo Real -tempo de PCR e análise de Western blot. Os dados de PCR em tempo real foram observadas a partir de três experiências independentes realizadas em triplicado e calculados por 2

-ΔΔCT método. Os dados são apresentados como a dobra de controlo, ** P 0,01. C e D, os ensaios mostraram que TxAS MTS-transfecção siRNA inibiu a proliferação de células A549 e no NCI-H460, e a administração adicional de 18β-GA não tinham efeitos aditivos. Os dados são apresentados como porcentagens do controle e expressos em média ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. ** P 0,01

De nota, o resultado que siRNA de TxAS reduziu significativamente o crescimento celular, que está em linha com os dados observados em nossos estudos anteriores que mostram que TxAS inibidor específico furegrelate pode dramaticamente inibir. o crescimento celular em células de câncer de pulmão [11], [16]. Em apoio dos nossos dados, Cathcart MC et al mostrou que mais TxAS inibidor ozagrel inibiu a proliferação celular através da indução de apoptose em células NSCLC [10], e Moussa O et al mostrou que TxAS shRNA suprimiu o crescimento de células de câncer de bexiga [19]. Além disso, Nie D et al observado que a motilidade de células tumorais da próstata foi atenuada por inibidores de TxAS [21].

supressão da proliferação celular por 18β-GA foi associado com o estado de TxAS

Os resultados observados acima suportado que os efeitos inibidores de 18β-GA pode ser devido à supressão de células NSCLC na TxAS. Para verificar ainda mais esta possibilidade, o próximo exibido uma série de linhas de células de pulmão para a expressão de TxAS. experiências de RT-PCR demonstrou que, em comparação com A549 e NCI-H460, uma linha imortalizada de células epiteliais brônquicas humanas 16HBE-T e uma outra linha de células NSCLC NCI-H23 expressa nível mínimo de TxAS (figura 4A). Estas duas linhas de células foram tratadas com concentrações crescentes de 18β-GA durante 24 h, e ensaio MTS foi realizado para detectar a proliferação de células. Como mostrado na Figura 4B e 4C, 18β-GA não conseguiu suprimir a proliferação celular em ambos 16HBE-T e NCI-H23, embora com uma ligeira tendência de supressão. A taxa de supressão na dose de 500 ^ M não foi mais do que 20% do controlo em ambas as linhas celulares.

A, o nível mínimo de TxAS em 16HBE-T e NCI-H23 e a expressão excessiva de TxAS em A549 e NCI-H460 foram revelados por RT-PCR. A figura mostrada é representativa de três experiências independentes. B e C, MTS demonstraram que, enquanto houve uma tendência inibidor ligeiro, 18β-GA não conseguiu controlar a proliferação de células em 16HBE-T e NCI-H23. Os dados são apresentados como porcentagens do controle e expressos em média ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. D e E, a expressão TxAS em NCI-H23 foi sobre-expressa através de transfecção com o plasmídeo pCMV6-TxAS. Os dados de PCR em tempo real foram observadas a partir de três experiências independentes realizadas em triplicado e calculados por 2

-ΔΔCT método. Os dados são apresentados como a dobra de controlo, ** P 0,01. F, ensaios MTS mostrou que a promoção da proliferação de células por transfecção com pCMV6-TxAS foi anulada por 18β-GA. Os dados são apresentados como porcentagens do controle e expressos em média ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. ** P 0,01 quando comparado com o controlo, # p ., Em comparação com 0,01 pCMV6-TxAS transfecção

Como NCI-H23, que pertence a um adenocarcinoma, é uma linha de células NSCLC com o nível mínimo de TxAS, que sobre-expresso TxAS nesta linha de células, por transfecção com o plasmídeo pCMV6-TxAS. Vago plasmídeo também foi transfectado para servir como controlo. Figura 4D ilustrado que TxAS foi sobre-expresso cerca de 8,2 vezes maior do que o controle após 24 horas de transfecção com cDNA TxAS. A análise Western blot foi também realizada para confirmar a eficácia de transfecção (Figura 4E). As células foram subsequentemente tratadas com 160 uM 18β-GA durante mais 24 h. MTS experimentos demonstraram que a transfecção com cDNA TxAS acentuadamente promovida por proliferação celular 181,4 ± 3,6%, em comparação com o controlo (p 0,001), o efeito foi suprimido pela adição de 18β-GA. A taxa de proliferação celular foi significativamente reduzida por 18β-GA para 111,2 ± 2,2% do controle, quase mesmo com o nível de controle (figura 4F). Estes resultados suportam que o efeito da 18β-GA em NSCLC está associado com a mudança de expressão TxAS.

Sinalização

ERK /CREB foi envolvida nos efeitos 18β-GA

Em nossos estudos anteriores, demonstraram que a activação de ERK e CREB tanto pode ser inibida por inibidores ou antagonistas TxAS TP, e a activação da CREB é suprimida pelo inibidor específico de ERK [11], [16]. TxAS via /ERK /CREB também é abordada por outros estudos feitos no modelo de cancro do pulmão [22], [23]. Portanto, a última série de experiências de transferência de Western foram realizados para investigar se a via de ERK /CREB foi envolvido nos efeitos de supressão de tumor de 18β-GA. Como mostrado na Figura 5A, as células transfectadas com pCMV6-TxAS apresentou os níveis mais elevados de ERK1 /2 (P-ERK1 /2) e CREB fosforilado (p-CREB), os efeitos foram drasticamente atenuado por tratamento de 160 uM 18β- GA. O resultado está em linha com os dados observados pelo MTS ensaios (figura 4F). Além disso, determinou-se os efeitos de 18β-GA em activação de ERK /CREB em A549 e NCI-H460, ambos os quais apresentam níveis elevados de TxAS como pode ser visto na figura 4A. Figura 5B mostrou que a sub-regulação de TxAS por siARN bloqueado ERK1 fosforilação 2 /em células A549 e H460. Consistentemente, 160 uM 18β-GA eficazmente suprimidos os níveis elevados de P-ERK e p-CREB nestas duas linhas celulares. Nenhuma alteração era detectável em relação à expressão de CREB total de ERK ou total em todas as linhas celulares testadas.

A, experiências de transferência de Western demonstrou que a activação de ERK1 /2 (42/44 kDa) e CREB (43 kDa) induzida por pCMV6-TxAS transfecção pode ser abolido por 18β-GA em células NCI-H23. A figura mostrada é representativa de três experiências independentes, e para densitometria blots foi mostrado no painel da direita. * P 0,05 ** p 0,01 como comparado com o controlo; # P 0,05 e ## p 0,01 quando comparado com o tratamento 18β-GA em células transfectadas com plasmídeo vazio. B, a supressão de ERK1 /2 e a activação da CREB por TxAS-siRNA e 18β-GA em A549 e NCI-H460 foi revelada por análise de Western blot. Nestas experiências, ERK1 Total /2 (42/44 kDa), CREB total (43 kDa) e actina (45 kDa) serviram como controlos de carga. Um anticorpo monoclonal que se pode detectar os níveis endógenos de p-CREB e a forma fosforilada da proteína relacionada com o factor de transcrição CREB activando-1 (p-ATF-1) foi utilizado no presente estudo. A figura mostrada é representativa de três experiências independentes, e para densitometria blots foi mostrado no painel da direita. * P 0,05 em relação ao controle

Discussão

Como uma das ervas frequentemente utilizadas na medicina oriental com baixa toxicidade, alcaçuz é de US Food and Drug Administration (FDA) aprovou. suplemento alimentar usado em diversos produtos. Como afirmado acima, ácido glicirrízico, é a principal componente bioactivo e que é prontamente hidrolisado para ser 18β-GA no corpo humano para exercer efeitos diferentes, incluindo a actividade anti-cancro [1] – [4]. Este estudo demonstrou o efeito de supressão de tumor de 18β-GA em células NSCLC, e TxAS foi encontrado para ser implicados neste efeito.

Inicialmente mostrou que 18β-GA dependentemente da dose diminuiu a proliferação celular em células A549 NSCLC e NCI-H460. O ID50 de 18β-GA em células HepG2 foi de 80? M [24], ao passo que em nosso modelo a dose de 160? M diminuição da taxa de proliferação celular abaixo de 50% do controle, o que está de acordo com um relatório anterior mostrando que o IC

50 valor de 18β-GA foi de 145,3 pM em uma linha celular de cancro do pulmão altamente metastático potencialmente PGCL3 [18]. 80 uM 18β-GA em combinação com a cisplatina produziram um efeito significativo-supressor de tumor, apesar de 18β-GA sozinho a 80 uM teve nenhuma eficácia eficaz para matar células cancerosas. Este resultado sugere que o efeito sinérgico de 18β-GA em agente quimioterapêutico. A549 apresentaram maior resistência à cisplatina em comparação com as células NCI-H460, o que está de acordo com outros estudos que demonstram que a A549 é mais resistente à cisplatina do que algumas outras linhas de células [25], [26]. A análise de transferência de Western apresentaram ainda mais o aumento da-PARP clivada com a PARP de comprimento total diminuiu nas células tratadas com 18β-GA, nas doses de 160 uM e 320 uM. Assim, a alteração no número de células viáveis ​​totais às 24 h após o tratamento com 18β-GA observado em experiências MTS pode ser atribuído ao aumento da apoptose, o que é confirmado pelos dados observados através de análises de citometria de fluxo. Colectivamente, parece que 18β-GA é um agente anti-cancro promissor para aplicação na prevenção e tratamento de NSCLC.

Procedeu-se a examinar os mecanismos moleculares pelo qual 18β-GA exerce efeito supressor de tumor em células NSCLC. Em virtude de catalisar a formação de TxA2, que funciona através do seu receptor de TP, TxAS tem sido demonstrado que têm um potencial papel no fenótipo do cancro [10], [11], [14] – [16]. Importante, e o seu produto TxAS TxA2 foram encontrados a ser sobre-expressos em tecidos de cancro do pulmão, em comparação com tecidos normais do pulmão [9] – [11], [27]. Um relatório anterior mostrando que o 18β-GA é o equivalente em eficácia a um agonista TP em células endoteliais humanas [17] levou-nos a perguntar se TxAS foi implicado em efeitos 18β-GA em NSCLC. Esta hipótese também foi iluminado por um fato que o ácido glicirrízico, o precursor do 18β-GA, age em parte através da inibição da COX-2 [28], que fornece PGH2 para TxAS para catalisar a formação TxA2 [12], [29]. Juntamente com os resultados de que 24 h de tratamento 18β-GA dependentemente da dose suprimiu a proliferação celular e a apoptose induzida, a redução de TxAS por 12 h de tratamento 18β-GA sugere que o 18β-GA induzida por inibição da TxAS é um evento de montante a inibição do crescimento e apoptose em NSCLC, que é ainda apoiada pelas seguintes experiências curso de tempo. Além disso, os níveis de mRNA de TxAS poderia ser reduzida por 18β-GA de uma maneira dependente do tempo, o que implica que 18β-GA inibida TxAS expressão a nível da transcrição. Além disso, a actividade TxAS, reflectido pelo nível TxB2 segregada no meio de cultura, foi drasticamente inibida por 18β-GA. Estes resultados sugerem que TxAS poderia ser uma base molecular crucial do efeito 18β-GA em células NSCLC. Por transfecção com TxAS-siRNA, a capacidade proliferativa das células de ambos A549 e NCI-H460 foi efetivamente inibida, apoiando ainda mais o papel positivo da TxAS no cancro do pulmão [10], [11], [16]. Importante, a administração adicional de 18β-GA não têm os efeitos aditivos na TxAS-siRNA transfecção. Para confirmar estes resultados, foram pesquisados ​​uma série de linhas de células de pulmão para determinar a expressão de TxAS. NSCLC é qualquer tipo de cancro do pulmão epitelial que não carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC), portanto, utilizado 16HBE-T que é uma linha epitelial bronquial humana imortalizada de células para servir como controlo de linhas celulares de NSCLC. De acordo com outros estudos [9] – [11], nível TxAS foi encontrado para ser mínima em 16HBE-T, enquanto que era sobre-expressa em células A549 NSCLC e NCI-H460. Outra linha de células NSCLC NCI-H23 também expressou nível mínimo de TxAS, tornando-o modelo ideal para transfecção de cDNA TxAS. Como esperado, 18β-GA não conseguiu suprimir eficazmente a proliferação de células de 16HBE-T e NCI-H23. Verificou-se que os efeitos de diferentes 18β-GA em todas estas linhas celulares eram devidas à diferença de expressão TxAS.