Sumário

A hipoxia tem sido há muito tempo reconhecido como importante microambiente-promoção do câncer. Em uma condição tão restritiva em termos energéticos, mecanismos de pós-transcricional ganhar importância ao longo da maquinaria de transcrição do gene caro em termos energéticos. Aqui mostra-se que o aparecimento de características de células estaminais cancro induzida por hipoxia requer o pós-transcricional sobre-regulação de beta-catenina-dependente de CA9 e expressão do gene SNAI2. Em resposta a hipoxia move-se, beta-catenina a partir da membrana plasmática para o citoplasma, onde se liga e estabiliza SNAI2 e CA9 ARNm, em cooperação com a proteína estabilizante ARNm Hur. Nós também fornecemos evidências de que a atividade pós-transcricional de citoplasmática beta-catenin opera sob normoxia em células de câncer de mama triplo-negativo /basal-like, onde o knockdown beta-catenin suprime o fenótipo de células-tronco

in vitro Comprar e o crescimento do tumor

in vivo

. Em tais células, que desvendar o envolvimento generalizada da maquinaria de beta-catenina-driven na estabilização de mRNAs induzida por EGF, incluindo o regulador de células estaminais cancro IL6. Nosso estudo destaca o papel crucial dos mecanismos de pós-transcricional na manutenção /aquisição de características de células-tronco do câncer e sugere que o impedimento da função beta-catenin citoplasmática pode representar uma estratégia sem precedentes para alvejar as células-tronco do câncer de mama /basal-like.

Citation: D’Uva G, Bertoni S, Lauriola M, De Carolis S, Pacilli A, D’Anello L, et al. (2013) beta-catenina /Hur pós-transcricional Machinery Cancer governa Stem Características celular em resposta à hipóxia. PLoS ONE 8 (11): e80742. doi: 10.1371 /journal.pone.0080742

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de julho de 2013; Aceito: 07 de outubro de 2013; Publicação: 15 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 D’Uva et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho tem sido apoiada por: Ministério Italiano de Educação, Universidades e Investigação Científica concessão PRIN 2008KTRN38 “Clínica, implicações diagnósticas e terapêuticas de estudos sobre o cancro da mama células-tronco” para MT e MB; Cassa di Risparmio em Bolonha Foundation “Ruolo della Regolazione della Síntese proteica nelle cellule staminali del Câncer” (n. 135 /2010-0102) para LM e MB. fundos ORP ex 60%, Cornelia e Roberto Pallotti Foundation (n. 2011-110512) para MB. Os autores agradecem a Fondazione Cassa di Risparmio de Bolonha e Fondazione Banca del Monte e Ravenna para suportar o Center for Applied Biomedical Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as células-tronco são abrigados em nichos especializados onde a tensão baixa de oxigênio (hipoxia) contribui para a regulação de auto-renovação e diferenciação [1-3]. Na verdade, a hipóxia mantém o estado indiferenciado das embrionárias, hematopoéticas, mesenquimais e células neuronais estaminais /progenitoras [2]. Hipoxia em tumores está associado com mau prognóstico [4]. As células em regiões tumorais hipóxicas estabilizar hipoxia-inducible-fatores (HIFs) e activar a expressão do gene adaptativa levando a agressividade do câncer através da célula de sobrevivência e desdiferenciação [1,5]. Além disso, a actividade de HIF num subconjunto raro de células tumorais hipóxicas confere haste propriedades semelhantes a células [1-3].

Beta-catenina é um regulador fundamental da célula normal e cancro da haste de auto-renovação [6,7 ]. Em resposta a vários estímulos, beta-catenina induz a expressão de genes alvo por vaivém para o núcleo, onde interage com factores de TCF /LEF de transcrição da família [6].

interacção física entre HIF-1alfa, a maior jogador, em resposta a hipoxia, e beta-catenina foi descrito [8]. Além disso, beta-catenina e HIF-1alfa sinergicamente facilitar a sobrevivência hipóxia em células de câncer de cólon e auto-renovação em células-tronco neurais [8,9].

A hipoxia é uma condição restritiva de energia, o que diminui acentuadamente total de

de novo

transcrição e promove a regulação pós-transcricional de poupança de energia de mRNAs pré-existentes [10-12]. Estudos recentes relatam que a beta-catenina modula a meia-vida de mRNAs citoplasmáticos [13-17]. Estes dados levam a supor-nos que a actividade pós-transcripcional de beta-catenina desempenha um papel importante na adaptação das células cancerosas à hipóxia. Aqui foi analisada a papel de beta-catenina na produção e estabilização de dois genes reguladores de células estaminais do cancro da mama importantes, isto é, anidrase carbónica 9 (CA9) e SNAI2 mRNAs. A expressão de genes e CA9 SNAI2 é induzida por hipoxia, através da sobre-regulação da transcrição mediada por HIF1-alfa [18-20]. CA9 expressão regula o pH no microambiente hipóxico para promover a sobrevivência e proliferação de células estaminais do cancro [21,22]. Portanto CA9 tem sido sugerido como um alvo de terapia anti-cancro [23,24]. SNAI2, também conhecido como SLUG, é um supressor funcional importante do compromisso humano progenitor mama linhagem celular e diferenciação, promovendo-tronco normais e tumor da glândula mamária /estado células progenitoras [25,26].

aqui relatam que a acumulação citoplásmica de beta-catenina em resposta a hipoxia activa um programa de diferenciação e de sobrevivência pós-transcricional, o que aumenta a haste características de células em células de cancro da mama. O fenômeno depende da capacidade dos citoplasmática beta-catenin para ligar e estabilizar SNAI2 e CA9 mRNAs. Nós também fornecemos evidências de que a atividade pós-transcricional de citoplasmática beta-catenin opera sob normoxia em células de câncer de mama triplo-negativo /basal-like. O cancro da mama /triplo-negativa basal semelhante é um subtipo do cancro da mama pouco diferenciados e agressivo, caracterizado por a expressão do gene de um perfil de tipo célula-tronco [27,28], pela localização citoplasmática de beta-catenina [29-31 ] e por CA9 e SNAI2 gene superexpressão [32,33]. Em tais células, beta-catenin knockdown diminuiu drasticamente a estabilidade ea expressão de CA9 e SNAI2 mRNAs e embota o fenótipo de células-tronco

in vitro

ea capacidade de estabelecer xenotransplante

in vivo

. Além disso, o beta-catenina beta-catenina foi capaz de regular a estabilidade do ARNm de vários mRNAs induzida por EGF, entre os quais a citoquina pró-inflamatória interleucina 6 (IL6), um factor de crescimento do caule cancro reconhecida [21,34]. Os dados aqui relatados destacar o papel dos mecanismos de pós-transcricional na regulação dos recursos de células-tronco do câncer, e identificar beta-catenin como um jogador de pós-transcricional fundamental no fenótipo de células-tronco do câncer de mama. Propomos que o impedimento da atividade pós-transcricional beta-catenin aqui descrita representa uma estratégia ainda não explorado para alvejar as células-tronco do câncer de mama /basal-like.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, produtos químicos e de exposição a hipoxia

utilizadas células MCF7 como um modelo de carcinoma da mama luminal bem diferenciado e MDA-MB-468 e células MDA-MB-231 como um modelo de carcinoma da mama basal como pouco diferenciada [35 ]. Todas as linhas de células foram adquiridos a American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). MCF7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 foram cultivadas em meio RPMI-1640, meio DMEM /F12 e DMEM respectivamente. Todos os meios foram suplementados com 10% de FBS, 1% de penicilina e estreptomicina e 1% de glutamina Euroclone (Milão-Itália). Todas as culturas de células normóxicas foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2-atmosfera humidificada. Hipoxia (1% pO

2, 5% pCO

2, 94% pN

2) foi obtido em um

Invivo

300 hipóxia gabinete (Ruskinn Tecnologia, Bridgend, Reino Unido) para 48 h. A morte celular foi avaliada por coloração com azul de Tripano.

Geração de MS de tecidos de cancro da mama primário e linhas de células

MS a partir de tecidos das glândulas mamarias humanos foram obtidos como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, as amostras de tecido foram colocadas em meios estéreis Epicult (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), triturada com escalpelos esterilizados, e incubou-se durante 6-12 horas, na presença de 1000 U de colagenase /hialuronidase mistura de enzima (StemCell Technologies) e filtrou-se através de um 40 malha de nylon uM (Becton Dickinson), re-suspenso em completa MEGM e plaqueadas em 1cm

2 placas de fixação de baixo. geração secundário MS foi obtido através da incubação de MS primária ou consecutiva em 1 × solução de tripsina-EDTA (Cambrex), durante 3 minutos, ao longo de uma filtração de nylon de 40