Sumário

Foram utilizados perfis de expressão de proteína para desenvolver uma regra de classificação para a detecção e avaliação prognóstica do cancro da bexiga em amostras de urina anulado. Usando o ProteinChip Leitor Ciphergen PBS II, foram analisados ​​os perfis de proteínas de 18 pares de amostras de tumor de bexiga e tecido urotélio adjacente, um conjunto de treinamento de 85 amostras de urina anulada (32 controles e 53 cancro da bexiga), e um conjunto de teste cego de 68 amostras de urina anulada (33 controles e 35 com cancro da bexiga). Usando testes t, identificamos 473 picos que mostram expressão diferencial significativa entre diferentes categorias de tumor de bexiga emparelhados e amostras uroteliais adjacentes comparação com urotélio normal. Em seguida, as intensidades dessas 473 picos foram examinados em um conjunto de treinamento de amostras de urina anulado. Usando essa abordagem, foram identificados 41 picos de proteína que foram diferencialmente expressos em ambos os conjuntos de amostras. O padrão dos picos de proteína 41 expressão foi utilizada para classificar as amostras de urina vertida como maligna ou benigna. Esta abordagem originou uma sensibilidade e uma especificidade de 59% e 90%, respectivamente, no conjunto de treino e 80% e 100%, respectivamente, sobre o conjunto de teste. A regra de classificação proteômica realizada com precisão semelhante em baixa e bexiga de alto grau de carcinomas. Além disso, usamos agrupamento hierárquico com todos os 473 picos de proteína em 65 amostras de urina anulado benignos, 88 amostras de pacientes com câncer de bexiga clinicamente evidente, e 127 amostras de pacientes com história de cancro da bexiga para classificar as amostras em Cluster A ou B. os tumores em Cluster B foram caracterizados por um comportamento clinicamente agressivo com sobrevida livre de metástases e específica da doença significativamente menor

Citation:. Majewski T, Spiess PE, Bondaruk J, Black P, Clarke C, Bento W, et ai. (2012) Detecção de câncer de bexiga Usando Profiling proteômica de sedimentos de urina. PLoS ONE 7 (8): e42452. doi: 10.1371 /journal.pone.0042452

editor: William CS. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 09 de abril de 2012; Aceito: 06 de julho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Majewski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Grants R01 CA 151.489 (BC) e GU SPORE Grant P50 CA91846 (Project 1, BC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. CC era originalmente um empregado de Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Califórnia, no época do estudo inicial relacionadas com este projecto. Atualmente, ela está trabalhando no Gabinete do Vice-Presidente de Pesquisa Translacional da Universidade do Texas M D Anderson Cancer Center. Sua afiliação com Ciphergen não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Current conceitos patogênicos postular que neoplasias comuns da bexiga surgem na sua epitelial alinhando (urotélio), através de duas vias distintas, mas um pouco sobrepostas: papilar e vias nonpapillary. [1] Aproximadamente 80% dos tumores que surgem na bexiga são lesões papilares exofíticas que originam alterações uroteliais hiperplásicas. Eles normalmente se repetem, mas geralmente não invadem a parede da bexiga ou metástase. Os restantes 20% dos tumores de bexiga são agressivos, carcinomas nonpapillary com uma propensão para invadir e metástase. cancros da bexiga invasivos normalmente ocorrem em pacientes sem história de tumores papilares e se originam de

in situ

lesões pré-neoplásicas variam de leve a moderada displasia (neoplasia intraurothelial de baixo grau, LGIN) para displasia severa e carcinoma

em situ

(neoplasia intraurothelial de alta qualidade, HGIN). [2] A maioria dos carcinomas da bexiga agressivas de alto grau não-papilar presentes em um estágio avançado e necessitam de quimioterapia e /ou cistectomia radical para melhorar a sobrevivência.

Para os estudos de biomarcadores, carcinoma da bexiga é um modelo de doença ideal , porque o seu desenvolvimento e progressão pode ser monitorizada utilizando técnicas não invasivas ou minimamente invasivas. [3] A mucosa da bexiga pode ser examinado e biópsias podem ser obtidos através de um procedimento endoscópico. Além disso, a morfologia das células uroteliais esfoliadas e seus componentes, bem como produtos secretados pode ser examinado na urina sem nenhum risco para o paciente.

proteomic tecnologias que envolvem espectrometria de massa acoplado com Sistemas ProteinChip foram mostrados para facilitar a caracterização de proteínas de amostras biológicas. [4] – [6] As primeiras conclusões que documentam a identificação de impressões digitais de soro e de proteínas na urina para diagnosticar vários tipos de câncer [7] – [9] foram seguidas por relatórios que levantam preocupações sobre problemas com desenho do estudo, reprodutibilidade, calibração e procedimentos analíticos [10] – [13]

O perfil proteômico de desenvolvimento de câncer de bexiga de

in situ

neoplasia foi desenvolvido em uma coleção de espectros proteômica de amostras pareadas de carcinoma urotelial (UC) e adjacente. urotélio comparação com urotélio normal. Utilizando esta abordagem, foram identificadas 473 picos de proteína expressa em urotélio normal. O mesmo 473 foram posteriormente identificados no conjunto de treino de amostras de urina anulado de indivíduos controle e pacientes com UC. Os picos de proteína identificada pela primeira vez como anormalmente expressa em amostras de tecido (filtragem passo 1) e, em seguida, no conjunto de treinamento de amostras de urina anulado (filtragem passo 2) foram usadas para criar uma regra de classificação. O desempenho da regra de classificação foi avaliada pela primeira vez no conjunto de treinamento e, em seguida, em um conjunto de teste cego. Finalmente, uma análise de cluster foi realizada utilizando 473 picos de proteína em todo o controle e amostras de UC para identificar a assinatura proteômica de cancro da bexiga agressivo.

Este relatório descreve uma estratégia para a criação de perfis de proteínas utilizando dessorção laser de superfície melhorada, e ionização de tempo-de-voo (SELDI-TOF) espectroscopia de massa para formular uma regra de classificação para a detecção de câncer de bexiga em amostras de urina anulado e classificar as classes clinicamente distintas da doença.

(a) perfil proteômica Digitalized de bexiga desenvolvimento de câncer de

in situ

neoplasia. Os níveis de expressão de picos de proteína foram analisados ​​em amostras pareadas de urotélio adjacente (UA) e UCs em comparação com urotélio normal (NU). Cada coluna representa amostras de UC ou da UA e cada linha corresponde a um picos de proteína digitalizadas organizadas de acordo com as taxas de

M /Z

. Rácios de indivíduo

M /Z

pico em relação ao NU são mostrados como uma escala de saturação de cor abaixo do diagrama. As amostras correspondentes a UA e UC são agrupados de acordo com suas subconjuntos patogênicos que representam baixo grau (Grau 1-2) papilar superficial UC (LGPUC) e alto grau (Grau 3) invasiva UC (HGNPUC). O diagrama de barras à direita mostra picos individuais de proteínas com maior (vermelho) e (azul) níveis de expressão mais baixos em comparação com NU. Coluna 1: comparação entre NU ea UA LGPUC, 2: comparação entre NU e LGPUC, 3: comparação entre NU ea UA HGNPUC, 4: comparação entre NU e HGNPUC. (B) perfil proteômica de amostras anulado urina de indivíduos do grupo controle (controle normal, NC) e pacientes com UC dicotomizado em LGPUC e HGNPUC categorias. O diagrama de barras à direita mostra picos individuais de proteínas com maior (vermelho) e (azul) níveis de expressão mais baixos em comparação com NU. Coluna 1: comparação entre NC e LGPUC; Coluna 2: comparação entre NC e HGNPUC. (C) Número de picos de proteína com maior (marrom) e inferior (roxo) níveis de expressão, em comparação com NU identificados em amostras de tecido emparelhados da UA e em amostras de urina esvaziado de pacientes com UC, em comparação com NC. (D) Proporção de proteínas picos com padrão de expressão semelhante e diferente.

Métodos

tumorais e amostras de urina

Todos os tecidos humanos foram recolhidos wpith consentimento informado escrito sob protocolos aprovados pelo MD Anderson Institutional Review Board e as amostras foram analisadas de forma anónima. Foram analisados ​​os perfis de 18 pares de amostras de tumor de bexiga e tecido urotélio adjacente expressão de proteínas, 88 anulada amostras de urina de pacientes com cancro da bexiga clinicamente evidente, e 127 anulado amostras de urina de pacientes com história de cancro da bexiga (HiUC) e nenhum cystoscopic ou evidência patológica (biópsia negativa da bexiga e /ou citologia urinária anulado) de câncer de bexiga no momento da coleta de urina. Para amostras emparelhadas de urotélio adjacente e tecido de tumor da bexiga, obteve-se perfis de proteínas a partir de suspensões de células da linha de base de 13 uroteliais ureteres com nenhuma evidência de neoplasia uroteliais removidas durante a nefrectomia com carcinoma de células renais. Para amostras de urina, obtivemos perfis de proteínas de linha de base a partir de 65 indivíduos saudáveis. Os perfis foram inicialmente analisados ​​em amostras pareadas de urotélio adjacente e tecido do tumor da bexiga. Eles foram, em seguida, em comparação com os perfis identificados nas 85 amostras iniciais de urina (32 controles e 53 cancro da bexiga) referido como o conjunto de treino. Subsequentemente, as proteínas que estavam significativamente para cima ou para baixo regulados positivamente em ambos os conjuntos foram utilizados num algoritmo de diagnóstico pela primeira vez no conjunto de treino (n = 85) de amostras de urina e, em seguida, um conjunto de teste cego (n = 68; 33 controles e 35 cancro da bexiga). Por fim, os perfis proteômicos de todas as amostras (65 controles normais, 88 cancros da bexiga, e 127 HiUCs) foram analisados ​​usando cluster sem supervisão.

(A) acima regulado (vermelho) e para baixo (azul) picos de proteínas reguladas identificados na UA e UC (linha superior) e as amostras de urina anulado (meados de linha) e os picos de proteína consistentemente encontrada em ambos os conjuntos de amostras (linha inferior). (B) Mapa de calor para 41 picos de proteína identificada por filtração passo 2. (Ver Figura 1) (C) Classificação das amostras individuais (painel da esquerda) e curva ROC (painel da direita) no conjunto de treino. (D) Classificação das amostras individuais (painel esquerdo) e curva ROC (painel direito) no conjunto de testes.

As condições precursoras intraurothelial foram classificados em seções paralelas de áreas de mucosa adjacente como LGIN ou HGIN . [2] A presença do normal, displásico, ou células malignas em raspagens de tecido adjacente urotélio foi confirmada utilizando a avaliação microscópica de preparações de citospina. Os tumores foram classificados de acordo com o sistema de classificação histológica Organização Mundial da Saúde de três camadas e seus padrões de crescimento (papilares contra nonpapillary). [14] A profundidade da invasão foi registrada de acordo com o TNM (tumor-nódulo-metástase) sistema de estadiamento. [15] t Fase

1 (lâmina própria invasão) foi dividido em t

1a (não há muscularis invasão mucosas) e T

1b (muscularis mucosae invasão), que tem um risco significativamente mais elevado de progressão. [16] Os tumores foram dicotomizadas em superficial (T

a-T

1a) e invasiva (T

1b e superior) grupos, como descrito anteriormente. [17]

(A) Classificação das amostras individuais (painel esquerdo) e curva ROC (painel direito) com base em 65 amostras de controlo benignos e 53 amostras de pacientes com LGPUC. (B) Classificatin de amostras individuais (painel esquerdo) e curva ROC (painel da direita) com base 65 amostras de controlo benignos 35 amostras de pacientes com HGNPUC. (C) Classificação das amostras individuais (painel esquerdo) e a curva ROC (painel da direita) com base em 65 amostras de controlo benignos e 88 amostras de pacientes com UC. (Treinamento combinado e conjuntos de teste) (D) Comparação da precisão do diagnóstico de proteômica e citologia em 39 amostras de pacientes com UC. (E) Classificação das amostras individuais por proteoma com base no ensaio e formação combinada fixa, bem como para LGPUC e HGNPUC separadamente.

Foram preparadas suspensões de células a partir de tecido de tumor da bexiga e urotélio adjacente, tal como descrito anteriormente. [16] Em resumo, amostras cystectomy de carcinomas uroteliais não tratados previamente, foram utilizados após obtenção do consentimento informado dos pacientes. Cada amostra cistectomia foi aberto longitudinalmente ao longo da parede anterior da bexiga e fixado para baixo para um bloco de parafina. Uma seção representativa da área central de tumor grosseiramente identificados foi obtido para perfilamento proteomic. A presença de tumor no tecido foi confirmada através de análise de secções congeladas. Para minimizar a contaminação com tecidos não tumorais, que dissecados uma área de tecido de tumor a partir do bloco congelado. Foram preparadas suspensões de células uroteliais de tecido urotélio adjacente por raspagem da superfície da mucosa. A pureza das amostras foi determinada por meio de exame citológico das preparações citocentrifugadas. Somente as amostras que produziram mais do que 90% ao microscópio normal intacta, displásico, ou células uroteliais malignas foram usadas para análise de proteínas. Para o processamento, as células foram transferidas para tubos cónicos contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS). O tecido tumoral congelado foi transferido para um tubo cónico semelhante contendo PBS, o qual foi agitado mecanicamente para libertar as células tumorais. Antes de preparar lisados ​​celulares, nós precleaned as suspensões de células através de Ficoll Histopague-1077j (Sigma Diagnostics, Inc. St. Louis, MO, EUA) centrifugação em gradiente. Para o armazenamento, os sedimentos celulares foram ressuspensos em PBS contendo 20% de sulfóxido de dimetilo e congelados em azoto líquido. amostras de urina vertida foram tratados da mesma maneira. [3]

A coorte incluiu 65 controles normais (NC), 88 pacientes com câncer clinicamente evidente bexiga (UC) e 127 pacientes com história de cancro da bexiga (HiUC). Clustering foi realizada utilizando a distância euclidiana e a matriz de intensidades de expressão para 473 picos de proteína. Cada coluna representa uma amostra de urina anulada e cada linha corresponde aos picos de proteína digitalizadas organizadas de acordo com

rácios M /Z

.

O processamento das amostras de urina foi concluído no prazo de 1-4 horas após o recebimento. O volume de urina variaram de 10 a 50 ml. As amostras de urina foram centrif usadas a 2500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em 2 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). O novo tubo cónico (50 ml) foi cheia com 20 ml de DMEM, e 5 ml de Ficoll foi colocado no fundo. As células urinárias foram então transferidas para a superfície da solução. Após centrifugação a 2500 rpm durante 20 minutos à temperatura ambiente, a camada superior de 10 ml foi removida, e a interface (~ 8 ml) com células urinárias foi transferida para um novo tubo cónico (25 ml). A amostra foi de novo centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Finalmente, as células foram recolhidas, ressuspensas em 2 ml de DMEM com 10% de dimetilsulfóxido, e armazenado a -80 ° C para uso posterior.

(A) Distribuição de amostras de urina vertida em conjunto A e B do normal controles (NC), pacientes com câncer clinicamente evidente bexiga (UC) e os pacientes com história de cancro da bexiga (HiUC). (B) Distribuição de amostras de urina anulado em Clusters A e B de acordo com o grau histológico e estágio dicotomizado em baixo grau invasivo superficial papilar UC (LGPUC, PT

a – pT

1a) e alto grau de não-papilar UC ( HGNPUC, T

1b e superior).

Preparação de Lisados ​​Celulares e análise proteômica

Os lisados ​​celulares foram preparados lotes Mayer de metástases e doença sobrevida específica de pacientes com câncer de bexiga em clusters A e B. – (C) Kaplan como referenciado no site da Bio-Rad. [18] Resumidamente, as amostras foram rebocadas, centrifugada a 5000 g durante 10 minutos, lavadas em PBS e ressuspensas num tampão de lise (Tris 10 mM [pH = 9], 10 mM de NaCl, 0,1% de dodecil mattoside). Os lisados ​​de proteína foram preparados por meio de ultra-sons utilizando um sonicador de sonda (Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL, EUA) ajustado a 5 watts 10 vezes durante 15 segundos com intervalos de 45 segundos de arrefecimento no gelo. O teor total de proteína foi medida em cada amostra utilizando um estojo de reagente de ensaio de proteína Micro BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). fichas de captura de metal afinidade IMAC3 imobilizados (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, EUA) foram utilizados para análise proteômica. Batatas fritas activados por sulfato de cobre foram lavadas brevemente com água desionizada e incubou-se com acetato de sódio 100 mM (pH, 4,5) durante 5 minutos para remover qualquer excesso de Cu

2 e novamente lavado com água desionizada. Os chips foram brevemente equilibrada com tampão de lise de células e incubadas durante uma hora com lisados ​​de proteína contendo 1 ug de proteína total num volume de 3-8 uL de tampão de lise. Antes de ler, os chips foram lavados três vezes com tampão de lise, duas vezes com água desionizada, secas ao ar, e foi cristalizado com 0,3 ul de ácido sinapinico em acetonitrilo a 50% de ácido trif luoroacético /1%. Todas as etapas preparatórias foram realizadas à temperatura ambiente. Os perfis de proteína foram analisadas utilizando um leitor de Ciphergen ProteinChip PBS II (Ciphergen Biosystems Fremont, CA, EUA). Antes de cada série de medições, o sistema foi calibrado com um padrão de “tudo-em-um” a partir de Ciphergen Biosystems, e o perfil de proteómica de um tecido normal de referência, isto é, de tecido urotélio normal ou do sedimento da urina de indivíduos normais, foi testado.

(a) perfis de proteínas entre 3300 e 3600 m /z de amostras representativas correspondentes a NC, LGPUC e HGNPUC mostrando o padrão de expressão dos três picos de proteína com 3370, 3440 e 3490 ± 10 m /z referido como picos 1-3 (PK 1-3) que representa o conjunto de alfa-defensinas. (B) Ampliado mapa de calor mostrando o padrão de expressão de cluster de defensina α no conjunto de treinamento. (C) As intensidades de expressão de cluster de defensina α correspondentes a pk 1-3 em amostras puxados de teste e treinamento conjuntos de NC, LGPUC e HGNPUC. linhas vermelhas cruzadas e as barras verticais representam desvios médios e padrão. amostra de duas T-teste foi utilizado para comparar as intensidades de pico transformou-log2 em amostras e controles de câncer para cada respectivo pico (p 0,001).

Para avaliar a precisão das medições, foram realizadas várias estudos. [19] Foram avaliadas as intensidades de 26 picos de 24 espectros repetição da mesma amostra de tecido urotélio normal, para verificar a reprodutibilidade (Figura S1). coeficientes de pico de variação (CV), variou de 13,7% para 63,1% da média. O CV médio foi de 22,7%, com intervalo interquartílico foi de 19,4% para 27,7%. Também testámos a sensibilidade da relação de massa-para-carga (m /z) valores a uma quantidade da proteína total, em diferentes cargas de 0,5 a 2 mg, e as leituras m /z variaram em menos de 1% (sem dados mostrados).

Procedimentos analíticos

Todos os espectros foram exportados como arquivos * .xml usando software Ciphergen. Os espectros brutos foram processados ​​usando scripts MATLAB desenvolvidos in-house para (a) eliminar o ruído aleatório, (b) subtrair a linha de base de baixa frequência, e (c) detectar e quantificar os picos de amostras individuais. Denoising e subtracção da linha de base foram realizadas utilizando a abordagem wavelet limiar. [20] Depois de A suavização, os espectros foram normalizados. detecção de pico fez uso do espectro médio após denoising. [21] Os dados de todos os espectros foram resumidas em uma matriz de intensidades de pico, em que cada linha corresponde a uma específica

M /Z valor

(um pico) e cada coluna corresponde a uma amostra específica.

precisão da classificação foi avaliada através de sensibilidade e especificidade e pelos valores preditivos positivos e negativos. A regra de classificação também foi avaliada através de curvas receiver operating characteristic (ROC). O parâmetro que varia na curva de ROC era o ângulo entre a linha de decisão limite e o eixo X normal de: um ângulo de 0 ° conduzido para todas as amostras a ser classificado como normal, e um ângulo de 90 ° conduzido para todas as amostras a ser classificado como cancro. Além disso, anulado espectros de urina foram analisadas usando cluster sem supervisão para avaliar o grau das associações entre os dois clusters e vários co-variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo follow-up.

Resultados

A estratégia analítica utilizada em nosso estudo para formular um perfil de proteínas para a detecção de câncer de bexiga é resumido na Figura 1. para identificar a melhor combinação de picos de proteína de diagnóstico de cancro da bexiga, analisamos primeiro um perfil proteômica do seu desenvolvimento a partir de

in situ

neoplasia e comparado ao perfil proteômico do sedimento urinário anulada a partir de pacientes com câncer de bexiga. Para identificar as proteínas que foram expressas de forma anormal durante o desenvolvimento precoce do câncer de bexiga, foram analisados ​​os padrões de sua expressão em 18 amostras pareadas de tumor da bexiga e tecido urotélio adjacente e comparou-os ao seu padrão de expressão em 13 amostras de urotélio normal. Nós primeira selecionada picos que eram claramente identificáveis ​​em amostras de tecido e usados ​​t-testes para identificar picos que tiveram expressão diferencial significativa entre diferentes categorias de tumor de bexiga emparelhados e amostras uroteliais adjacentes. Usando essa abordagem, referida como filtração etapa 1, foram identificados 473 picos de proteínas expressas no tecido urotélio normal, e conjuntos de proteínas para cima e para baixo-regulados, que eram um pouco de sobreposição, mas distintas, significando assim o desenvolvimento de cancro da bexiga de

in situ

neoplasia via papilar e vias nonpapillary. Uma vez que os sedimentos urina vertida pode conter uma mistura de tumor e não tumorais células, incluindo inflamatória, estromal, e células de sangue periférico, bem como células necróticas com proteínas degenerados, que incidiu sobre os mesmos 473 picos identificados nas amostras de tecido e analisou suas intensidades numa treinamento conjunto de amostras de urina anulado de 53 pacientes com câncer de bexiga clinicamente evidente e 32 indivíduos saudáveis. Nesta fase, referida como filtração etapa 2, que procurou, novamente usando t-testes, por picos com expressão diferencial significativa entre câncer e controles.

Exemplos de SELDI-TOF espectros de amostras de tecido normal e urotélio amostras emparelhadas de urotélio adjacente e tecido de tumor, bem como os resultados de um passo de filtração são mostrados na Figura 2A. Os espectros de sedimentos urina vertida de pacientes de cancro da bexiga e dos controlos normais e os resultados da etapa de filtração 2 são apresentados na Figura 2B. As diferenças nos perfis de tumores identificados no tecido de expressão de proteínas e anulado amostras de urina são resumidos nas Figuras 2C e D. É evidente que HGINs ou carcinomas uroteliais nonpapillary de alto grau (HGNPUC) têm padrões de expressão de proteína ligeiramente sobrepostos mas distintos que podem ser também identificada em tecido adjacente urotélio. Esta constatação sugere que os perfis de expressão de proteínas anormais podem ser identificados no tecido do urotélio superfície antes do desenvolvimento de cancro clinicamente evidente. Ao comparar os padrões de proteínas anormalmente expressos em tumores de bexiga, sua urothelia adjacente, e anulado amostras de urina a partir do conjunto de treinamento, identificamos um conjunto de proteínas para cima e para baixo-regulados distintas que estavam presentes em ambos os tecidos de tumor da bexiga e anulado sedimento urinário amostras de pacientes com câncer de bexiga que foi mantida após as duas etapas de filtração. (Figuras 3A e B).

Usando apenas os picos que passaram ambas as etapas de filtração, foi utilizada a matriz de 41 intensidades de pico de proteína para construir uma regra de classificação para as amostras individuais na formação e conjuntos de testes. (Figura 3C) As posições das amostras individuais em relação ao X (normal) eo eixo Y (cancro) foram definidos usando um par de números que indicam as suas associações com os dois perfis normais e cancerosas de proteína. Neste regra de classificação, as amostras com altos associações com perfis de proteínas normais e baixos associações com perfis de câncer foram agrupados na região 1 e foram classificados como benignos. Em contraste, as amostras com baixas associações com perfis normais e altas associações com perfis de câncer foram agrupados na região 2 e foram classificados como câncer. As amostras com associações igualmente fracos ou fortes, com perfis normais e cancerosas formadas foram agrupados na região 3 e foram designados como ambíguo. Os limites destes agrupamentos foram definidos utilizando validação cruzada leave-one-out.

precisão da classificação foi inicialmente avaliada em conjunto de treinamento em termos de sensibilidade de 0,59, especificidade de 0,90, valor preditivo positivo dentro do conjunto de treinamento de 0,92, valor preditivo negativo dentro do conjunto de treinamento de 0,53, e ROC área de curva de 0,84. (Figura 3D) Tendo definido a regra de classificação no conjunto de treinamento, nós então validada a sua precisão no set cego teste de 33 amostras de controlo normais e 35 amostras de cancro da bexiga, o que rendeu uma sensibilidade de 0,80, especificidade de 1,0, valor preditivo positivo sobre o conjunto de teste de 1,0, valor preditivo negativo sobre o conjunto de teste de 0,83, e área de curva ROC de 0,91. (Figura 3D) casos que foram consideradas ambíguas foram excluídas no cálculo de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Todos os casos foram retidos para a montagem de curvas ROC.

Para avaliar como a regra de classificação com base na matriz de intensidades de pico 41 de proteína realizados em diferentes subconjuntos de cancro da bexiga, nós combinamos a formação e conjuntos de ensaio e avaliou a sua precisão diagnóstica para o carcinoma de baixo grau urotelial papilar (LGPUC) e HGNPUC separadamente. Análise de 65 amostras de controlo benignos e 53 amostras LGPUC rendeu uma sensibilidade de 0,74, especificidade de 0,95, valor preditivo positivo de 0,91, valor preditivo negativo de 0,84, e área de curva ROC de 0,88. (Figura 4A) Uma análise semelhante de 65 amostras de controlo benignos e 35 amostras HGNPUC rendeu uma sensibilidade de 0,77, especificidade de 0,95, valor preditivo positivo de 0,90, valor preditivo negativo de 0,88, e área de curva ROC de 0,88. (Figura 4B) Análise da precisão geral de classificação para o treinamento combinado e conjuntos de teste produziu uma sensibilidade de 0,75, especificidade de 0,95, valor preditivo positivo de 0,95, valor preditivo negativo de 0,75, e área de curva ROC de 0,88. (Figuras 4C e D) Análise de 39 amostras de pacientes com cancro da bexiga para os quais existem dados paralelos sobre os resultados da citologia urinária anulado indicou que a classificação com base nos dados de proteômica diagnosticou corretamente 28 (72%) amostras, enquanto citologia urinária anulada diagnosticado corretamente 19 (49%) amostras. (Figura 4E) Testando a diferença entre as amostras positivas identificadas por proteômica e citologia usando um teste z para proporções rendeu um valor p de dois lados de 0,032.

agrupamento não supervisionado foi realizada utilizando distância euclidiana e ligação completa em todos os 65 amostras de controlo normais, 88 amostras de pacientes com câncer de bexiga clinicamente evidente, e 127 amostras de pacientes com um HiUC. (Figura 5) utilizando a matriz de intensidades de expressão para todos os picos de proteína 473, classificou-se as amostras em dois grupos principais. O primeiro grupo (grupo A) consistia de uma maioria (97%) das amostras de controlo benignos. (Figura 6A) O segundo grupo (grupo B) consistia em 56% das amostras de pacientes com cancro da bexiga clinicamente evidente. Interessantemente, apenas 24% das amostras provenientes de pacientes com uma HiUC co-segregou com amostras de pacientes com cancro da bexiga clinicamente evidente do Grupo B. Os restantes 76% das amostras provenientes de pacientes com uma HiUC e 44% das amostras de pacientes com clinicamente cancro da bexiga evidente co-segregou com amostras de controlo benignos em conjunto A. Nossa hipótese é que este co-segregação pode significar classes distintas de cancro da bexiga e analisados ​​os parâmetros patológicos e clínicos das amostras em grupos a e B. Cluster (Figura 6B) a amostras compostas predominantemente normais de controle (62%), além de 27% LGPUC e 11% HGNPUC. Em contraste, o grupo B compreendia apenas 4% das amostras normais de controle, 49% LGPUC, e 47% HGNPUC. Os tumores no grupo B foram caracterizadas pela sobrevivência livre de metástases e específica da doença significativamente mais curto do que os tumores de aglomerado A. (Figuras 6C e D) no geral, a probabilidade de morrer de cancro da bexiga de pacientes no grupo B foi aproximadamente 12%, enquanto a probabilidade de morrer por aqueles em cluster a foi inferior a 5%.

Apesar de não realizar a identificação dos picos utilizados em uma regra de classificação, nos dirigimos a sua natureza potencial, concentrando-se sobre os três picos mais proeminentes utilizada na análise dos nossos perfis de expressão de proteínas. O conjunto de três picos de proteína com valores de m /z correspondente a mais provável a-defensinas foi incluído na regra de classificação. [22] – [24] Os exemplos de perfis de espectro de SELDI-TOF entre 3300 e 3600 m /z em amostras de urina representativos de controlo negativo, LGPUC e HGNPUC ilustrando o padrão de expressão dos três picos correspondentes a ct-defensinas e o mapa de calor ampliada no conjunto de treino são mostrados na Figura 7A e B. o padrão das mesmas proteínas expressão na formação combinadas e testando conjuntos mostra a sua sobre-expressão em LGPUC e HGNPUC. (Figura 7C) O padrão de superexpressão de alfa-defensinas é altamente significativo, tanto LGPUC e HGNPUC, em comparação com controles normais e até mesmo se tomado fora do contexto dos 41 picos de proteína anônimos utilizados na regra de classificação, estas proteínas executar razoavelmente bem como de diagnóstico marcadores (sensibilidade e especificidade 0,77 0,84). (Figura 7C).

Discussão

O desenho do estudo de caracterização proteômica normalmente consiste em uma comparação de padrões de proteômica de amostras de pacientes com câncer e amostras de controlo benignos usando algoritmos de inteligência artificial, tais como algoritmos genéticos ou análise de árvore. [25] – [29] Tal abordagem identifica um número limitado de picos de proteína anónimos para discriminar o cancro a partir de tecido benigna. Quando esses picos foram identificados por sequenciação de péptidos, eles representados, em geral, as assim chamadas proteínas de fase aguda em vez de produtos específicos de tumores [28].

Vários estudos utilizando perfis proteoma em urina vertida para detecção de cancro da bexiga com a plataforma SELDI foram publicados recentemente. [30], [31] Estes estudos utilizaram várias abordagens para análise de espectros de proteínas que vão desde o uso de algoritmos de inteligência artificial combinadas com agrupamento supervisionado a pico individual e identificação de grupo de picos, como parâmetros discriminatórias de diagnóstico. [30], [31] Como esperado, o algoritmo de agrupamento automático controlos segregados a partir de amostras de cancro com alta sensibilidade (80%) e especificidade ( 90%) no conjunto de treino, mas foi associado a uma queda dramática da sensibilidade e especificidade no teste ajustado para um intervalo de aproximadamente 50% e 60%, respectivamente. [30] A abordagem combinatória de biomarcadores individuais e clusters de biomarcadores fornecida sensibilidade de 87% e especificidade de 66%, mas este estudo não incluiu treinamento separado e testes conjuntos de amostras. [31] É interessante notar que os marcadores individuais identificados por esta abordagem incluiu os picos correspondentes a ct-defensina da família.