Abstract

macrófagos associados a tumores são conhecidos por influenciar a progressão do câncer pela modulação da função, angiogênese e metástase de células imunes, No entanto, pouco se sabe sobre as redes de quimiocinas sinalização que regulam este processo. Utilizando CT26 células cancerígenas do cólon e RAW 264.7 de macrófagos como um sistema celular modelo, demonstramos que o tratamento de células CT26 com meio condicionado 264,7 RAW induz a migração celular, invasão e metástase. análise de microarray gene inflamatório indicado CT26 estimulados RAW 264.7 de macrófagos upregulate SDF-1α e VEGF, e que estas citocinas contribuir para a migração CT26

in vitro

. RAW 264.7 de macrófagos também mostrou uma resposta quimiotáctica robusto no sentido CT26 quimiocinas derivadas. Em particular, a análise de microarray e testes funcionais revelaram CSF-1 como o principal quimioatrativo para RAW 264.7 de macrófagos. Interessantemente, no modelo CAM pintainho de progressão do cancro, RAW 264.7 de macrófagos localizada especificamente para a periferia do tumor onde foram encontradas para aumentar o crescimento de CT26 tumor, a densidade microvascular, perturbação vascular, e metástase pulmonar, sugerindo estas células para casa para invadir activamente áreas do do tumor, mas não o núcleo hipoxia da massa tumoral. Em apoio a estes resultados, condições de hipóxia baixo regulada CSF-1 produção em várias linhas celulares de tumores e diminuiu RAW migração 264,7 macrófagos

in vitro

. Juntos, nossos resultados sugerem um modelo onde liberação células tumorais norm�icas CSF-1 para recrutar macrófagos para a periferia do tumor, onde eles secretam motilidade e angiogénicos fatores que facilitam a invasão de células de tumores e metástases

Citation:. Verde CE, Liu T, montel V, L Hsiao, Lester RD, Subramaniam S, et al. (2009) Quimioatraente sinalização entre as células tumorais e Migração Cancer Cell macrófagos Regula, metástase e neovascularização. PLoS ONE 4 (8): e6713. doi: 10.1371 /journal.pone.0006713

editor: Derya Unutmaz, Faculdade de Medicina da Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de maio de 2009; Aceito: 09 de julho de 2009; Publicação: 21 de agosto de 2009

Direitos de autor: © 2009 Green et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. CEG, TL e R.L.K são suportados pelo NIH bolsas R01CA097022 e R01GM068487. V.M., R.D.L e S.L.G. são suportados pelo NIH conceder R01CA94900. G. H. e S. S. são suportados pelo NIH concessão R01GM078005. www.nih.gov. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a propensão para tumores para o progresso e metástase reflete não apenas as mutações oncogênicas nas células cancerosas, mas também interações dinâmicas envolvendo células não malignas no microambiente de células tumorais. As células não-malignas que infiltram um cancro em desenvolvimento incluem fibroblastos, adipócitos, células endoteliais, células perivasculares, e células do sistema imunológico, os quais podem contribuir para a progressão do cancro [1]. Entre as células do sistema imunológico, os macrófagos foram mostrados para desempenhar um papel de suporte, promover a sobrevivência celular do tumor, proliferação e metástase [2]. macrófagos associados a tumores (TAMs) são derivadas de monócitos de sangue periférico circulantes que são atraídos para a vasculatura do tumor, onde eles extravasar para o interstício e diferenciar [3]. Embora homing de macrófagos de tumores é mal compreendida, as células tumorais são conhecidos para libertar quimioatractores macrófagos incluindo CCL2, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, VEGF e CSF-1 [4]. Em comparação com macrófagos activados classicamente (M1), que funcionam como células efectoras principais do sistema imune inato, M2 TAM suporte a sobrevivência do tumor através da promoção da angiogénese local e remodelação de tecidos, enquanto suprime a resposta imune [5]. TAM localizar as áreas invasivas do tumor onde se segregam uma variedade de citoquinas e as proteases envolvidas na invasão de células de tumores e metástase [6], [7]. Neste papel, TAM contribuir activamente para a progressão do tumor e a transição para a malignidade, que muitas vezes se correlaciona com o resultado clínico pobre. No entanto, decifrar as redes de quimiocinas de células de tumor que regulam a progressão do cancro

in vivo

continua a ser um grande desafio.

A angiogênese, que é crítico para a progressão do câncer, é controlado por uma variedade de fatores conhecidos estimular o crescimento dos vasos sanguíneos e /ou de maturação, incluindo o VEGF, TGF-β, EGF, bFGF e TNF-α. TAM representam uma fonte principal de muitas destas proteínas angiogénicas no microenvironement tumoral [8], [9], [10]. Em particular, o VEGF é libertado pelo TAM e é um potente estímulo para o crescimento de novos vasos sanguíneos, um aumento da densidade microvascular, perturbação vascular, e vazar [11]. vasos sanguíneos que estão passando por remodelação são porosos e frágeis e, portanto, mais suscetíveis a intravasation células tumorais [12]. Por conseguinte, na frente invasiva, MAT pode promover metástases de tumor, estimulando a formação de redes microvasculares densa de vasos gotejantes que são permissíveis para intravasamento de células de tumor, enquanto activa simultaneamente a migração de células de cancro e invasão por libertação de uma variedade de quimiocinas, mitogénios e proteases.

para além da frente invasiva, MAT podem também localizar ao núcleo avascular hipóxico do tumor [13], [14]. O VEGF é libertado por MAT no núcleo do tumor, em resposta à hipoxia e estabilização de HIF1α HIF2α e [15], [16]. VEGF pode também ser envolvido no recrutamento de TAM para o núcleo do tumor, para além de outros factores presentes nos mal definidos os resíduos celulares resultantes da necrose tumoral [13]. Uma vez localizada para o núcleo, pode não só TAM detritos celulares clara, mas também regulam a neovascularização do tumor e a sobrevivência. Assim, não são subconjuntos de TAM que estão diferencialmente distribuídos no microambiente do tumor que podem servir funções especializadas durante a progressão do cancro [2]. Nossa hipótese é que a oxigenação do tumor é um dos principais determinantes da atividade dos macrófagos em cancros. Por exemplo, no núcleo do tumor hipóxico, MAT podem ser primariamente angiogénico e fagocitário, enquanto que sob condições de normóxia na periferia do tumor, MAT pode contribuir para a metástase de tumores, aumentando a remodelação de tecidos e densidade vascular. Neste último caso, a liberação de VEGF por TAM pode ser regulada de forma independente da hipóxia por meio de interações com células tumorais invasivas ou células estromais.

Compreender o papel da TAM na progressão do cancro

in vivo

é complicada pela a capacidade de decifrar a multiplicidade de factores presentes no microambiente do tumor. Portanto, os sistemas modelo que recapitulam

in vivo interações

tumor de células-TAM

in vitro Quais são necessárias para ajudar a desvendar as complexidades da progressão de tumores e metástases sob condições definidas. No presente estudo, foi desenvolvido um sistema modelo para investigar diretamente a sinalização de citocinas entre CT26 células cancerígenas do cólon e RAW 264.7 de macrófagos. Utilizando este sistema modelo único, demonstramos que RAW 264.7 de macrófagos e células tumorais CT26 se atraem mutuamente um ao outro e que os macrófagos induzir um fenótipo altamente migratório e protrusivo nas células tumorais. A análise de matriz de gene inflamatória e ensaio funcional revelou que os tumores derivada de células de CSF-1 é o principal quimioatractor para RAW 264.7 de macrófagos enquanto que macrófagos derivados SDF-1α e VEGF contribui para a invasão de células do cancro CT26. Além disso, um total de 270 genes em RAW 264.7 de macrófagos e 85 genes em células de tumor CT26 foram para cima ou para baixo-regulado durante a incubação em meios condicionados, sugerindo que as vias adicionais para além dos testados são provavelmente activado durante a sinalização bidireccional. Em CAM pintainho inoculados com células tumorais, RAW 264.7 de macrófagos localizar a periferia do tumor, onde eles facilitam a remodelação vascular e potenciar a metástase de células tumorais para os pulmões do pintainho. Estes resultados suportam um modelo no qual a sinalização parácrina entre as células tumorais e macrófagos regula a localização de macrófagos no tumor e a propensão das células tumorais para metastizar.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, reagentes e anticorpos

CT26 rato linha de cancro do cólon, RAW 264.7 rato linha de macrófagos e MDA-MB-468 linha de cancro da mama foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). CL16, uma variante metastático de células MDA-MB-435, foi derivada como descrito anteriormente [17]. células CT26 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad CA) e 1% de glutamina. RAW 264.7, MDA-MB-468 e CL16 células foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Carlsbad CA) suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina a 1% e Glutamax (Invitrogen, CA). RAW 264.7 expressando GFP foram feitas através da infecção de células com Lenti-verde sobrenadante (BioGenova, Rockville, MD). As células que expressam elevados 0,1% foram, então, classificados por FACS. células CT26 que expressam DsRed foram gerados através da infecção de células com o lentivírus, pEF1-DsRed-PUR, seguido de selecção em puromicina (1 jag /ml). Onde indicado, as células foram tratadas com bloqueio anti-CSF-1R mAb (AFS98, eBioscience, San Diego, CA), o bloqueio de EGF-R anti-(Millipore, Billerica, MA), de pequeno rato recombinante CSF-1 (R D Systems, Minneapolis, MN), EGF de rato recombinante (R . D Systems, Minneapolis, MN), recombinante rato SDF-1α (Millipore, Billerica, MA) ou VEGF165 recombinante (Millipore, Billerica, MA):

célula Quantitative Os ensaios de migração e invasão

Para geração de imagens de lapso de tempo de migração de células em co-cultura, RAW 264.7-GFP foram incubadas em fibronectina (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) revestidos lâminas de câmaras Lab-Tek (Nunc, Rochester, NY) durante 30 min a 37 ° C antes da adição de CT26-DsRed (10

7 células /ml). Uma vez CT26 foram adicionados, a corrediça câmara foi imediatamente colocado em-2000 Inc Incubadora Sistema (20/20 Technology Inc., Wilmington, NC), em seguida fotografado de 20X (NA = 0,75) durante 15 hrs a 4 quadros /hr usando uma Nikon C1-Si invertido microscópio confocal (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) equipados com detectores PMT e lasers apropriados para GFP (488 nm) e DsRed (561 nm). imagens descanned foram adquiridos usando Nikon software EZ-C1 então processado para rastreamento de celular e análise de forma usando Imaris (Bitplane, Saint Paul, MN). Após a adesão, as coordenadas de localização de centroids para células CT26-DsRed individuais foram registradas em cada frame sobre o timecourse da migração. Estas coordenadas foram então usados ​​para criar faixas de migração a partir do qual foram determinados a linearidade de migração, deslocamento e distância total. linearidade A migração é valor sem unidade que relaciona o número de pontos de ramificação ou se transforma em um bom caminho para a distância total de migração. Comprimento total caminho de migração foi determinada pela soma de migração passo distâncias cada quadro ao longo da sequência de vídeo. Net deslocamento caminho de migração foi quantificado como a distância direta entre o início da migração e do fim da migração. O índice de formato é a razão entre o comprimento do eixo principal ao longo do comprimento do eixo menor para células individuais controladas através da timecourse da migração.

ensaios de quimiotaxia foram realizados como previamente descrito com modificações de menor importância [18]. Resumidamente, modificado câmaras de Boyden (Transwell, 6,5 mm de diâmetro; Corning, Lowell, MA) contendo membranas de policarbonato com 8 um poros foram revestidas em ambos os lados com fibronectina (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) por 2 h a 37 ° C, lavadas uma vez com PBS e, em seguida, colocado no interior da câmara inferior contendo 500 ul de tampão de migração de adesão (MAB; DMEM com 0,1% de fracção de RIA grau V de BSA (Sigma-Aldrich), 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de glutamina), meios completos (DMEM suplementado com 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de glutamina), meios condicionados ou tampão de migração contendo SDF-1α (100 ng /ml), VEGF165 (10 ng /ml), EGF (100 ng /ml) ou CSF-1 (40 ng /mL), como indicado. medias condicionado foram coletadas de CT26 ou RAW 264.7 culturas seguintes 48 horas de incubação a 37 ° C. As diluições de meios condicionados foram feitas em meio de cultura de base apropriada. Onde indicado, anti-CSF-1R (20 ug /ml) e anti-EGF-R (20 ug /ml) estavam presentes em ambos os poços superior e inferior ao longo do ensaio. RAW 264.7 ou células CT26 foram removidos a partir de placas de cultura com solução salina equilibrada de Hanks contendo EDTA 5 mM e Hepes 25 mM, pH 7,2, e 0,01% de tripsina privadas de soro, lavadas duas vezes com tampão de migração, e, em seguida, ressuspensas em tampão de migração em 10

6 células /ml. 10

5 células em tampão de migração de 100 ul foram então adicionados ao topo de cada câmara de migração e deixadas migrar para a parte inferior da membrana porosa para várias vezes, em triplicado. RAW 264.7 migraram durante 24 horas em todas as condições e CT26 migraram para 3 horas em todas as condições. As células não migratório na superfície da membrana superior foram removidas com uma mecha de algodão, e as células migratórias ligado à superfície inferior da membrana coradas com 0,1% de violeta cristal em borato 0,1 M, pH 9,0, e 2% de etanol durante 20 min a sala temperatura. O número de células por membrana chemotaxing foi contadas utilizando um microscópio de contraste de fase invertida em 40X. Para RAW 264.7 quimiotaxia em condições de hipóxia, a câmara baixa foi suplementado com DMEM completo contendo 10% FBS para criar um gradiente quimiotático. RAW 264.7 foram então deixadas migrar durante 24 horas sob normóxica (21% de oxigénio) ou condições utilizando uma incubadora Isotemp (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) hipoxia (1% de oxigénio). células migratórias foram fixadas com metanol a 100% durante 5 minutos e coradas com violeta de cristal a 0,1% em borato 0,1 M, pH 9,0, 2% de etanol durante 20 min. As membranas foram cortadas a partir do Transwell e colocados em ácido acético a 200 ml de 10% para eluir a mancha, em seguida, a absorvância foi lida a 570 nm.

Para examinar invasão de macrófagos em colagénio, CT26-DsRed ou fluorescente vermelha (580 nm excitação /605 nm de emissão) microesferas de poliestireno (10 uM; Molecular Probes, Carlsbad, CA) foram embebidos em gel de colagénio estéril filtrada tipo 1 (PureCol; Nutacon, Leimuiden, Holanda) contendo 1X RPMI (Sigma-Aldrich), de sódio 25 mM bicarbonato e ajustada a pH 7,4 usando hidróxido de sódio 0,1 M, tal como previamente descrito [19]. A solução de colagénio contendo CT26-DsRed (10

7 células /ml) ou esferas (10

7 contas /ml) foi deixada em gel em alíquotas de 10 ul de fibronectina (10 ug /ml, Sigma-Aldrich) revestido lâminas de câmara Lab-Tek (Nunc, Rochester, NY) durante 30 min antes da adição de RAW 264.7-GFP (10

5 células /mL). migração inicial de RAW 264.7-GFP na interface com a queda de colagénio foi representada por imagem no 20X (NA = 0,75) durante 12 hrs a 4 quadros /hr usando uma Nikon C1-Si invertido microscópio confocal (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) equipadas com detectores PMT e lasers apropriados para GFP (488 nm) e DsRed (561 nm). imagens descanned foram adquiridos usando Nikon software EZ-C1 então processado para rastreamento de celular usando Imaris (Bitplane, Saint Paul, MN). Coordenadas de localização de centroids para indivíduo RAW 264.7-GFP foram registrados em cada quadro sobre o timecourse da migração. Estas coordenadas foram então usados ​​para calcular o deslocamento e a distância total migraram para as células dentro e fora 100 um da fronteira gota colagénio. As lâminas foram incubadas durante mais 7 dias em seguida visualizados utilizando microscopia confocal (10X; NA = 0,45). Em incrementos de 1 pM ao longo de todo o eixo Z do colagénio gota

CAM de galinha Ensaio

o ensaio de metástase embrião de pinto foi realizada como descrito anteriormente [20], [21]. Resumidamente, CT26-DsRed (2 × 10

6 células) sozinho ou combinado com RAW 264.7-GFP (2 × 10

5 células) As células foram suspensas no gelo em Matrigel (BD Bioscience), então inoculados na corioalant�ca pintainho membrana (CAM) em dias de desenvolvimento 9. Depois de 11 dias, no dia 20 de desenvolvimento, os embriões foram sacrificados e os tumores primários foram removidos, e fotografada em 0.63X 2X por estereomicroscopia, pesados ​​e medidos para diâmetro. O coração e os pulmões foram isolados, e a disseminação das células foi quantificada por contagem de agrupamentos de células, utilizando microscopia confocal a 10X (NA = 0,45) com uma distância de passo de 1 uM. Os tumores foram posteriormente seccionados e colocados directamente sobre uma lamela de vidro para imagiologia por microscopia confocal (10X; NA = 0,45). Os tumores foram obtidas imagens de 0 a 0,5 cm da periferia ou extremidade (periferia do tumor), 0,5 cm a 1 cm da periferia (parede do tumor) o e 1,0 cm a 3 cm da periferia do tumor (núcleo do tumor). A quantificação da distribuição RAW 264.7-GFP dentro dos tumores CT26-DsRed foi determinada pela média mapas de pixel GFP bits ao longo de um campo de visão para produzir uma intensidade de fluorescência média para cada região do tumor usando o Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Bethesda , MD). Brilho e contraste ajustes foram feitos igualmente a todos os canais e não modificou as diferenças relativas entre intensidade de pixel GFP em várias regiões do tumor.

qPCR

CT26, MDA-MB-468 ou CL16 as células de tumor foram incubadas a 37 ° C no meio completo apropriado durante 24 h sob hipóxica (1,0% de oxigénio) ou normóxica (21% de oxigénio) condições. O ARN total foi, em seguida, extraiu-se utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com as recomendações do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de 2? g de ARN total usando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). qPCR foi realizada utilizando um instrumento 7300 de sistema (Applied Biosystems, Foster City, CA) e um programa de um passo: 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 30 ×, 60 ° C, 1 min durante 40 ciclos. níveis de CSF-1 e mRNA GAPDH foram medidos em triplicado e normalizadas contra HPRT-1 mRNA.

Microarray análise

Para examinar expressão inflamatória gene, tampões condicionados foram coletadas de CT26 ou RAW 264.7 culturas seguinte 48 horas de incubação a 37 ° C e aplicado a culturas de células do tipo oposto durante 24 horas. O ARNm foi então isolado usando o kit RNeasy (Quiagen, Valência, CA), transcrito de forma inversa utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e analisadas em triplicado por hibridização com o CodeLink Mammalian Inflamação Bioarray contendo de cadeia simples 30 sondas -mer oligonucleotídeos (GE Healthcare, Piscataway, NJ), de acordo com as recomendações do fabricante. a expressão do gene cru para repetições média e normalizados utilizando o Gene CodeLink Análise Expressão v5.0 Software (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Para determinar estatisticamente regulação alta ou baixa regulação dos transcritos do gene significativa, foi aplicado o Variance Modelado Posterior Inference com a suíte web análise de microarray Regional Exponentials (vampiro) para valores de expressão de transcritos matérias, como descrito anteriormente [22], [23]. erro Group-wise associado a várias comparações foi corrigido usando um Bonferroni conservadora corrigido limiar de 5% (alfa = 0,05). agrupamento hierárquico de dados de matriz padronizados foi realizada utilizando dChip (distância: correlação, ligação: centróide) com base nas anotações ontologia gene para angiogénese, proliferação celular e quimiotaxia [24]. Para a análise heatmap, pontuações de intensidade foram calculadas com base na significância do gene para cima ou para baixo-regulação, como determinado pela análise vampiro. Estes genes foram então organizados de acordo com as anotações de ontologias gene para angiogénese, proliferação celular e quimiotaxia usando dChip (distância métrica: correlação, o método de ligação: média).

A análise estatística

A análise dos dados foi realizada usando o software 4.0 (GraphPad software, San Diego, CA.) versão GraphPad Prism. Todos os dados são apresentados como média ± SE. agrupar dados não paramétricos foram analisados ​​por análise de variância (ANOVA) e pós-teste Neuman-Keuls. valores médios distribuídos-Gaussian foram analisados ​​por Student

t

teste. comparações entre os grupos foram consideradas significativas para 2 caudas

valores P

abaixo .05.

Resultados

Migração e Análise morfológica das células cancerosas CT26 co-cultivadas com RAW 264.7 Os macrófagos

O primeiro realizou uma análise cinemática do comportamento de migração de células tumorais e alterações na forma de células determinados em resposta a co-cultura com os macrófagos. Para examinar diretamente a forma como os macrófagos alterar o comportamento migratório e persistência das células cancerígenas do cólon, as células cancerosas do rato do cólon CT26 foram fotografadas por microscopia confocal durante a co-cultura durante 15 horas na presença ou ausência de RAW 264.7 macrófagos de camundongos (Fig. 1

A

). células CT26 sozinho exibiu um comprimento total de migração de 199 ± 78 pM (média ± SD) (Fig. 1

B

). Este valor era indistinguível da co-cultivadas com células CT26 RAW 264.7, a qual exibiu um comprimento de migração de 154 ± 46 pM. No entanto, apesar de comprimentos de migração semelhantes, CT26 que foram co-cultivados com 264,7 células RAW migraram ao longo de um caminho significativamente reto, com valores de linearidade de 0,34 para CT26 co-cultivadas com células RAW 264.7 em comparação com 0,15 para CT26 sozinho (Fig. 1

B

). Este aumento de 2 vezes na linearidade foi acompanhado por um aumento significativo no deslocamento global ou a persistência da migração de células CT26 co-cultivadas com células RAW 264.7. células CT26 co-cultivadas com macrófagos exibiu um deslocamento médio de 49 ± 24 pM em comparação com 28 ± 20 uM para células CT26 sozinho (Fig. 1

B

). Estes resultados sugerem que as RAW 264.7 de macrófagos promover a migração de células CT26

in vitro

. É importante ressaltar que as células CT26 cultivadas com ou sem macrófagos mostrou viabilidade similar. De facto, a análise do crescimento das células do tumor ao longo de vários dias, indicaram que as células CT26 cresceram mais rapidamente na presença de macrófagos (resultados não mostrados). Co-cultura de células RAW 264.7 com células CT26 não se alterou RAW 264.7 adesão de células a proteínas de matriz extracelulares. Além disso, a avaliação do comportamento de 264,7 células RAW neste ensaio não revelou diferenças significativas na distância de migração, deslocamento, linearidade, ou a forma da célula quando as células foram co-cultivadas com células CT26 (resultados não apresentados), sugerindo a ausência de gradientes químicos suficientes para a quimiotaxia de macrófagos. Juntos, estes resultados indicam que RAW 264.7 de macrófagos induzem a migração de células de câncer persistente CT26 em superfícies 2-D.

A, B) CT26-DsRed (10

5 /ml) foram incubadas em fibronectina com RAW 264.7 -GFP (10

5 /mL), como indicado, durante 12 horas a 37 ° C. Durante este tempo, a linearidade, comprimento total percorrida eo deslocamento total acumulada de centróides de células CT26 individuais foram rastreados (linhas amarelas) em 4 frames /h na presença e ausência de RAW 264.7 de macrófagos usando microscopia confocal a 20X. Os dados são apresentados como a quantificação faixa individual para 55-75 células ao longo de 3 experimentos, com média indicada pelo bar. bar Ampliação representa 30 mm. * Denota diferença significativa na retidão caminho de migração (p 0,0001). ** Denota diferença significativa no deslocamento caminho de migração (p 0,0001).

A capacidade das células cancerosas para formar invadapodia e de membrana saliências tem sido associada ao aumento da migração e invasão de tecidos [25]. Portanto, nós examinamos a morfologia das células CT26 em resposta a co-cultura com RAW 264.7 de macrófagos. Dentro de 6 horas, a co-cultura com os macrófagos RAW 264.7 promoveu um fenótipo mesenquimal aumentada nas células CT26, caracterizada por numerosas saliências membrana longos que irradiava para fora a partir do corpo da célula (Fig. 2

Um

). Esta morfologia foi mantida durante mais de 12 horas e foi evidente em todas as células CT26 dentro da co-cultura que estavam em contacto com um ou mais macrófagos (Fig. 2

B

). Para determinar o tempo mínimo necessário para as células RAW 264.7 de produzir alterações na morfologia CT26, medimos a cinética da alteração da forma (Fig. 2

C

). Começando com a adesão inicial das células ao prato, os eixos maior e menor migração de células CT26 foram determinados a cada 20 minutos durante 12 horas de cultura com ou sem as células RAW 264.7 utilizando uma lâmina de câmara e microscopia confocal. Como esperado, as células CT26 isoladamente ou em co-cultura foram efetivamente rodada mediante adesão inicial ao prato com forma índices de ~ 1. células CT26 incubadas com células RAW 264.7 foram submetidos a alongamento celular rápida, como o eixo principal ao longo das extensões de membrana polarizadas foi ~ 4 vezes mais longa do que o eixo menor tão cedo quanto 4 horas após a adesão celular inicial, em comparação com células cultivadas na ausência de RAW 264.7 macrófagos (Fig. 2

C

). A alteração de forma atingiu um planalto a ~5.5 após 8 horas de co-cultura. Como esperado, as células CT26 que foram cultivados sozinhos também exibiu um aumento inicial em extensão de forma que eles aderiram e se espalhar. No entanto, neste caso, as células apenas estendeu saliências curtas e não para alongar de forma significativa, como o índice de formato só atingiu um máximo de 6 horas depois de ~ 2 de cultura (Fig. 2

C

). Tomados em conjunto, a análise quantitativa da migração celular e morfologia dinâmica CT26 indicam que RAW 264.7 de macrófagos provocar um aumento rápido e sustentado na migração celular que está associado a uma maior formação de protuberâncias da membrana.

DsRed-CT26 (10

5 /ml) foram incubadas em fibronectina com GFP-RAW 264.7 (10

5 /mL), como indicado, durante 15 horas a 37 ° C. imagens fluorescentes foram adquiridos através de microscopia confocal (20X) em 4 frames /h. A) Curso de tempo da dinâmica DS-Red-CT26 mais de 12 horas quando incubados sozinhos ou com matérias-macrófagos 264.7-GFP. As imagens são representativas de movimento CT26 ao longo de 3 experiências separadas. bar Ampliação representa 20 um. B) a distribuição cumulativa CT26-DsRed e protrusão após 15 horas de incubação sozinho (direita) ou com matérias-macrófagos 264.7-GFP (esquerda e centro, com canal verde desligado). As imagens são representativos de 3 experiências separadas. bar Ampliação representa 30 mm. C) O índice de forma (eixo maior /eixo menor) de células CT26 na presença ou ausência de células RAW 264.7 foi rastreado ao longo de 12 horas de migração. Os dados representam a média ± SEM por 10 células de mais de 3 experiências separadas.

RAW 264.7 macrófagos e células tumorais CT26 liberam fatores solúveis Quimiotáticos que promovem recíproco Quimiotaxia

A seguir, analisou se a indução de um fenótipo invasivo em células CT26 por células RAW 264.7 foi devido a uma interacção directa com os macrófagos ou uma resposta a factores quimiotácticos solúveis libertados pelos macrófagos usando um ensaio de câmara de Boyden padrão [18]. células CT26 demonstraram uma resposta quimiotáctica e robusta dependente da dose no sentido de um gradiente de meio condicionado de células RAW 264,7 (CM), enquanto que a exposição para controlar meio basal sozinha não induziu uma resposta migratória (Fig. 3

Um

). É importante ressaltar que a migração celular foi predominantemente direcional na direção do gradiente de concentração, como a migração de células de tumor foi reduzido em -60% quando as células RAW 264.7 CM foi adicionado de forma uniforme para as câmaras superior e inferior (Fig. 3

A

). Estes resultados indicam que RAW 264.7 de macrófagos libertam factores solúveis que promovem a migração direccional de células de cancro do cólon CT26.

A) CT26 (10

5 /ml) foram adicionados à parte superior de uma câmara de Boyden com RAW 264.7 meios condicionados, ou tampão de controlo DMEM completo adicionado ao poço inferior. CT26 foram deixadas migrar durante 3 horas a 37 ° C antes da coloração e quantificação de quimiotaxia. Os dados representam a média ± SEM por 15-30 campos selecionados aleatoriamente mais de 3-6 experiências separadas. * Denota significância entre 50% RAW CM e controle de mídia (p 0,001) e 50% RAW CM e 100% superior RAW CM /inferior (p 0,001). B) RAW 264.7 (10

5 /ml) foram adicionados ao poço superior de uma câmara de Boyden com meios CT26 condicionado, controlo de tampão ou DMEM completo adicionado ao poço inferior. RAW 264.7 foram deixadas migrar durante 24 horas a 37 ° C antes da coloração e quantificação de quimiotaxia. Os dados representam média ± SEM durante 15-30 campos selecionados aleatoriamente mais de 3-6 experiências separadas. ** Denota significância entre 25% CT26 CM e controle de mídia (p 0,001) e 25% CT26 CM e 100% superior CT26 CM /inferior (p 0,001). C) GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml) foram incubadas em lâminas de câmara de fibronectina revestido com gotas de colagénio de 10 ul contendo DS-Red-CT26 (10

7 /mL) ou 10? M esferas fluorescentes vermelhas (10

7 /ml). invasão de macrófagos no tumor gota incorporado ou grânulo colagénio incorporada foi representada por imagem depois de 7 dias a 10X por microscopia confocal. vista lateral e vista superior imagens são representativas da resposta média de macrófagos mais de 6 tumores de colágeno. barra de escala de ampliação para top ver imagens representa 200 m. D) A interface entre macrófagos e a queda de colagénio do tumor foi visualizada utilizando microscopia confocal (20X) durante 12 hrs a 4 quadros /h após a adição de RAW 264.7 para a câmara de corrediça. Durante este tempo, a dinâmica da migração de macrófagos foi quantificada por rastreamento centroides de células individuais em 4 quadros /hr. Macrófagos iniciam a migração dentro de 100 mm do limite do tumor (linha branca tracejada) exibem faixas amarelas. Macrófagos iniciam migração para além de 100 mm do limite do tumor exibem faixas brancas. A imagem é representativo da resposta média de macrófagos para 6 tumores colagénio separadas. bar Ampliação representa 30 mm. E) o deslocamento da faixa e comprimento total de faixas foi quantificado para a migração de macrófagos dentro e fora de 100 mm do limite do tumor colágeno. Os dados representam a média ± SEM para 15 dentro de macrófagos de 100 um e 15 macrófagos para além de 100 um da fronteira do tumor colagénio. #denotes uma diferença significativa na migração de deslocamento (p 0,05). ## Denota uma diferença significativa no comprimento total caminho de migração (p 0,0001)

RAW 264.7 de macrófagos exibiram uma resposta quimiotática robusto e dependente da dose para um gradiente de CM de células CT26 (Fig 3

B

). Com efeito, a extensão da migração de células de MC não diluído foi ~ 10 vezes maior do que os níveis basais de migração observada em resposta a qualquer meio de soro contendo ou tampão de migração contendo apenas albumina bovina. migração 264,7 células RAW foi altamente direcional e não devido ao movimento quimiocinética aleatório como a adição de CT26 CM tanto para as câmaras superiores e inferiores revogada completamente a resposta de migração (Fig. 3

B

). Curiosamente, em contraste com o sistema de co-cultura em que RAW 264.7 não exibem um aumento na distância de migração ou deslocamento, o gradiente de factores quimiotácticos na câmara de Boyden era suficientemente acentuada para induzir quimiotaxia robusta de RAW 264.7 de macrófagos.

Para investigar mais a quimiotaxia de macrófagos para as células tumorais, foi desenvolvido um ensaio de migração 3D novo no qual as células CT26 foram embebidos em gel de colagénio e local, gota a gota sobre uma lamela com células RAW 264.7 distribuídos uniformemente ao longo da periferia da matriz de gel. Como mostrado na Fig.