Sumário

O receptor de androgénio (AR) é expresso num subconjunto de células estromais da próstata e RA de células do estroma funcional é necessário para o normal desenvolvimento da próstata e influencia o crescimento de tumores da próstata. Apesar de sermos amplamente ciente das especificidades das acções genômicos de AR em células de câncer de próstata, relativamente pouco se sabe sobre os genes alvos de AR funcional em células do estroma da próstata. Aqui, nós descrevemos um novo modelo de células de estroma humano da próstata que permitiu-nos estudar os efeitos de AR sobre a expressão de genes nestas células. O modelo envolve uma variante geneticamente manipulados de células estromais da próstata WPMY-1 humanas imortalizadas que sobre-expressa o AR de tipo selvagem (WPMY-AR) a um nível comparável ao de células LNCaP e é responsivo a di-hidrotestosterona (DHT), a estimulação. Utilização de células WPMY-AR para perfil de expressão do gene mostraram que a presença de AR, mesmo na ausência de DHT, alterou significativamente o padrão das células em comparação com células de controlo (WPMY-Vec) a expressão do gene. O tratamento de células WPMY-ar, mas não as células de controlo WPMY-Vec, com DHT resultou em alterações adicionais que afectaram a expressão de genes de 141 por 2 vezes ou mais em comparação com células WPMY-AR tratados com veículo. Notavelmente, DHT subregulado significativamente mais genes do que foram upregulated mas muitas dessas mudanças reverteu os efeitos iniciais da superexpressão AR sozinho em genes individuais. Os genes mais fortemente afectadas por tratamento DHT foram categorizadas com base no seu papel em caminhos de cancro ou em vias de sinalização celular (factor de crescimento transformante-β, Wnt, Hedgehog e MAP quinase) pensa estar envolvida na diafonia estromal-epitelial durante o cancro da próstata ou próstata desenvolvimento. tratamento DHT de células WPMY-AR também foi suficiente para alterar o seu potencial parácrina de células de câncer de próstata como meio condicionado a partir tratados com DHT WPMY-AR aumentaram significativamente o crescimento de células LNCaP em comparação com WPMY-Vec meio condicionado tratados com DHT celular.

Citation: Tanner MJ, Welliver RC Jr, Chen M, Shtutman M, Godoy A, Smith G, et al. (2011) Efeitos do receptor andrógeno e andrógeno na expressão do gene na próstata Estromal fibroblastos e parácrina de sinalização para células cancerosas da próstata. PLoS ONE 6 (1): e16027. doi: 10.1371 /journal.pone.0016027

editor: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College, da Universidade Cornell, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de outubro de 2010; Aceito: 02 de dezembro de 2010; Publicação: 18 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Tanner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Equinox e da Fundação de Pesquisa médica de Albany, Nova York. MT foi um American Urological Association (URA) Foundation Research Fellow. MC e AG são destinatários de Departamento de Defesa (DoD) Programa de Pesquisa em Câncer de Próstata (PCRP) pós-doutorado Bolsas de Investigação (-10-100125 W81XWH [a MC] e W81XWH-09-1-0330 [a AG]). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A próstata requer esteróides androgênicos para o desenvolvimento, manutenção adulto e função. Os homens com mutações de inactivação em genes-chave necessários para o metabolismo de andrógeno desenvolver apenas uma glândula da próstata rudimentar [1] e os machos com inativação de mutações no receptor de andrógeno (AR) gene, que medeia os efeitos dos andrógenos, não desenvolvem próstatas [2]. Andrógenos e ação AR também desempenham um papel importante na carcinogênese de próstata. Drogas que inibem a biossíntese de androgénio tem efeitos quimiopreventivos que reduzem significativamente o risco de desenvolvimento de cancro da próstata em homens [3] e terapias de ablação de androgénios fornecem os meios mais clinicamente útil para o controlo de doenças paliativo quando o cancro da próstata é detectado na fase avançada [4]. Estes fatos clínicos identificar a relevância de andrógeno sinalização para a biologia da próstata e carcinogênese e de pesquisa unidade esforços para caracterizar as consequências de sinalização de andrógeno em células da próstata.

Uma vez que a proteína AR é um membro prolongado do fator de transcrição nuclear que condicionalmente regula a expressão de genes [5], é razoável esperar que a disponibilidade de um catálogo completo de genes regulados andrógenos em células da próstata pode contribuir significativamente para o nosso conhecimento da acção dos androgénios na próstata. Para este efeito, a utilização da expressão do gene de massa contemporânea tecnologia de perfil, especialmente envolvendo microarrays de genes em microplaquetas, já tem expandido enormemente a lista de genes conhecidos regulados de androgénio em células de cancro da próstata [6] – [9]. Estudos usando esta abordagem têm apoiado a eventual identificação de novos anomalias genéticas (rearranjos de genes ETS) [10] – [12] e ajudaram a identificar vias de sinalização anormal ativos em células cancerosas da próstata [13], [14] que têm potencial translacional para melhorar as estratégias de diagnóstico ou tratamento de câncer de próstata. Este tipo de tecnologia, no entanto, ainda não foi utilizado para caracterizar os efeitos do andrógeno /AR sobre a expressão gênica em células do estroma da próstata, apesar da ampla evidência de que as células do estroma da próstata participar ativamente dos processos através dos quais os andrógenos regulam o desenvolvimento normal ou maligna de próstata [15] – [19]. A principal razão para este défice é a falta de modelos humanos cultivados adequados estromais da próstata de células que expressam a proteína de forma robusta e AR são comprovadamente responsiva à presença de androgénios, tal como indicado por alterações na expressão de genes, quando cultivadas em meio contendo um androgénio. Aqui, descrevemos a nossa experiência em testar alguns modelos de células do estroma disponíveis (benignos) humanas da próstata para a sua capacidade de resposta aos andrógenos

in vitro Comprar e no desenvolvimento de um modelo de células do estroma da próstata humana andrógeno responsivo específico (células WPMY-AR) que foi perfilado para AR e alterações induzidas pelo andrógeno na expressão de genes utilizando microarrays chip genético humano. Além disso, utilizamos este sistema de célula de modelo para testar a ideia de que os andrógenos alterar o ambiente sinalização parácrina de um tumor de próstata, afetando a produção de fatores secretados a partir de fibroblastos estromais da próstata.

Resultados

receptor de andrógeno expressão e actividade em células estromais da próstata humana cultivadas

Duas linhas imortalizadas disponíveis da próstata humana de células do estroma, PS-30 e WPMY-1, e miofibroblastos do estroma primário de células da próstata humana não imortalizadas foram avaliados quanto à expressão de AR e de resposta às andrógenos. Nenhuma destas células requerem para andrógenos

In vitro

crescimento, no entanto, as células WPMY-1 foram anteriormente relatadas para aumentar ligeiramente mais rapidamente na presença de androgénio sintético, R1881 [20]. expressão do AR foi avaliada nestas células por RT-PCR quantitativa (qPCR) e procedimentos de Western blot e foi comparada com a cultura de fibroblastos humanos primários estromais da próstata (CARP) e às células cancerosas próstata LNCaP que são modelos de acção do RA em cancro da próstata (Figura 1A ). Das células pesquisadas, as células LNCaP expressa os mais altos níveis de mRNA AR. AR mRNA foi expresso em apenas 3,4% deste nível em células PS30, 1,1% em PRSC e em pouco mais de 0,1% deste nível em células WPMY-1. Este padrão foi consistente com os nossos dados de transferência de Western em que não fomos capazes de detectar uma banda correspondente a AR em extractos de qualquer uma das células imortalizadas ou em CARP embora foi prontamente detectada no extracto de células LNCaP (Fig. 1B). Do mesmo modo, quando as células parentais WPMY-1 foram transfectadas com um vector repórter que respondem a androgénios, não se demonstrou qualquer evidência de aumento da expressão do repórter (luciferase) em resposta a quantidades crescentes de DHT (Fig. 1C). No entanto, quando as células WPMY-1 foram co-transfectadas com o repórter androgénio, juntamente com um vector de expressão de AR, a expressão do repórter foi significativamente aumentada pela presença de DHT (Fig. 1C). Em resumo, a baixa expressão AR endógeno nestas linhas de células estromais da próstata humana e a sua falta de resposta à estimulação de androgénio sugere que eles são modelos pobres para o estudo da acção dos androgénios em células do estroma, mas a expressão exógena da AR, pelo menos no WPMY-1 células, conferidas essas células um fenótipo andrógeno-sensível que poderia ser mais propício ao estudo da ação dos androgênios.

(a) os níveis de mRNA AR em PS30, estromal da próstata primário (PRSC), WPMY-1 (W ), WPMY-Vec (W-Vec), células WPMY-AR (W-AR) ou LNCaP detectados por qPCR em tempo real de RNA extraídos a partir das células. Os níveis de expressão são indexados para a expressão de GAPDH em cada linha celular. (B) proteína AR (pistas superiores) em PS30, CARP, W, W-Vec, as células W-Ar ou LNCaP detectadas através de Western blot. A membrana foi re-sondados para GAPDH proteína (pistas inferiores) como controlo. expressão repórter (C) da luciferase em células WPMY-1 co-transfectadas com o vector de ARE-luc repórter e um controlo (vazio) vector (vector) ou o vector pLenti6.2-Har (AR). os níveis de luciferase são normalizados para a fluorescência de GFP no mesmo extracto, como o marcador de controlo de transfecção. (D) para a coloração de imunofluorescência AR nas células W-AR cultivadas durante 72 horas na ausência (à esquerda) ou na presença (à direita) de 10 nM de DHT. As células foram co-coradas com DAPI para identificar os núcleos. A actividade da luciferase (E) em células W-transfectadas com AR ARE-Luc e GFP na ausência ou na presença de 10 nM de DHT. A actividade de luciferase foi normalizada por comparação com os níveis de GFP no mesmo extracto. (F). Crescimento de células W-Vec ou W-AR na ausência ou na presença de 10 nM de DHT como medido pelo ensaio de WST-1.

De forma a tornar as células WPMY-1 mais favorável para o estudo dos efeitos na expressão do gene de androgénio, que as células transduzidas com o tipo selvagem humana expressão AR lentivírus e, em seguida, utilizada selecção de antibiótico para se obter uma população estável de células que sobre-expressam AR WPMY-1 (WPMY-AR). Outras células WPMY-1 foram transduzidas com lentivírus vazio e seleccionados sob as mesmas condições para se obter uma população de células de controlo (WPMY-Vec). células WPMY-AR expressam ARNm e proteína AR a um nível comparável com células de cancro de próstata LNCaP sensíveis-andrógenos (Figs. 1A, B). coloração de imunofluorescência utilizando anticorpos anti-AR AR mostrou que era principalmente no citoplasma quando estas células foram cultivadas na ausência de DHT, embora houvesse luz coloração de imunofluorescência nuclear na maioria das células (Fig. 1D). Em contraste, quando as células WPMY-AR foram cultivados em meio contendo DHT, AR imunocoloração foi exclusivamente nuclear. A AR expresso nas células WPMY-AR estáveis ​​foi funcional para a activação da expressão do gene genómico. Quando estas células foram transfectadas com o androgénio-repórter, a actividade da luciferase foi significativamente aumentada por tratamento com DHT DHT Considerando que não afectou a expressão de luciferase em células de controlo transfectadas WPMY-Vec-repórter (Fig. 1E). Caso contrário, as células WPMY-AR não mostraram diferenças fenotípicas outras manifestas quando em comparação com células de controlo WPMY-Vec; eles eram indistinguíveis pela morfologia sob observação microscópica (não representado) e têm taxas de crescimento semelhantes em ambos livre de androgénio e meio contendo androgénio (Fig. 1F).

comparativo de perfis de expressão genética da próstata estroma celular Variantes crescida em a presença ou ausência de DHT

WPMY-Vec e células WPMY1-AR foram plaqueadas em números iguais em meio isento de androgénio para a fixação, em seguida, transferidos para meio fresco com ou sem suplementação de 10 nM de DHT durante 72 horas. RNAs extraídos de duplicatas biológicas dessas culturas foram marcadas depois perfilado no Affymetrix Human Gene ST 1.0 Matriz Gene Chips. Os dados de expressão de microarray foram analisados ​​para identificar os genes que foram diferencialmente expressos entre uma dada célula sob condições diferentes (- /+ DHT) ou entre os dois tipos de células (WPMY-Vec vs WPMY-AR) em condições equivalentes. Utilizando um corte de alterações de 1,5 vezes na expressão de ARN, células de controlo WPMY-Vec tinha apenas oito genes que foram diferencialmente expressos na presença de DHT e o gráfico que mostra a gama destes genes alterados foi gerada pelo programa GeneSpring e é mostrado na Figura 2A. Temos uma tentativa para confirmar a expressão diferencial destes 8 genes em células WPMY-Vec tratados com DHT /-untreated usando em tempo real qPCR para avaliar a expressão de cada gene em um novo conjunto de amostras duplicadas biológicos, mas os resultados desta análise não apresentaram diferenças significativas na expressão de qualquer deles usando este método (não mostrado). A comparação dos perfis de DHT-tratados de expressão gênica /-untreated células WPMY-AR, no entanto, mostrou muito mais marcantes e robustas mudanças na expressão gênica associada ao tratamento com DHT. DHT afectou a expressão de genes individuais 172 por 1,5 vezes ou mais (Fig. 2B). No entanto, a maioria destas alterações (141 ou 81,9%) estavam no nível de 2-vezes ou superior. Nesta última categoria, mais genes foram regulados negativamente por DHT (85 genes) que foram sobre-regulada (56 genes). Os genes que foram alterados por duas vezes ou mais são identificados na Tabela S2 e S3 Tabela. Então, nós escolhemos 10 genes diferentes a partir dessas listas, incluindo 6 upregulated e 4 genes reprimidos, para posterior validação em tempo real por qPCR em um novo conjunto de RNAs extraídos de amostras duplicadas biológicos. Cada um destes genes seleccionados foi confirmada como sendo significativamente para cima ou para baixo-regulada pela presença de DHT no mesmo modo que os resultados da análise da expressão de microarray (Fig. 3A). Finalmente, a lista de genes (cima e para baixo-regulado) que foram alteradas por duas vezes ou mais na presença de DHT foi funcionalmente avaliada utilizando o

Caminho Expresso programa

software (http: //vortex. cs.wayne.edu/projects.htm) [21] que atribui genes em vias funcionais KEGG específicos e, em seguida, as diferentes vias KEGG associadas a estes genes foram quantitativamente priorizados por qualquer um de dois parâmetros diferentes: 1) o número de genes de entrada que são atribuído a uma via de KEGG específica; ou 2) a percentagem de genes de vias KEGG individuais que estavam presentes no conjunto de genes de entrada (Tabela 1). Os 10 melhores KEGG rankings da via utilizando os dois parâmetros diferentes compartilhou as categorias, Pathways em Câncer, citocinas citocinas Receptor Interação, Caminho TGF-β, Wnt Pathway, e Hedgehog via de sinalização, mas outras vias de sinalização celular de destaque foram representados em uma classificação ou a outros

(a), gerado gráfico de linha-de GeneSpring significativa. (P 0,05) as diferenças de expressão de genes maiores do que 1,5 vezes na WPMY-Vec células tratadas durante 72 horas com 10 nM de DHT. (B) linha de trama geradas pelo GeneSpring de significativa (P 0,05) as diferenças de expressão de genes maiores do que 1,5 vezes em células WPMY-AR tratados durante 72 horas com 10 nM de DHT. (C) linha de trama geradas pelo GeneSpring de significativa (P 0,05) as diferenças de expressão de genes maiores do que 1,5 vezes entre células WPMY-AR WPMY-Vec e cultivados sem DHT. (D) A linha trama gerado-GeneSpring mostrando efeito do tratamento com DHT em genes que foram diferencialmente regulados positivamente por duas vezes ou mais por expressão do AR sozinho (sem DHT). (E) trama linha GeneSpring gerado mostrando efeito do tratamento com DHT em genes que foram diferencialmente regulada negativamente por duas vezes ou mais por expressão do AR sozinho (sem DHT) e foram, subsequentemente, regulada para cima por duas vezes, na presença de DHT. (F) GeneSpring gerado trama de linhas que mostra efeito do tratamento com DHT em genes que foram diferencialmente regulada negativamente por duas vezes ou mais por expressão do AR sozinho (sem DHT) e foram subsequentemente sub-regulada por duas vezes ou mais na presença de DHT.

(A). Avaliação das alterações de expressão de genes individuais associados ao tratamento DHT de células WPMY-AR por qPCR. Seis dos genes neste painel (SFRP-5, IGF-1, Wnt-16, AQP3, FKBP5 e RERG) foram identificados como genes de DHT-regulada para cima no microarray expressão do gene e quatro genes (BMP-4, FST , IL7R e FCF5) foram identificados como genes DHT-regulada para baixo na análise de expressão gênica por microarrays e essas mudanças foram confirmadas no ensaio qPCR. Todas as alterações detectadas por qPCR foram mudanças significativas (p 0,05). (B) Avaliação das mudanças individuais de expressão de genes associados com o tratamento com DHT de células transitoriamente transfectadas com PS30 pLenti6.2-Har por qPCR. Medição de mudanças na SRBP5, IGF1, Wnt-16, AQP3, FKBP5, RERG e FCF5 foram significativas (P 0,05) ao passo que as alterações em BMP-4, FST e IL7R não foram significativas (P 0,05).

para melhor determinar se essas alterações genéticas associadas ao tratamento com DHT foram específicos para as células WPMY-AR ou se também pode ocorrer em outras células do estroma da próstata humanos com expressão AR suficiente, nós transitoriamente transfectadas células PS30 com a vector de expressão de AR ou um vetor de controle vazia então tratado essas células sem ou com 10 nM DHT por 72 horas. ARN extraído a partir destas células foram testados por análise de qPCR em tempo real para a expressão de AR e para a expressão dos mesmos genes que 10 foram analisados ​​selectivamente em células WPMY-AR. Os resultados mostraram que a AR foi expressa 923 vezes mais em AR-transfectado em células de PS30 transfectadas de controlo. Como é mostrado na Figura 3B, a expressão de seis dos outros 10 genes foram alteradas do mesmo modo como para as células WPMY-AR tratados com DHT, enquanto 4 dos 10 genes não foram alteradas de forma significativa entre as células tratadas ou untreated–DHT . Finalmente, os fibroblastos de células da próstata humanas primárias foram também cultivadas em meio com ou sem DHT durante 72 horas e RNAs foram extraídas para análise de qPCR em tempo real. Os cDNAs provenientes destes células foram então ensaiadas para efeitos de DHT sobre a expressão de 5 diferentes genes do nosso painel. Os resultados mostraram que SFRP5 e IGF1 foram regulados positivamente por 1.67- para 1.73- vezes por DHT (P 0,05) e FCF5 foi regulada negativamente em 1,5 vezes (p 0,05) em comparação com não-DHT controles enquanto que a expressão de FST e Wnt16 não estava significativamente alterada por tratamento DHT destas células.

gene Expression mudanças associadas com sobre-expressão de AR em WPMY-1 células

Para determinar se a expressão AR (na ausência de ligante) afetados expressão gênica em as células WPMY, nós também comparou os perfis de expressão gênica entre células WPMY-AR WPMY-Vec e cultivados sem tratamento DHT. Notavelmente 443 genes foram encontrados para ser expressos diferencialmente entre estas células a um nível de 1,5 vezes ou mais (Fig. 2C) e 374 destes genes são expressos diferencialmente por duas vezes ou mais entre estas células. Neste último subconjunto, 55 genes foram selectivamente regulada positivamente e 319 genes foram regulados negativamente selectivamente nas células que expressam AR. Foi ainda de interesse para determinar como estas duas categorias de genes foram subsequentemente afectada pelo tratamento com DHT. Em primeiro lugar, foram selecionados daqueles genes (55) que foram regulados positivamente por sobre-expressão de AR (pelo menos duas vezes) na ausência de DHT. Sessenta por cento desses genes (33 genes) foram, subsequentemente, regulada negativamente (por duas vezes ou mais) de novo na presença de DHT (Fig. 2D) enquanto os outros 40% eram ou inalterada ou modificada inferior a 2 vezes por DHT e, portanto, excluídos da nossa análise. Para os 319 genes que foram reprimidos por duas vezes ou mais por si só AR sobreexpressão, 21 genes (6,58%) foram, subsequentemente, regulada por duas vezes ou superior pela adição de DHT (Figura 2E), enquanto que 21 genes (6,58%) foram ainda regulada negativamente por duas vezes ou superior pela adição de DHT (Figura 2F). Os restantes genes nesta categoria (277 ou 86,8%) eram ou inalterada pela adição de DHT foram alteradas ou menos do que duas vezes e excluídos da nossa análise. Sem genes foram supra-regulada através da expressão de AR, em seguida, ainda mais supra-regulada por DHT mesmo naqueles que foram afectados por DHT 2 a 1,5 vezes. Em resumo, a sobre-expressão de AR sozinho na ausência de ligando pode induzir mas principalmente reprimir genes de expressão em células WPMY-1, mas estes efeitos foram revertidos por vezes na presença de ligando. No entanto, algumas mudanças de expressão de genes induzidos pela superexpressão (downregulations gene) AR foram ainda mais agravado pelo tratamento com o ligante de andrógeno nestas células.

Regulamento directa ou indirecta de Genes por DHT

Nós descrevemos aqui padrões alterados de expressão de genes em células estromais da próstata induzidos por AR sobre-expressão, com ou sem ligando, que foram baseadas em medições dos níveis de ARNm. Nós procuramos avaliar ainda mais a um pequeno subconjunto desses genes regulados por DHT para determinar se os efeitos da DHT necessária a síntese de proteínas intermediário. Para este fim, tratadas com tripsina células WPMY-AR foram deixadas a ligar durante a noite e depois tratou-se rapidamente (30 min) com dose elevada de ciclo-heximida (40 μgs /ml) para bloquear a síntese da proteína e em seguida mudadas para meio com ou sem DHT (10 nM) em a presença de cicloheximida menor dose (10 μgs /ml) durante 24 horas. As células de controlo foram tratadas do mesmo modo, excepto que não foi incluído cyclohexmide a qualquer momento. RNAs extraídos dessas células foram então avaliados quanto à expressão de genes selecionados (RERG, Wnt16 e SFRP5) ou DHT-down-regulada upregulated-DHT (FST, FCF5 e BMP4). Os nossos resultados (Figura 4) mostrou que o efeito de DHT sobre a expressão muda para quatro destes genes (RERG, WNT16, SFRP5, e FST) não foram alterados por tratamento com ciclo-heximida, ao passo que os efeitos de DHT no BMP4 e expressões FCF5 foram bloqueados pela ciclo-heximida. células

WPMY-AR foram pré-tratados, em seguida, tratada com ciclo-heximida na ausência ou na presença de 10 nM de DHT durante 24 horas. Os ARN foram analisadas por qPCR para a expressão de RERG, FST ou FCF5, como indicado, e os níveis de expressão foram normalizados para níveis de expressão de GAPDH.

Efeitos de DHT Estimulada WPMY1-AR meio condicionado de LNCaP em Cell Growth

Finalmente, procurou-se testar se a DHT nas células modelo WPMY-AR poderia afectar a produção de factores segregados a partir destas células que influenciam o crescimento de células de cancro da próstata. Três dias o meio condicionado a partir de 10 células ou WPMY-Vec WPMY-AR tratados com DHT nm foi diluído 1:01 com meio fresco (com 10 nM de DHT), e foi então adicionada a monocamadas frescas de células LNCaP e as células foram seguidos durante 9 dias com substituição meio a cada 3 dias. Crescimento durante este período foi medida utilizando o ensaio de WST-1 e os resultados são mostrados na Figura 5. O tratamento com o meio condicionado das células WPMY-AR tratados com DHT foi encontrado para ser significativamente mais crescimento-estimuladora para LNCaP em comparação com o tratamento com condicionado médio a partir de células WPMY-Vec tratados com DHT.

número de células relativo em dias diferentes foram estimados pelo ensaio de WST-1. O uso de meio condicionado de células WPMY-AR tratados com DHT estimulou significativamente o crescimento (P 0,01, ANOVA) de células de LNCaP em relação ao meio condicionado a partir de células WPMY-Vec tratados com DHT. Encostas das duas curvas de crescimento também foram significativamente diferentes (P = 0,0181, Análise de Regressão Linear).

Discussão

Tal como outros tecidos, a próstata é composta de uma mistura de díspares tipos de células que são amplamente segregadas num epitelial ou um compartimento estromal com base na sua localização em relação à membrana basal. células de cancro da próstata que são derivados a partir do epitélio da próstata têm historicamente desde que os modelos para estudar como androgénio acção afecta a expressão de genes de células de próstata. No entanto, vários tipos de células no interior do estroma da próstata também são conhecidos por expressar AR

In vivo

[22] – [24] e para contribuir para o processo (es) através do qual os andrógenos regulam o desenvolvimento da doença da próstata e ainda sabemos muito pouco sobre os efeitos do androgénio sobre a expressão do gene nestes tipos de células. Esforços para este fim são prejudicadas pela falta de modelos de células do estroma cultivadas adequados, especialmente aqueles que expressam AR em níveis suficientes para permitir a utilização de técnicas de criação de perfil contemporâneo de expressão genética em massa. Aqui, temos uma tentativa de caracterizar expressão do AR e da atividade de sinalização de andrógeno em duas linhas disponíveis imortalizadas de células do estroma da próstata, PS30 e WPMY-1, que foram previamente relatados para expressar AR [20], [25] para avaliar se eles podem fornecer modelos para estudar androgénio regulada a expressão do gene. Estas células são ambas classificadas como miofibroblastos com base na sua morfologia em cultura e a sua co-expressão de vimentina e actina de músculo liso. Descobrimos que ambos os tipos de células expressam níveis extremamente baixos de mRNA AR e proteínas e nem tipo de célula responderam ao tratamento DHT após transfecção com um vector repórter luciferase andrógeno-sensível por isso nem é provável que um bom modelo para o estudo de expressão gênica regulada andrógeno. No entanto, quando o vector repórter do androgénio foi co-transfectada com um vector de expressão de tipo selvagem AR, células WPMY-1 foram capazes de responder ao tratamento com a DHT por upregulating expressão repórter responsivos aos andrógenos. Este resultado mostrou que as células WPMY-1 pode ser feita propícios para o estudo da expressão do gene regulado de androgénio quando fornecido com AR exógeno. Transdução por um lentivírus AR-expressão antibiótico selecionável permitiu-nos, em seguida, para obter uma linha celular estável, WPMY-AR, que expressa mRNA e proteína AR a um nível comparável às células LNCaP que muitas vezes são usados ​​para modelar a resposta de um células cancerosas da próstata ‘para andrógenos. As células WPMY-AR realocados proteína AR para o núcleo na presença de DHT e regular positivamente de forma adequada a expressão de luciferase a partir de um vector repórter regulada por androgénio após o tratamento DHT identificação que eles têm um sistema de sinalização de androgénio funcional que é compatível com a sua utilização na expressão de genes de perfis experimentos. Foi notável que as células WPMY-AR foram morfologicamente indistinguíveis parental ou células transduzidas (WPMY-Vec) de controlo e que a sua taxa de crescimento relativa (na presença ou na ausência de androgénio) não foi significativamente afectada por AR sobre-expressão, especialmente desde que AR é conhecido por afetar o crescimento de células de câncer de próstata, ou quando é expressa endogenamente ou exogenamente [26], [27].

As células WPMY-Vec e WPMY-AR foram então perfilado para padrões de expressão gênica global e pelas alterações nestes padrões associados com o tratamento com DHT utilizando uma abordagem de microarray gene chip. Nosso esforço preliminar envolveu um tratamento mais prolongado com DHT (72 horas) do que é comumente utilizada em estudos de células de câncer de próstata, mas nós esperamos que este período de tratamento mais longo também poderia permitir a detecção de possíveis mudanças de expressão gênica secundária que pode ser relevante para os aspectos da conversa cruzada entre estromal da próstata e células epiteliais da próstata que afectam o desenvolvimento ou crescimento de células de cancro da próstata. Para as células de controlo WPMY-Vec, o tratamento DHT alterou significativamente a expressão de apenas 8 genes (de 28,712 conjuntos de sondas gene no chip) e essas mudanças foram relativamente baixos, variando de uma mudança 1.62- a 1,74 vezes em comparação com WPMY não tratada células -Vec. Nenhuma destas alterações genéticas foram posteriormente confirmados utilizando uma abordagem de qPCR em tempo real. Sentimos então, que essas pequenas mudanças em nossas células de controlo (+/- DHT) detectadas usando a abordagem Chip microarray gene representam o “ruído” do sistema e que este ruído é extremamente baixa e facilmente filtradas usando a abordagem qPCR secundário. Em contraste impressionante, o tratamento de células WPMY-AR com DHT alterou a expressão de 141 genes diferentes por duas vezes ou mais. A grande maioria destas mudanças (60,2%) envolveu a expressão do gene down-regulamentos associados com o tratamento DHT. Tendo em vista que (liganded) AR transcricionalmente ativa é mais frequentemente considerado como um indutor da expressão do gene, este é um extremamente elevado número de genes potencialmente andrógeno-reprimidos. No entanto, AR /andrógenos reprimido genes foram anteriormente descritos em células de cancro da próstata [8] e um relatório que descreve os efeitos de androgénio sobre a expressão de genes em células LNCaP mostrou que o tratamento de androgénio suprimiu quase tantos genes como foram induzidas nestas células [9 ] para nossa observação é suportada por observações em outros sistemas de células de próstata. Foi também interessante que a comparação das nossas listas de genes de células do estroma mudou-DHT com genes regulados por andrógenos já conhecidos reunidos em um recurso website (https://argdb.fudan.edu.cn/index_info.php, [28] mostrou que aproximadamente 21% dos genes presentes em nossas listas (Tabelas S1 e S2) foram previamente descritos como sendo “andrógeno regulada” com base em fontes bibliográficas pesquisadas envolvendo principalmente estudos de células cancerosas da próstata. a presença desta percentagem significativa dos descritos anteriormente “andrógeno regulamentada “genes nas nossas listas suporta a ideia de que estamos identificando muitos genes que podem ser comumente regulados pela AR liganded em muitos tipos de células da próstata, bem como genes que podem ser seletivamente afetadas pela AR /andrógenos em células do estroma da próstata.

com relação à natureza desses genes de células do estroma regulada por DHT, havia poucos, se quaisquer genes que são funcionalmente classificadas como reguladores dos processos de proliferação celular ou apoptose e isso é consistente com nossas observações de que o tratamento de andrógeno não afetou significativamente WPMY crescimento -AR. A avaliação da função do gene para o up-regulada /genes regulados negativamente sobre nossas listas com base na designação via de KEGG foi notável, uma vez que identificou uma predominância de genes que estão envolvidos em genéricos “caminhos câncer” que podem ser relevantes aos nossos achados que condicionaram médio a partir de células WPMY-AR estimulada por DHT afetaram o crescimento de células LNCaP. De igual modo, a presença de múltiplos genes na nossa lista classificada como efectores da sinalização do receptor de citocina por citoquina, TGF-β, vias de sinalização Wnt, hedgehog ou MAP quinase apoiaria estudos publicados anteriores que sugerem que estas vias de sinalização particular, estão envolvidas na transversal Discussão que ocorre entre estromal da próstata e células epiteliais /cancro da próstata em desenvolvimento ou doença [29] – [31]. Categorização dos genes na lista com base na Gene Ontology (GO) atribuições também foram feitas utilizando o programa DAVID eo resultado mostrou categorias semelhantes aos atribuídos no âmbito do KEGG Pathway (não mostrado). Finalmente, nossa pesquisa limitada para um efeito de cicloheximida em alterações genéticas induzidas por DHT suporta a ideia de que muitas das mudanças genéticas que observamos estão principalmente associadas a atividade funcional AR. No entanto, a nossa capacidade de identificar alguns genes afetados por DHT em células WPMY-AR que não foram alteradas quando cicloheximida foi incluído com o tratamento DHT também mostra que existem genes em nossas listas que são secundariamente reguladas por alguma outra proteína afetados por DHT como nós suspeita. Uso de células WPMY-AR com um curto período de tratamento DHT pode nos ajudar a resolver a principal afetada vs os genes afetados secundárias e vamos tentar isso no futuro.

Para fins de validação, que tinha selecionado um painel