Abstract

Neste conteúdo, um ligante molecular pequeno de antígeno prostático específico de membrana (SMLP) poli conjugado (caprolactona) (PCL) -b-poli (etileno glicol) (PEG) copolímeros com diferentes comprimentos de bloco foram sintetizados para a construção de um sistema de entrega de droga satisfatória. Quatro micelas poliméricas carregadas com diferentes docetaxel (DTX-POM) foram preparadas por diálise com partículas de dimensões inferiores a 60 nm, tal como caracterizado pela dispersão dinâmica de luz (DLS) e microscópio electrónico de transmissão (TEM). Otimização das micelas preparadas foi realizado com base na estabilidade de curto prazo e teor de fármaco-loading. Os resultados mostraram que os sistemas optimizados foram capazes de manter-se estável ao longo de 7 dias. Comparado com Taxotere, DTX-PMs com a mesma proporção de comprimento da cadeia hidrófila /hidrófoba exibido comportamentos de libertação sustentada semelhantes. A citotoxicidade do otimizado alvo DTX-PCL

12K-PEG micelas

5K-SMLP (DTX-PMS2) e não-alvo DTX-PCL

12K-MPEG

5K micelas (DTX-PMS1) foram avaliados por meio de ensaios MTT, utilizando antigénio específico da próstata membrana (PSMA) células de adenocarcinoma da próstata (LNCaP positivas). Os resultados mostraram que as micelas segmentados tinha um IC50 muito mais baixo do que os seus homólogos não-alvo (48 H: 0,87 ± 0,27 vs 13,48 ± 1,03 ug /mL; 72 h: 0,02 ± 0,008 vs 1,35 ± 0,54 ug /ml).

In vitro

absorção celular de PMS2 mostrou 5 vezes maior intensidade de fluorescência do que o de PMS1 após 4 h de incubação. De acordo com estes resultados, o novo sistema de entrega da droga tamanho nano-base em DTX-PCL-PEG-SMLP oferece uma grande promessa para o tratamento de câncer de próstata

Citation:. Jin J, Sui B, Gou J, Liu J, Tang X, Xu H, et al. (2014) PSMA ligando conjugados PCL-PEG poliméricos micelas direccionadas para células cancerosas da próstata. PLoS ONE 9 (11): e112200. doi: 10.1371 /journal.pone.0112200

editor: Gnanasekar Munirathinam, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Julho, 2014; Aceito: 13 de outubro de 2014; Publicação: 11 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as micelas poliméricas têm recebido atenção considerável como veículos de drogas anti-cancro promissor devido às suas vantagens notáveis, tais como tamanho pequeno, distribuição estreita de tamanhos, elevada biocompatibilidade, e a solubilização de drogas hidrófobas [1], [2], [3], [4], [5]. micelas poliméricas auto-montadas com estruturas de núcleo /revestimento permitir que o sistema para incorporar drogas pouco solúveis em água no núcleo hidrofóbico e protegê-los contra a degradação em meios fisiológicos [6]. Por exemplo, o núcleo hidrofóbico das micelas compostas de PCL-PEG oferece um reservatório para a incorporação de drogas, enquanto que o escudo peguilado, juntamente com o seu tamanho nanoscopic garante o transportador permanecer un-reconhecido pelo sistema reticuloendotelial e passam por um período de longa circulação no sangue [7], [8], [9].

Embora micelas poliméricas exibiram um número de vantagens, um grande desafio é a sua entrega de drogas específica de sítio. sistemas de libertação de fármacos de micelas poliméricas modificadas-ligando, são capazes de entrega de drogas específica de sítio. Recentemente, numerosos sistemas de entrega de segmentação activas foram concebidos por conjugação de NPs com ligandos que se ligam especificamente aos marcadores de domínios extracelulares de células cancerosas. PSMA como folato hidrolase I e glutamato carboxipeptidase II, é uma proteína transmembranar conhecido [10] sobre-expressa no cancro da próstata células epiteliais [11], [12], e tem sido demonstrado que têm um grande potencial para o cancro da próstata terapia (CaP). PSMA tem uma expressão baixa em células epiteliais de próstata normais e hiperplasia prostática benigna. É também expresso na neovasculatura de tumores sólidos maioria dos outros, mas não na vasculatura dos tecidos normais [13], [14]. Todas estas características fazem o PSMA um biomarcador atraente para a detecção, diagnóstico e tratamento de CaP [15], [16]. Um novo ligando pequeno molecular ((S) -2- (3 – ((S) -5-amino-1-carboxipentil) ureido) pentanodióico, SMLP) se ligar especificamente ao PSMA demonstrou o seu potencial no tratamento de cancro em recente anos [17]. O inibidor de PSMA à base de ureia, SMLP, tem uma elevada afinidade para o PSMA, devido à forte ligação de hidrogénio [10]. Hrkach e Langer

et ai.

Desenvolvido ACUPA (ligando de PSMA) conjugado DTX NPs de compostos de PEG-b-PLGA ou PEG-b-PLA usando um método de emulsificação de nano-alvo PSMA e avaliou a eficácia anti-tumoral das PN

in vitro

e

in vivo

[18]. A excelente potencial oferecido por veículo-ligando alvo PSMA sugere a necessidade em desenvolver processos de preparação mais diversificados e Carrier-primas neste campo.

Neste estudo, um sistema de administração de drogas auto-montados tamanho nano-baseado em ligante -conjugated micelas de PEG-b-PCL foi encontrada para mostrar uma grande promessa no campo da entrega de drogas específicas. Copolímeros de PCL e PEG são ambos materiais biodegradáveis ​​e biocompatíveis conhecidos amplamente utilizado no campo biomédico [19], [20], [21], [22], [23]. Devido à introdução de ácido glicólico (GA) e ácido láctico (LA), que rompeu a estrutura ordenada das cadeias moleculares, PLGA apresentou baixa cristalinidade. Como resultado, micelas com núcleos de PCL que mostrou maior cristalinidade são mais estáveis ​​do que aqueles com núcleos de PLGA. Além disso, por causa de PLGA é um copolímero aleatório, que é relativamente difícil de controlar a relação de GA para LA precisamente na produção em larga escala. No entanto, a razão entre os dois monómeros é um factor chave para influenciar a propriedade de PLGA [24]. Assim PCL foi utilizado como o bloco de formação de núcleo, devido à sua maior estabilidade e facilidade de produzir. PCL-mPEG ou PCL-PEG-COOH, foi sintetizado por polimerização de ε-caprolactona iniciada por mPEG-OH ou HOOC-PEG-OH [25], [26] de abertura de anel. micelas de PCL-MPEG e PCL-PEG-SMLP foram preparados utilizando o DTX como um fármaco modelo para examinar os efeitos citotóxicos sobre as células LNCaP. Além disso, uma ilustração esquemática de preparação e processo de endocitose DTX-PCL-PEG-SMLP é mostrado na Figura 1.

Materiais e Métodos

Materiais

L ácido di-terc-butil cloridrato do éster glutâmico e H-Lys cloridrato de (Z) -OT-Bu foram obtidos a partir En lai Biological Technology Co., LTD (Chengdu, República Popular da China). mPEG-OH (PM: 2 kDa) e mPEG-OH (PM: 5 kDa) (Aladdin agente Co., Shanghai, PR China) e OH-PEG-COOH (PM: 2 kDa), OH-PEG-COOH (Mw : 5 kDa) (Shanghai Seebio Biological Technology Co., Shanghai, República Popular da China) foram desidratados por destilação azeotrópica com tolueno antes do uso. DTX (Xangai Sanwei Pharma Ltd, Co, Xangai, China P R) e o saco de diálise de éster de celulose com um cut-off molecular de 7000 Da (Bioscience Ltd, Co, Xangai, China P R) foram utilizados tal como recebidos. ε-caprolactona (CL-ε, Aladdin agente Co., Xangai, China P R) foi seca sobre CaH

2, à temperatura ambiente durante 48 h e destilada sob pressão reduzida. octoato estanoso foi comprado de Aladdin coagente (Xangai, China P R). Todos os solventes orgânicos utilizados nos procedimentos de síntese foram adquiridos da National Medicina Química Reagente Co Ltd (Xangai, China).

A próstata LNCaP e celulares PC3 linhas foram obtidos a partir Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As células LNCaP foram cultivadas utilizando garrafas de cultura de células-bind (Corning, EUA).

Métodos

Síntese de PCL-mPEG (PMS1) e PCL-PEG-SMLP (PMS2) copolímeros.

copolímeros com uma gama de comprimentos de bloco foram preparados por copolimerização por abertura de anel de ε-CL iniciada por hidroxilo de PEG. Resumidamente, uma quantidade predeterminada de ε-CL e octoato estanoso foram adicionados a um recipiente de reacção contendo mPEG-OH ou OH-PEG-COOH, sob uma atmosfera de árgon seca (octoato estanoso /ε-CL na 1:1000 proporção molar). Em seguida, o vaso de reacção foi colocado num banho de óleo e mantida a 120 ° C durante 24 h. Em seguida, os copolímeros em bruto foram dissolvidos em DCM e precipitado em éter dietílico frio para remover o monómero reagiu-un e oligómero. Em seguida, o produto foi filtrado e seco para se obter um precipitado branco.

PCL

12K-PEG

5K-COOH (1 g, 0,059 mmol) foi dissolvido em 5 ml de tetra-hidrofurano anidro (THF) com 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) (57,4 mg, 0,3 mmol, 5 equiv) e N-hidroxissuccinimida (NHS) (27,6 mg, 0,24 mmol, 4 equiv). Em seguida, a mistura solução foi agitada à temperatura ambiente durante mais 12 h sob atmosfera de árgon. O PCL

copolímero 5k-NHS-PEG 12K foi precipitado em éter dietílico arrefecido com gelo para se obter um precipitado branco que foi recolhido e seco para se obter o produto desejado como um pó branco (rendimento de 90%). SMLP (300 mg) foi dissolvido em THF anidro (20 ml) para preparar a 10 mg /ml (SMLP /THF) do aqua. PCL-PEG-NHS (500 mg, 0,03 mmol) e diisopropiletilamina (0,7 ml) foram adicionados a 5 ml (SMLP /THF) aqua, e a solução de reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 20 h sob árgon. Depois de completada a reacção, a solução foi purificada por diálise durante 24 h e seca-se por liofilização para obter um pó floculento branco (rendimento 90%). A estrutura do copolímero final foi caracterizado por

1H NMR espectroscopia.

PCL

4.8K-mPEG

2K e PCL

4.8K-PEG

foram preparados 2k-SMLP usando o mesmo método indicado anteriormente. caracterização

polímero.

o

ressonância magnética nuclear de 1H-(

1H RMN) os espectros de todas as amostras foram registados num espectrómetro Bruker DMX 300 ou 600 espectrômetro (Billerica, MA). Os desvios químicos (δ) foram dados em ppm utilizando tetrametil-silano como padrão interno. Transformada de Fourier espectros de espectroscopia de infravermelho foram registados num Bruker Tensor 27 espectrômetro, e as amostras foram preparadas utilizando discos de KBr (Scharlau Chemie, Barcelona, ​​Espanha). cromatografia de permeação em gel (GPC) ensaio foi realizado em um Waters 1515 GPC instrumento (Waters Corp., Milford, MA) equipado com três colunas Styragel (Waters Corp; 10

5, 10

4, e 103 A) em conjunto e um detector de índice refractivo diferencial 2414. DMF foi seleccionado como o eluente a um caudal de 1,0 ml /min a 35 ° C. As concentrações das amostras foram de aproximadamente 2 mg /ml. Os pesos moleculares foram calibrados utilizando padrões de poliestireno.

Preparação de micelas poliméricas.

micelas carregadas-DTX foram preparados por diálise. Em primeiro lugar, 7 mg DTX e 50 mg de copolímero foram completamente dissolvido em 2 ml de THF. Em seguida, 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 10 mM, pH 7,4 ou 10 mM, pH 5,5) foi adicionada gota a gota à solução sob agitação contínua durante uma hora. Em seguida, o THF foi removido por diálise contra PBS (10 mM, pH 7,4 ou 10 mM, pH 5,5) ao longo de 24 h, usando um éster de celulose saco de diálise (MWCO: 7000 Da). O meio externo foi substituído três vezes (2, 6 e 12 horas). Finalmente, a mistura foi passada através de uma membrana de 0,45 um filtro para remover quaisquer precipitantes.

teor de fármaco-carga e eficiência de encapsulação.

Para determinar o teor de fármaco-carregamento e encapsulamento eficiência, 500 mL DTX-carregado solução micelar e 5 ml de THF foram transferidos para um balão volumétrico de 25 ml, sonicado a 180 W durante 10 minutos num banho de ultra-sons, e depois diluiu-se com fase móvel. A concentração da solução resultante foi então determinada por HPLC. A análise cromatográfica foi realizada utilizando uma bomba Hitachi L-2130 e L-2400 um detector de UV-Vis Hitachi operado a um comprimento de onda de 230 nm, utilizando uma coluna C18 Unitária (5 um, 150 x 4,6 mm). Uma fase móvel de acetonitrilo e água (60/40, v /v) foi seleccionado. A taxa de fluxo foi de 1 ml /min. A resposta da área do pico versus a concentração DTX foi linear no intervalo de 0,5-30 g /ml (r

2 = 0,9999).

O teor de fármaco-carregamento e encapsulamento eficiência foram calculados a partir das seguintes equações :

medição do tamanho de partículas

O tamanho de partícula e distribuição de micelas foram medidos por DLS usando NICOMP 380 partículas submicrónicas (Sistemas de dimensionamento de partículas, Santa Barbara, CA).. Utilizou-se um feixe laser a um comprimento de onda de 632,8 nm. O ângulo de dispersão foi estabelecido a 90 °, quando as medições foram realizadas.

morfologia da superfície.

As amostras para TEM observação foram preparados, colocando uma gota de solução de amostra (2 mg /ml para o copolímero) sobre a uma grelha de cobre revestida com carbono. O excesso de solução foi removido com papel de filtro. A grelha foi deixada a secar por mais 15 minutos. Em seguida, as amostras foram examinadas usando um Hitachi H-600 TEM operado a uma voltagem de aceleração de 100 kV.

In Vitro

Release.

O

in vitro

DTX cinética de liberação de soluções micelares carregado com a droga ou injeção DTX (Taxotere, da Sanofi-Aventis, Paris, França) contendo 300 ug DTX foram realizados por difusão de diálise. A solução micelar carregado de drogas e solução livre de drogas foram colocados em sacos de diálise (MWCO: 14000). Estas bolsas foram imersos em 15 ml de PBS pH 7,4 (10 mM) ou pH 5,5 (10 mM) contendo 0,5% w /v de Tween 80. Em seguida, os frascos foram colocados num incubador com agitação a uma velocidade de agitação de 100 rpm sob 37 ° C ± 0,5 ° C. Todos os meios de libertação foram substituída com PBS fresco em intervalos pré-determinados (1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h, 72 h, 84 h e 96 h), em ordem para medir a concentração da droga. A concentração de DTX foi medida por HPLC.

Cultura celular e citotoxicidade

.

A próstata LNCaP e PC3 linhas de células foram cultivadas em meio RPMI 1640 e de Ham F12K (Invitrogen, EUA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, EUA), respectivamente. As culturas foram mantidas numa atmosfera humidificada de 95% de ar contendo 5% de CO

2 a 37 ° C.

ensaio de MTT foi realizado para avaliar a citotoxicidade de DTX-PMS1 (não-alvo) e DTX-PMS2 ( visadas). As células LNCaP foram suspensas em meio de cultura e semeadas a 5000 células /poço em placas de 96 poços durante 24 h. Em seguida, dispersa-DTX PMS1, PMS2-DTX, e a solução DMSO de DTX (DSD) contendo quatro concentrações de droga (0,1, 1, 10 e 20 ug /ml) em cada amostra foram incubadas em células LNCaP. Finalmente, a viabilidade celular foi determinada após 48 h e 72 h, usando um leitor de microplacas (Bio-Rad imark, EUA).

O IC50 para cada sistema, em seguida, foi calculada. Todos os ensaios foram realizados com cinco amostras em paralelo.

estudos de captação celular.

Neste estudo, cumarina 6 foi utilizado como uma sonda de fluorescência. foram usadas linhas de células de próstata independente de androgénios e dependentes de androgénios (LNCaP e PC3, respectivamente). a absorção celular de MPs específicas e não específicas (200 ug /ml) que transportam cumarina 6 (100 ug /ml) (PMS1 e PMS2, respectivamente) foram realizados em LNCaP e linhas celulares PC3 para investigar a influência de SMLP conjugação sobre a absorção celular. As células foram incubadas em placas de 96 poços com micelas durante 4 h, lavou-se com PBS frio três vezes, e depois fixadas com etanol a 70% durante 2 h a -20 ° C. Um estudo de inibição competitiva, também foi realizado utilizando SMLP livre para verificar se as MPs foram transportados para células de um modo mediado por SMLP. SMLP livre com três concentrações diferentes (4 ug /ml, 20 ug /ml e 100 ug /ml) foi adicionado ao meio juntamente com PMS2, incubadas durante 4 horas, lavou-se três vezes com PBS frio e fixadas com etanol a 70% durante 2 h a -20 ° C. os núcleos das células foram coradas com Hoechst 33342.

As células foram examinadas usando um Sistema de Triagem conteúdo ImageXpress Micro XL Widefield High (ImageXpress Micro XL, Molecular Devices, EUA) com MetaXpress Software. As imagens das células foram determinados pela técnica de canal de contraste de interferência diferencial e as imagens da SPM cumarina 6-carregados e os núcleos de células coradas com Hoechst 33342 foram registados com os seguintes canais: canal azul (Hoechst 33342) com excitação a 350 nm e canal verde (cumarina 6) com excitação a 485 nm. Então, MetaXpress Software foi utilizado para quantificar a intensidade de fluorescência por célula.

Statistics.

Todos os dados foram processados ​​usando software Origin 8.5 e apresentados como média ± SD, e analisados ​​utilizando Student

t

-teste. As análises estatísticas foram realizadas e P . 0,01 foi considerado como o nível de significância estatística

Resultados e Discussão

Síntese e caracterização de copolímeros PCL-PEG-COOH

um copolímero em bloco anfifílico composto por um bloco PCL como a parte hidrofóbica e um bloco de PEG como a parte hidrofílica foi sintetizado via polimerização por abertura de anel usando PEG terminação hidroxilo como um iniciador macromolecular.

os pesos moleculares de os copolímeros foram calculados a partir dos dados>

Síntese e caracterização de PCL-PEG-SMLP

funcionalização da superfície do PCL- copolímero PEG-COOH com SMLP foi conseguida em condições de acoplamento amida padrão, na presença de EDC e de NHS [27], [28]. A eficiência de acoplamento com nucleófilos de amina pode ser aumentada através da formação de um intermediário de éster de NHS [29].

A síntese de polímeros de PCL-PEG-SMLP foi realizada pelo seguinte método. Em primeiro lugar, o grupo carboxilo de PCL-PEG-COOH, foi activado com EDC e de NHS para conseguir o intermediário de PCL-PEG-NHS. Em seguida, fez-se reagir o éster activo (NHS) de PCL-PEG-NHS com o grupo funcional amina da SMLP obter o polímero final PCL-PEG-SMLP (Figura 3).

O polímero de PCL

12K-PEG

5K-SMLP foi caracterizado utilizando FT-IV, tal como ilustrado na Figura 2F. Os picos mais importantes apresentados na Figura 2F a 1,671 e 1,557 centímetros

-1 foram atribuídas a banda de amida I (grupo carbonilo) e amida de banda II (grupo amino), respectivamente, enquanto o desaparecimento destes picos (Figura 2G) indicou a formação da ligação amida entre SMLP e PCL

12k-PEG

5k-COOH. A estrutura do conjugado foi ainda examinada por

1H RMN. A Figura 2C mostra o

espectro de RMN de 1H da conjugação do ligando e copolímero PCL

12K-PEG

5K-COOH. O sinal característico que aparece a 3,60 ppm (a) foi atribuído para a unidade de PEG. Os picos das unidades PCL aparecer em 4,04-4,08 ppm (b), 2,28-2,33 ppm (C), 1,61-1,70 ppm (d) e 1,35-1,43 ppm (E), como mostrado na Figura 2C. Além disso, os sinais a 2,49 ppm e 3,25-3,49 ppm foram atribuídos ao pico do solvente (DMSO) e pico de água, respectivamente. De acordo com a Figura 2E, não há sinais relacionados com a SMLP mostrados na

Espectro de 1H RMN de não conjugada PCL

12K-PEG

5K-COOH, indicando que não existe interferência com os sinais SMLP mostrado na Figura 2C .Comparing os picos de PCL-PEG-SMLP na Figura 2C, e os picos de SMLP ligando na Figura 2B, os desvios químicos foram idênticas. Pentear os resultados de FT-IR e

1H NMR mostrou que o SMLP ligante tinha sido conjugado com sucesso para PCL

12K-PEG

5K-COOH. A pureza do conjugado de ligando de polímeros, que está criticamente relacionada com o

In vitro

desempenho das micelas, foi verificada por cromatografia de permeação em gel. Como se mostra na Figura 2D, não se observou qualquer vestígio de SMLP livre nos cromatogramas de qualquer PCL

12K-PEG

5K-SMLP ou PCL

4.8K-PEG

2K-SMLP, indicando que o ligando livre excessiva foi completamente removido.

preparação e caracterização de micelas

neste trabalho, diálise foi utilizado para preparar os docetaxel-micelas, levando à preparação bem sucedida de nontargeted [PCL

12K-mPEG

5k (PMS1), PCL

4.8K-mPEG

2K (PMs3)] e orientada [PCL

12K-PEG

5K-SMLP (PMS2), PCL

4.8K-PEG

2K-SMLP (PMs4)] micelas. Além disso, as nanopartículas com diâmetros maiores do que 100 nm, são mais susceptíveis de serem eliminados pelo sistema reticuloendotelial [30], enquanto que os seus homólogos com diâmetros inferiores a 100 nm foram mais propensos a acumular-se em tecidos tumorais [31], [32].

Os diâmetros médios de micelas (PMS1, PMS2, PMs3 e PMs4) preparados por diálise foram 51,4 ± 1,3 nm, 50,5 ± 1,1 nm, 37,1 ± 0,5 nm e 38,6 ± 0,7 nm, respectivamente. Os valores de índice de polidispersão (PDI) dos quatro micelas são mostrados na Tabela 1. Os gráficos de DLS PMS1 e PMS2 são mostrados na Figura 4 (A, B). A morfologia e baixa PDI das micelas foram posteriormente confirmado por imagem TEM. A fotografia TEM (Figura 4, A

1 e B2) de PMS1 e PMS2 estavam de acordo com os resultados de DLS. Os diâmetros mais pequenos das POM obtidos a partir dos testes de MET em comparação com DLS pode ser atribuída ao encolhimento do invólucro PEG induzida por evaporação da água, antes da medição MET [33]. Como resultado, o diâmetro determinado por DLS foi maior do que a de ETM, devido à hidratação do reservatório PEG.

gráficos de MET de DTX-PMS1 (A

1) e DTX-PMS2 (B

2).

Para avaliar o teor de fármaco de carga máxima e a eficiência de carga de droga dos quatro micelas, um estudo de estabilidade de curto prazo simples do conteúdo DTX-carregada foi realizado e os resultados são mostrados na Figura 5. em primeiro lugar, o excesso de DTX foi adicionada durante a preparação dos quatro DTX-SPM. As MPs-mais carregado foram mantidos à temperatura ambiente e amostrados a tempo predeterminado. Em seguida, o conteúdo DTX-carregamento das amostras foi medida por HPLC utilizando o método descrito. O perfil mostrou que o teor de DTX-carga inicial das quatro PMs foi de 10,4%, 10,8%, 9,6% e 9,8%, respectivamente. Os valores de conteúdo DTX-loading caiu gradualmente e permaneceu constante após 12 h para PCL

12k-PEG

5k e 24 h para PCL

4.8K-PEG

2k (Figura 5, circulou em praças ). A redução no teor de fármaco-carregamento pode ser devido à ocorrência de separação de fases entre DTX e PCL. O teor de fármaco de carregamento depois de um período de teste de 7 dias pode ser considerado como a capacidade de PCL para o carregamento DTX. Além disso, a maior capacidade de PMS1 e PMS2 comparação com PMs3 e PMs4 poderia ser atribuída às cadeias mais longas PCL de PMS1 e PMS2. Com a mesma razão entre o comprimento do bloco hidrofílico para o comprimento de bloco hidrófobo, o teor de fármaco-carga e eficiência de encapsulamento final das quatro PMs são mostrados na Tabela 1. Estes resultados mostram a boa estabilidade de curto prazo do teor de DTX-carregamento , o teor de fármaco-loading e eficiência, confirmando que as micelas com base em PCL

12K-PEG

5K-SMLP e PCL

12K-mPEG

5k copolímeros foram formulações ideais.

(n = 3).

In vitro

liberar

O

in vitro

comportamento libertação de quatro DTX-PMs foi investigado por o método de diálise por difusão [34]. O comportamento de libertação do Taxotere foi utilizado como um controlo, e os perfis de libertação dos quatro DTX PMs, a pH 7,4 (ambiente simulado de tecidos normais) e pH 5,5 (ambiente simulado de tecidos tumorais) são mostrados na Figura 6. Quase 90% de o DTX foi liberado do Taxotere no prazo de 24 h. Ao contrário de Taxotere, todas as micelas exibiu uma libertação rápida do DTX na fase inicial (primeiras 24 horas) e uma liberação sustentada ao longo do 72 h seguintes. Além disso, os perfis de libertação semelhantes de PMS1 e PMS2 indicou que ligando a conjugação não influenciou o padrão de liberação.

Para os quatro PMs, porque a estrutura éster poli de PCL é sensível ao ácido, a liberação de DTX das micelas foi mais lenta a pH 7,4 do que a pH 5,5. Este efeito de promoção da libertação da DTX em tecidos tumorais e em endossomas que são mais ácida do que o sangue [35]. A quantidade de DTX não-lançado foi de 20-25%. Esta proporção de drogas existentes nos núcleos micelares; preso em precipitações geradas pelo calor e tween 80 induzido repartição micelar e adsorvido em saco de diálise e vidro [36].

citotoxicidade celular

PSMA é um marcador molecular validado overexpressed pelas células LNCaP [37] , [38]. O efeito de aumento da citotoxicidade do ligando PSMA (SMLP) conjugado DTX-PMs foram avaliadas por experimentos in vitro de citotoxicidade utilizando LNCaP e células PC3, respectivamente. A biocompatibilidade do PCL

12K-mPEG

5K e PCL

12K-PEG

5K-SMLP foi confirmada através da incubação de micelas livres de drogas compostas por estes dois polímeros em várias concentrações com células LNCaP e células PC3 , respectivamente. A viabilidade das células não foi afectada durante um período de incubação de 72 h, o que confirmou a boa biocompatibilidade desses polímeros (Figura 7). Os resultados também demonstraram que as células não podem ser interferido na presença de ligantes.

(n = 5).

Neste estudo, a solução DMSO de DTX (DSD) foi utilizado em vez de Taxotere como um controlo positivo porque Tween 80 em Taxotere é citotóxico e isto pode influenciar os resultados [39]. De acordo com os resultados dos ensaios de MTT (Figura 8), depois de uma incubação de 48 h, a citotoxicidade de PMS1 era quase o mesmo que o DDS. No entanto, PMS2 mostrou uma viabilidade celular de LNCaP significativamente mais baixa em todas as concentrações. Em linhas celulares PC3, no entanto, não foi observada nenhuma diferença significativa na viabilidade celular entre DSD, PMS1 e PMS2 (Figura 8). Isto indicou que o ligando de conjugação é benéfica no sentido de facilitar a absorção celular de micelas: como PMS1 e PMS2 mostrou perfis de libertação semelhantes, a viabilidade celular diminuiu poderia ser atribuída a acumulação de droga intracelular aumentada por meio de endocitose mediada por receptor. Após 72 h de incubação, tanto PMS1 e PMS2 mostraram diferenças significativas de DSD em linha celular LNCaP e PMS2 apresentou a maior citotoxicidade. Além disso, as viabilidades celulares inferiores significativos foram observados em linhas celulares PC3 tratadas com PMS1 ou PMS2 de DSD em concentração de fármaco de 20 ug /ml, o que significa que a absorção celular inadequada de micelas pode ser compensada pelo aumento do tempo de incubação e concentração da droga. No entanto, não houve diferenças significativas entre PMS1 e DSD, após incubação de 48 horas para as células LNCaP. Este fenómeno confirmou o comportamento de libertação do fármaco sustentado de DTX de PMS1

in vitro

(*) significativamente diferente do DSD.; (#) Significativamente diferente do PMS1; (N = 5). Nota: * P 0,01,

# P 0,01

A viabilidade das células de PMS2 em 20 ug /ml foi quase metade do da PMS1 para células LNCaP após quer 48 h ou 72 h. incubação. Estes dados demonstraram que o DTX-PMS2 foi menos eficaz no aumento da citotoxicidade em células PC3, ao passo que inibe selectivamente a proliferação de células LNCaP. Em outras palavras, estes resultados sugerem que a elevada afinidade da SMLP para PSMA poderia aumentar a citotoxicidade em células LNCaP. Após 72 horas de incubação em células LNCaP com a quantidade de DTX dada a uma concentração fixa de 20 ug /ml, a taxa de inibição do crescimento de células de DSD, PMS1 e PMS2 foram 58,4%, 67,7% e 83,9%, respectivamente.

o IC50 para cada amostra é mostrado na Tabela 2. para as células LNCaP, o IC50 de DTX-PMS2 foi muito mais baixa do que a de DTX-PMS1 e DSD, após 48 h ou 72 h de incubação. No entanto, o IC50 de DTX-PMS1 foi quase a mesma que a da DSD, após 48 h de incubação, mas era 5 vezes inferior, após 72 h de incubação com células LNCaP, isto confirmou ainda mais o efeito de compensação na citotoxicidade de micelas por tempo de incubação prolongado. Embora DTX-PMS2 (alvo) exibiu a mais alta eficiência de matar células, o DTX-PMS1 também exibiu um efeito sobre as células LNCaP. Uma vez que os dois micelas possuíam perfis de libertação semelhantes, as diferenças de citotoxicidade foram relacionados com a sua capacidade de entrada de célula diferente que foi refletido pelas diferenças de afinidades com PSMA.

Incorporação celular

para estudar o efeito do PSMA ligando de direccionamento na absorção celular do PMS, microscopia de fluorescência foi realizada em células LNCaP com ambas as micelas segmentados (PMS2) e não-alvo (PMS1) marcado com cumarina-6. Após 4 h de incubação a 37 ° C, imagens HCSS de células LNCaP foram tomadas e mostrada na Figura 9A. A intensidade de fluorescência de células incubadas com micelas segmentados (PMS2) foi significativamente mais elevada do que a sua contraparte não-alvo (PMS1), e a intensidade de fluorescência quantificadas foi estimada como sendo de 5 vezes (Figura 9C). A capacidade de SMLP conjugação no aumento da captação celular poderia ser refletida em ensaios de viabilidade celular. Para verificar ainda mais o papel da SMLP na endocitose, foi conduzida uma experiência de ligando de competição. Como mostrado na Figura 8B, a adição de ligandos livres em várias concentrações gradualmente diminuíram a absorção de PMS2, e a quantidade de micelas endocitadas atingiu um nível semelhante ao seu homólogo não específico a uma concentração elevada de SMLP (100 ug /mL, Figura 10B) , o que indicou a presença de SMLP livre no meio de endocitose inibida PMS2 através da ligação à superfície de PSMA de uma forma competitiva contra SMLP micela-conjugado. Para verificar ainda a melhoria do ligando na mediação da endocitose, os estudos de captação celular de ambas as preparações com /sem ligante SMLP foram realizados numa linha celular PC-3, que não expressam a proteína de PSMA [40]. Como mostrado na Figura 9 (B e C), micelas targeted- e não-alvo mostrou intensidade fluorescente intracelular semelhante, o que significa que a conjugação de SMLP é um factor chave em promover a absorção celular de micelas preparadas em células que expressam PSMA. Além disso, os resultados acima demonstraram que PMS2 foi endocitosado nas células LNCaP através de várias rotas: parte das micelas foi feita pelas células LNCaP de um modo mediado por SMLP, enquanto havia micelas penetrar nas células por meio de outras vias, incluindo endocitose mediada por caveolin ou clathrin- e independente de endocitose-caveolin [41], como a captação celular de micelas não foi completamente inibida por adição SMLP. Estes resultados explicou a maior citotoxicidade das micelas alvo (PMS2) em ensaios de MTT e indicou o benefício de PMs com um ligando alvo na terapia do cancro da próstata.

A célula núcleos foram corados com Hoechst 33342 com o canal de azul, a cumarina 6-carregado PMs são o canal verde. A captação celular foi visualizado através da sobreposição de imagens exibidas pelo canal de núcleos e o canal de PMs. O gráfico de intensidade da fluorescência /célula de 100 ug /ml de 6-cumarina carregado PMS1 e PMS2, com uma concentração de 200 ug /ml após 4 horas de incubação com células LNCaP e PC3 células (C).

Conclusões

neste estudo, um romance auto-montagem de micelas DTX-PEG-PCL-SMLP segmentação células LNCaP foi desenvolvido. Com a mesma relação de comprimento do bloco hidrofílico /hidrofóbico, uma série de micelas poliméricas com diâmetros inferiores a 60 nm, foram preparados por diálise. MPs não-alvo estáveis ​​e PMS segmentados com constante teor de fármaco de carga foram obtidos através de ensaios de estabilidade a curto prazo. a carga de droga fiável e sustentada comportamento liberando foram obtidos devido à remoção das drogas over-carregados.