Abstract

Fundo

marcadores atuais para o câncer de próstata, tais como PSA carecem de especificidade. Portanto, são necessários novos biomarcadores. Infelizmente, a complexidade dos fluidos do corpo, muitas vezes dificulta a descoberta de biomarcadores. Uma abordagem alternativa atractiva é o isolamento de pequenas vesículas, isto é, exossomas, -100 nm, que contêm proteínas que são específicas para o tecido a partir do qual eles são derivados e, portanto, pode ser considerado como caixas do tesouro para a descoberta de biomarcadores específicos da doença.

Materiais e Métodos

Os exossomas foram isolados a partir de 2 células imortalizadas de próstata primário epiteliais (PNT2C2 e RWPE-1) e 2 linhas de células de PCA (PC346C e VCaP) por ultracentrifugação. Depois da digestão tríptica, proteomic análises utilizaram um nanoLC acoplado com um LTQ-Orbitrap operado no modo em tandem MS (MS /MS). Massa precisa e abordagem tag Time (AMT) foi empregado para a identificação de péptidos e quantificação. biomarcadores candidatos foram validados por Western blot e imunohistoquímica.

Resultados

caracterização proteômica resultou na identificação de 248, 233, 169, e 216 proteínas por pelo menos 2 peptídeos em exossomos a partir PNT2C2, RWPE -1, PC346C, e VCaP, respectivamente. As análises estatísticas revelaram 52 proteínas diferentes abundantes entre as células APC e controle, 9 dos quais foram mais abundantes no CaP. Validação por Western blot confirmou uma abundância maior de FASN, XPO1 e PDCD6IP (ALIX) em exossomos APC.

Conclusões

Identificação de proteínas exosomal usando alto desempenho LC-FTMS resultou na descoberta de PDCD6IP , FASN, XPO1 e ENO1 como novos candidatos a biomarcadores para o câncer de próstata

Citation:. Duijvesz D, Burnum-Johnson KE, Gritsenko MA, Hoogland AM, Vredenbregt-van den Berg MS, Willemsen R, et al. (2013) proteômica Profiling de exossomas leva à identificação de novos biomarcadores de câncer de próstata. PLoS ONE 8 (12): e82589. doi: 10.1371 /journal.pone.0082589

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 16 de julho de 2013; Aceito: 25 de outubro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Duijvesz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Prostate Specific Antigen (PSA) é uma clinicamente útil. biomarcador de proteína para diagnóstico e acompanhamento após o tratamento de câncer de próstata (PCA). No entanto, o rastreio baseada em PSA foi demonstrado que têm um elevado risco de excesso de diagnóstico e tratamento excessivo porque carece de especificidade [1], [2]. A fim de diferenciar com mais precisão entre as doenças benignas da próstata e (diferentes formas) da APC, evitar biópsias da próstata desnecessárias, e apoiar o urologista em recomendar o tratamento ideal, são urgentemente necessários novos biomarcadores moleculares.

Nas últimas décadas , uma quantidade enorme de pesquisa tem sido realizada para encontrar novas e melhores biomarcadores para APC, muitas vezes usando tecnologias de espectrometria de massa state-of-the-art, mas a descoberta de nova proteína baixa abundância tem sido geralmente dificultada pela complexidade do soro ou na urina [3]. Isolamento de exossomos a partir de fluidos corporais representa uma abordagem atraente para contornar estas limitações e permitir a detecção do candidato (com abundantes baixas) biomarcadores.

Descobertas recentes na busca de novos biomarcadores têm revelado que as pequenas exossomos (50-150 nm) , estão presentes no soro e na urina [4]. Ao isolar exossomas a partir de fluidos do corpo, deve ser possível para superar o desafio gama dinâmica e facilitar a caracterização de proteínas de tecido /derivada-cancro que pode representar de forma mais precisa as condições celulares. Portanto exosomes poderia ser útil para determinar as características do tumor individuais [5], [6].

Neste estudo, nosso objetivo foi determinar a presença e importância das proteínas exosomal como novos biomarcadores candidatos para CaP comparando exossomos a partir linhas de células de próstata não-cancerosas para exossomos de linhas celulares APC.

Materiais e Métodos

cultura celular e isolamento

Duas linhas de células epiteliais da próstata humana imortalizada (PNT2C2 [7] e RWPE-1) e duas linhas de células de PCA (PC346C [8] e VCaP [9]) foram cultivadas em 10 T175 (175 cm

2) frascos de cultura (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) até 80- 100% de confluência. A linha celular VCaP PNT2C2 e foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Lonza, Verviers, Bélgica) e suplementado com 5% e 10% de FCS, 500 U de penicilina e 500 U de estreptomicina (Lonza, Verviers, Bélgica). A-1 RWPE linha de células (ATCC-LGR, Wesel, Alemanha) foi cultivada em queratinócitos isento de soro Médio (Invitrogen, CA, EUA) e suplementado com 5 mL de Pen-Strep e um kit comercial contendo Bovino Pituitário Extract (BPE, 0,05 mg /ml) e o factor de Crescimento epidérmico (EGF, 5 ng /ml). A linha celular PC346C foi cultivada em meio Ham-meio de Eagle modificado por Dulbecco de F-12 (Lonza), suplementado com vários aditivos, tal como descrito por Marques [10].

Depois de atingir a 80-100% de confluência, as células foram incubadas com meio isento de soro de 25 ml. Após 48 h, o sobrenadante foi recolhido e submetido a passos de centrifugação de 400 ×

g

(10 min), 3000 ×

g

(20 min), e 10000 ×

g

(30 min) para remover os detritos celulares. Os exossomas foram então sedimentados a 64000

g

(110 min), e em 100000

g

(gradiente de sacarose) durante 1 h [11]. Pelo menos dois isolamentos exossomas separadas de cada uma das quatro linhas de células foram reunidas. montante total e concentração de proteínas exosomal das amostras colectivas foi medida com um BCA-ensaio (Pierce, Rockford, IL, EUA).

Electron Microscopy (EM)

5 mL de exossomos foram manchado em grades Formvar-revestidos (200 mesh) e fixados em paraformaldeído 2%. Após a fixação, os exossomas foram coradas negativamente usando 4% uranylacetate. Grelhas foram examinadas por um microscópio electrónico Philips CM100 a 80 kV.

A preparação das amostras para Espectrometria de Massa de

TFE (2,2,2-trifluoroetanol) (Sigma-Aldrich) foi adicionada às amostras a uma concentração final de 50%. As amostras foram sonicadas num banho de gelo-água (Branson 1510, Danbury, CT) durante 2 minutos e, em seguida, incubadas a 60 ° C durante 2 h, com agitação constante (300 rpm). Para ponte de dissulfureto da proteína de redução (S-S), DTT (ditiotreitol) (Sigma-Aldrich) foi adicionado a uma concentração final de 2 mM, seguido por sonicação durante 2 minutos. As amostras foram centrifugadas e incubadas a 37 ° C durante 1 h com agitação (300 rpm). As amostras foram diluídas, cinco vezes com bicarbonato de amónio 50 mM (pH 7,8) antes da adição de tripsina modificada de grau de sequenciação (Promega, Madison, WI) para a digestão de proteína (1:50 w /w-tripsina a-proteína). As amostras foram agitadas (300 rpm) durante a noite (16 h). Congelação rápida das amostras em azoto líquido apagaram a digestão. Todas as amostras foram concentradas em Speed-Vac SC 250 Express (Thermo Savant, Holbrook, NY).

Espectrometria de massa

medições proteômica foram realizadas utilizando um nanoLC-MS no Laboratório de Ciência Molecular Ambiental (EMSL), Richland, WA, EUA. A plataforma analítica consistiu de uma (5000 psi) on-line pressão constante de fase inversa (C

18) cromatografia líquida de sistema (RPLC) [150 mm id × 360 mm × 65 centímetros od capilar (Polymicro Technologies Inc., Phoenix , AZ)] acoplado a um espectrómetro de massa LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) através de um ionização por electrospray (ESI) fonte fabricado em casa [12]. Resumidamente, MS total foram adquiridas ao longo do

m

/

z

gama de 400-2000 na resolução de 100.000, seguido por dependentes de dados LTQ MS /MS para os seis melhores íons mais abundantes em cada MS verificação completa, usando uma configuração de energia de colisão de 35% e tempo de exclusão dinâmica de 60 s. Um gradiente de HPLC exponencial de -100 min (0-70% de B) foi usada para cada análise, com fases móveis que consiste em ácido fórmico a 0,1% em água (A) e 0,1% de ácido fórmico em ACN (B). Cada amostra foi analisada em triplicado, com cerca de 5 ug de péptido total consumido (isto é, carregada na coluna) em cada análise.

Espectrometria de Massa de Análise de Dados

Os dados de MS resultante foi analisada usando o PNNL desenvolvido Massa precisa e Tag gasoduto Time (AMT) [13]. software SEQUEST [14] foi usado para procurar espectros de massa em tandem contra o banco de dados humana UniProt (download em 5 de Abril de 2011). peptídeos confiança identificados (Tabela S1 no arquivo S1) foram reunidos em um banco de dados tag AMT-specific exosome. Para as análises comparativas, características LC-MS foram comparados com as tags AMT para a identificação e intensidades MS-pico relativas foram utilizados para obter a mudança em abundância. abordagem tag AMT facilitado quantificação de muitos outros peptídeos do que contar espectral sozinho. Contanto que um péptido foi identificado em, pelo menos, uma amostra /análise (por conjunto MS), que pode ser quantificada em todos os conjuntos de dados em que foi verificada, mesmo se o recurso LC-MS não era suficientemente abundante para ser fragmentado em que a análise nomeadamente . software VIPER [15] foi utilizado para correlacionar entradas tag AMT (peptídeos identificados) com LC-MS funções que dependam de precisão de medição de alta massa (MMA 2 ppm) e precisão tempo de eluição normalizada (NET~2.5%). Consequentemente, cada recurso de LC-MS combinado de volta para um único peptídeo (tag AMT) dando assim um valor de pico de intensidade (ou abundância relativa), para que o peptídeo. Para identificação de péptidos redundantes no caso de um único péptido correspondentes proteínas múltiplas (tipicamente de isoformas de proteínas) uma proteína representive foi escolhido; portanto, cada peptídeo relatada corresponde a uma única proteína. Não identificações peptídeos foram feitas sozinho em massa.

Para as 263 proteínas identificadas, o Banco de Dados de proteína humana de referência (HPRD) e Ingenuity Pathway Analysis (IPA) foram utilizados para determinar a localização subcelular e função biológica [16].

Seleção de potenciais biomarcadores de proteína para câncer de próstata foi realizada utilizando duas abordagens independentes. Primeiro, foram selecionados proteínas que estavam presentes em ambas as linhas de células exossomos derivados APC e ausente em ambos os exossomos non-PCA. Com a segunda abordagem, software Dante [17] foi utilizada para converter valores de intensidade de pico peptídeo a uma escala log2 e avaliá-los a um nível de proteína utilizando (scaling base de péptido de referência) Rrollup parâmetros onde peptídeos foram excluídos do dimensionamento se eles não foram vistos em pelo menos três conjuntos de dados e sem a presença mínima de péptido foi necessário. Proteínas apresentados neste manuscrito foram identificadas por pelo menos dois peptídeos. comparações emparelhadas por ANOVA entre cada CaP e linha de células de controlo foram também realizadas na dante em que o número mínimo de pontos de dados por nível de factor foi fixado em três, de modo que, para uma proteína para mostrar alterações estatisticamente significativas que teria de ser identificados em todos três repetições. Diferença significativa foi determinado como um valor de p e q-valor inferior a 0,05. Dante gera valores de p e estima seus valores de q. O q-valor de um teste mede a proporção de falsos positivos incorridos (chamado de taxa de descoberta false) quando esse teste em particular é chamado significativo. Só foram seleccionados os significativamente diferentes proteínas de agrupamento hierárquico não supervisionado. software de cluster e TreeView foi usada para log transformação, os valores médios de expressão relativa centro, e, posteriormente, hierárquicas de cluster todas as proteínas com base na sua expressão [18]. Para seleccionar ainda as proteínas mais promissoras, a≥1.5 log2 mudança dobra de corte foi aplicada juntamente com a exigência de que cada proteína mostrou alteração significativa em pelo menos dois dos quatro comparações listados na Tabela 1. Tabela 1 lista os 52 proteínas resultantes, 9 de que mostraram aumento (e 43 diminuída) abundância em exossomos derivados das células APC.

Para selecionar ainda mais as proteínas mais promissoras das duas abordagens, as proteínas foram dimensionados com base preferentemente de próstata. Cinco atlas de expressão de genes humanos diferentes [19] – [23], com base em dados de expressão de microarray foram combinados em SRS [24], para determinar a expressão do gene-proteína correspondente. Eventualmente, preferentemente de próstata foi determinado como 1,5 vezes maior expressão no tecido da próstata em comparação com rim e tecido da bexiga usando dados de expressão gênica de microarray [25].

Western blot

De cada amostra exosome 5 ug de misturou-se a proteína com tampão de amostra de Laemmli (01:01), aquecida a 95 ° C durante dois minutos e carregado em géis de 10% SDS-PAGE unidimensionais. Subsequentemente, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose Protran (Whatman de Hertogenbosch, Países Baixos) e bloqueados (1 hora) à temperatura ambiente com leite seco sem gordura 5% em Tris-tamponada salina com 0,1% de Tween-20. Em seguida, os géis foram incubados durante a noite a 4 ° C com anticorpos contra: PDCD6IP (1:500 diluição, Sigma-Aldrich), FASN (1:500 diluição, Sigma-Aldrich), XPO1 (1:200 diluição, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha), ENO1 (clone H300, 1:1000 diluição, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (clone 7B, 1:500 diluição, Santa Cruz Biotechnology), CD9 (clone 209306, 1:500 diluição, R D Systems, Abingdon, Reino Unido), PSA (clone A0562, 1:500 diluição, DakoCytomation, Heverlee, Bélgica). anticorpos secundários (HRP-conjugado de cabra anti-murganho /coelho, 1:10,000 diluições, DakoCytomation) foram incubadas durante 1 h. BM Quimioluminescência Blotting Substrato (POD, Roche Applied Science, Almere) foi usado para iniciar a oxidação pelo HRP

imuno-histoquímica (IHQ)

análise de expressão IHC de biomarcadores candidatos foi realizada em:. Normais da próstata tecidos (NAP, n = 2), o PCA Gleason 3 + 3 = 6 (n = 2), e PCA Gleason 5 + 4 = 9 (n = 2). Tecidos lâminas foram montadas em lâminas de vidro revestidas aminoacetylsilane (Starfrost, Berlim, Alemanha), deparaffinised em xileno e desidratadas em etanol. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 0,3% de peróxido de hidrogénio em PBS durante 20 min. Micro-ondas pré-tratamento foi realizado durante 15 min em Tris (hidroximetil) aminometano-EDTA (pH 9,0). Após o pré-tratamento, as lâminas foram incubadas com o PDCD6IP (1:400), FASN (01:50), e XPO1 (1:50) de anticorpos, durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, o kit EnVision DAKO (DAKO, Glostrup, Dinamarca) foi usado para visualização cromogénico. Após a coloração as lâminas foram contrastadas com hematoxilina, lavados, desidratados e montados em malinol (Chroma-Geselschaft, Korgen, Alemanha).

Resultados

Isolamento e caracterização

Electron Microscopy (eM) das amostras de exossoma purificada revelou que vesículas derivadas de quatro linhas celulares são relativamente homogéneas em tamanho, com um diâmetro aproximado de 70-200 nm (Figura 1).

Todas as amostras de exossoma conter várias vesículas com um tamanho na gama de 70-200 nm. A escuridão das vesículas reflete a diferença de densidade de exossomos entre as amostras.

LC-MS analisa /MS após digestão tríptica, identificou 1494 peptídeos não redundantes (Tabela S1 no arquivo S1), correspondendo a 496 proteínas por, pelo menos, um péptido (Tabela S2 no ficheiro S1). 263 proteínas foram identificadas, pelo menos, 2 péptidos, e, especificamente, 248, 233, 169, 216 e as proteínas foram identificadas no PNT2C2, RWPE-1, e células PC346C VCaP linhas, respectivamente (Tabela S3 no ficheiro S1). agrupamento hierárquico não supervisionado dessas 263 proteínas resultou em uma clara distinção entre câncer e linhas celulares de controlo (Figura 2).

Cada amostra exosome foi analisada em triplicado. Os resultados foram significa centrado e log-transformada. abundância relativa de proteína é de cor-codificado com vermelho correspondente a uma relativamente alta abundância, r verde corresponde a uma abundância relativamente baixo, e cinza indicando valores de abundância em falta.

As proteínas exosomal identificadas nas linhas celulares 4 apresentaram padrões semelhantes de localização subcelular (Figura 3A). Quando comparado com todas as proteínas incluídos no banco de dados do IPA, exosomes contêm, relativamente falando, proteínas mais citoplasmáticos e quase nenhum proteínas extracelulares. A maioria das proteínas são detectadas em exossomas referem-se a tumorigénese, a morte celular, a síntese proteica, o crescimento e a proliferação celular (Figura 3B).

exossomas a partir de todas as quatro linhas celulares (PNT2C2, RWPE-1, PC346C, VCaP) continha 60% de proteínas citoplasmáticas e 25% de proteínas transmembranares. B. Os sete principais funções das proteínas exosomal acordo com Ingenuity Pathway Analysis. O teste exato de Fisher foi aplicado para calcular significância (valor-p 0,05).

Seleção de potenciais biomarcadores

Para selecionar as proteínas que mostram uma mudança significativa em abundância entre os exossomos APC e não -PCa exosomes usamos comparações de pares ANOVA (isto é, valor-p e q-valor 0,05, a presença em todas as análises, ≥2 peptídeos) [17]. Tabela S4-8 no arquivo S1 conter resultados obtidos para a PC346C (PCA) vs. PNT2C2 (controle), PC346C (PCA) vs. RWPE-1 (controle), VCaP (PCA) vs. PNT2C2 (controle), e VCaP ( CaP) vs RWPE-1 (controle). Para melhorar ainda mais confiança, é necessário que cada proteína foi determinado como sendo significativamente mudando em abundância em pelo menos 2 comparações; este ainda mais reduzida nossa lista para 52 proteínas (Tabela 1 e Tabela S9 no arquivo S1).

A nossa análise proteômica indicado PDCD6IP, FASN, CD9 e ENO1 ter mudança significativa em abundância entre duas condições, enquanto XPO1 fez não passe os nossos critérios de filtragem rigorosos e, portanto, foi considerada inalterada em abundância na VCaP vs. comparação RWPE-1 (Tabela S8 no arquivo S1). Mesmo assim, optou-se por validar XPO1 devido à sua maior abundância em exossomos VCaP relação ao controle RWPE-1 e a disponibilidade de um anticorpo de alta qualidade adequado para Western blot e imunohistoquímica.

Exploração de novos biomarcadores candidatos

para FASN e XPO1, foram observados sinais fortes em lisados ​​de células inteiras, em comparação com os exossomas e não parece ser relativamente maior abundância na amostra exossomo VCaP (Figura 4). O PDCD6IP proteína é enriquecida em exossomas e mostra maior abundância em ambas as amostras de exossoma PCA-derivados, tal como representado na Figura 4 e na Tabela 1. Com base em análises de MS, FASN é significativamente mais elevada nos exossomas PC346C comparado com ambos os controlos e em exossomas VCaP comparado para RWPE-1 controle. Esta maior abundância de FASN em PC346C é confirmada por transferência de Western. CD9 é altamente enriquecido em exossomas e mostra relativamente elevada abundância nos exossomas PC346C. XPO1 apresentaram maior abundância nas exosomes VCaP relação aos controles. dados de MS ENO1 caracterizadas ser significativamente diminuída em abundância em PC346C comparado com ambos os controlos e nas VCaP comparação com o controlo PNT2C2. Western blotting de ENO1 revelou uma banda adicional (aproximadamente 30 kDa) nas duas amostras de exossoma PCA-derivados. Como esperado, com base na diferença na secreção e PSA-formação exossomo, PSA é predominantemente presente nas duas amostras de células de cancro e ausente em exossomas. Os sobrenadantes que foram recolhidos após exosomes foram peletizadas durante ultracentrifugação, não continha qualquer uma das proteínas exosomal, exceto ENO1 e GAPDH exclusivamente em meio VCaP.

Todos os quatro amostras exossomo e suas linhas de células correspondentes foram utilizados para validação. Além disso, o sobrenadante dos exossomas peletizadas foi utilizada como um controlo. As proteínas seleccionadas FASN, XPO1, CD9 e PDCD6IP, foram testados com ENO1 e de GAPDH como controlo. PSA foi testado para confirmar que é secretada através de via de secreção alternativo e, portanto, não apresentar no prazo de exossomos. O marcador de proteína mais próximo (kDa) é indicada para cada blot.

Verificação de expressão em amostras clínicas

PDCD6IP mostraram forte luminal e coloração basal epitelial citoplasmática na próstata normal adjacente (NAP) , sem alteração na expressão da proteína no tecido APC com diferentes escores de Gleason (Figura 5). Na NAP, FASN é moderadamente a altamente abundante em células epiteliais. No entanto, quando Gleason pontuação aumenta, a coloração torna-se mais forte. Em relação XPO1, há uma abundância nuclear forte no NAP e uma coloração citoplasmática fraca. Dentro das células APC, a abundância citoplasmática aumenta com a pontuação de Gleason. coloração nuclear permanece igual entre todos os tecidos APC.

imagens representativas da coloração de 2 amostras independentes por grupo.

Discussão

Comparação de exossomos derivados de células de câncer e linhas de células imortalizadas epiteliais da próstata, fornece uma ferramenta poderosa para superar o desafio gama dinâmica e identificar novos biomarcadores baixa derivada-cancerosas abundantes. Esta abordagem única no âmbito da investigação de proteínas exosomal, combinado com state-of-the-art LC-MS análises facilitou a identificação de novos biomarcadores candidatos para CaP. Este estudo descreve a expressão da proteína exosomal a partir de múltiplas linhas de células APC, mas também examina o conteúdo exosome a partir de múltiplas células epiteliais da próstata normais imortalizadas. Em comparação com estudos anteriores, este nos permite identificar de forma mais confiável PCA-específica biomarcadores candidatos e proteínas comum exosomal. Usando Western blot e IHC, verificamos expressão diferencial e mostrar que os marcadores candidatos são expressos pelas células de câncer de próstata em amostras de pacientes.

O número total de proteínas específicas foram identificados neste estudo (496 por ≥1 peptídeo, 263 por ≥2 péptidos), é comparável com os relatórios previamente publicados proteomic exossoma. [26] – [30]. Atribuição de uma localização subcelular revelou que uma grande proporção de proteínas normalmente exosomal localizar no citoplasma ou no núcleo das células. Depois de comparar isso a um banco de dados contendo uma grande maioria de todas as proteínas (~20,000), percebemos que exossomos ter uma abundância relativamente comparáveis ​​de proteínas nucleares, maior abundância de proteínas citoplasmáticas e uma abundância substancialmente menor de proteínas extracelulares. Isso se encaixa a teoria atual de formação exosome [4]. Os exossomas exibir uma sobre-representação de transmembrana e citoplásmicos, tais como proteínas, CD9 e PDCD6IP, como mostrado por Western blot. Este achado concorda com a teoria de que a biogênese e seleção de conteúdos exosomal não é um procedimento aleatório, mas pelo menos em parte, o resultado de um processo de separação selectiva [4].

Dois estudos recentes proteômica revelou proteínas exosomal relacionados à próstata cancro [30], [31]; Sandvig

et ai.

Realizada análise por LC-MS numa linha de células de próstata único (cancro), foram-Hosseini Beheshti

et ai.

Examinados cinco linhas de células APC e um epitelial de próstata não maligna linha celular. Ambos relataram 266 e 220 proteínas, que é semelhante ao número revelamos. Curiosamente, Sandvig

et al.

Relataram uma distribuição diferente da proteína subcelular e correlação com os processos biológicos em comparação com nossos dados. Sandvig

et al.

Proposta CDCP1 e CD151 como marcadores candidatos, foram Hosseini Beheshti-sugeriu ANXA2, CLSTN1, FLNC, FOLH1 e GDF15. Hosseini Beheshti-

et al., Também

mostrou FASN ser um biomarcador candidato derivados de exossomos (de acordo com os nossos resultados). Quando comparamos as suas proteínas identificadas (por 2 peptídeos), notamos uma sobreposição de apenas 9 proteínas, respectivamente CD9, ANXA1. ACTB, PGK1, RAN, EPCAM, HSPB1, PDCD6IP e PRDX1 (Figura 6). Estas proteínas têm sido publicados anteriormente em vários artigos e são considerados estar presentes em quase todos os exossomas. PDCD6IP também foi identificado por ambos investigadores, mas não foi encontrada para ser mais abundante em exossomas PCA-derivados. Um total de 199 proteínas foram excepcionalmente encontrado em nosso estudo, incluindo a XPO1 biomarcador candidato. A sobreposição entre os estudos é bastante limitado. Particularmente, uma sobreposição de apenas 42 proteínas entre o nosso estudo e Hosseini-Beheshti

et ai.

Não é esperado uma vez partido as mesmas linhas celulares foram utilizadas (VCaP e RWPE-1). Esta sobreposição estreita poderia ser o resultado de diferentes purificação, tecnologias MS-MS e pipelines de processamento de dados utilizados. Além disso, se exossomas contêm uma grande colecção de proteínas diferentes, se sobrepõem entre bases de dados pode ser limitado se apenas uma fracção de todas as proteínas é identificada em cada estudo. Um relatório recente do Principe

et al.

Mostrou a primeira identificação de mais de 900 proteínas em exossomos derivados de fluido da próstata humana de pacientes com baixo grau e CaP homens saudáveis ​​[32]. Quando comparamos a sua expressão única proteína (presença de 2 peptídeos), apenas 31 proteínas se sobrepõem, incluindo várias anexinas (ANXA1-7), peroxirredoxinas (PRDX1-6), PDCD6IP e proteínas transmembranares geral (CD9 /CD242 /CD44). Todas estas proteínas são pensados ​​para estar presente em quase todos os exossomas. Até que ponto a sobreposição limitada é devido a diferenças reais entre exossomos e vesículas a partir de amostras clínicas derivado da linha de células, ainda precisa ser estabelecida.

O número de proteínas identificadas em cada estudo são uma compilação do Câncer proteínas exosomal derivados identificadas pela MS-MS.

Foram identificados PDCD6IP como sendo enriquecido em exossomos, especialmente em exossomos APC. PDCD6IP, também conhecido como Alix é uma proteína citoplasmática que é conhecida pelo seu papel na apoptose e é mostrado para ser envolvido na via de ordenação seleccionado pelo ESCRT-complexos [33]. PDCD6IP tem sido utilizado como um marcador geral para provar a presença de exossomas [34]. No entanto, nenhuma associação foi feita com uma abundância maior em exossomos-câncer. Uma possível explicação para a abundância alta PDCD6IP em exossomos PCA-derivados poderia ser que as células CaP ter uma produção alterada de exossomos, onde eles são incapazes de regular a classificação do conteúdo exosomal corretamente mais. É também possível que as células cancerosas tente remover a proteína PDCD6IP por secreção de exossoma (parcialmente) suprimir a apoptose. Para complementar esta teoria, outros estudos não-PCA relacionados mostraram que a superexpressão de PDCD6IP correlaciona-se com a morte celular [35]. Usando IHC, não encontramos qualquer diferença no PDCD6IP abundância entre o epitélio da próstata normal e tecido CaP.

Ambos FASN e XPO1 ter uma maior abundância em exossomos CaP derivadas de células VCaP. FASN catalisa a formação de ácidos de cadeia longa a partir de acetil-CoA, a malonil-CoA e NADPH e já tem sido sugerida como um marcador para CaP [36], [37]. Estudos recentes mostraram que FASN é expressa principalmente em células sensíveis a hormona, promover a proliferação de células e que a inibição da FASN eficazmente e selectivamente mata células cancerosas [36]. No entanto, estes estudos foram todos realizados

in vitro

. A linha de células VCaP aqui utilizada é sensível a hormônio, o que poderia explicar a maior abundância de FASN em exossomos VCaP derivados. As células cancerosas produzir mais FASN, provavelmente porque promove a proliferação celular, o que poderia levar a uma maior incorporação nos exossomas. De acordo com os resultados anteriores [38], também observamos um aumento da abundância em CaP em comparação com NAP.

XPO1 tem sido sugerida como um marcador de prognóstico para outros tipos de câncer [39]. XPO1 é uma proteína nuclear conhecida por estar envolvida na exportação nuclear-citoplasmático do sinal de suporte de proteínas (NES), que desempenham um papel nas vias de sinalização tumorais relevantes, tais como p53, AKT1, HDAC5, o receptor de androgénio (AR) e o EGFR [40] – [42]. Nossas descobertas indicam que XPO1 poderia ser um potencial biomarcador para CaP. Quando esta proteína é validado em seção inteira amostras APC com o IHC, observamos uma expressão nuclear forte e uma expressão citoplasmática muito fraco. Curiosamente, dentro de células cancerosas, esta proteína parece translocar para o citoplasma. Com o aumento da escala de Gleason, expressão XPO1 citoplasmática se torna mais intensa. Por que esse processo ocorre ainda não está claro. Em uma célula normal, XPO1 tem que ser transportado do citoplasma para trás no núcleo, a fim de funcionar como uma proteína de chaperona. Se este processo de realocação é inibida no cancro, XPO1 citoplasmática irá acumular e mais XPO1 pode ficar incorporada em exossomos.

Conforme publicado anteriormente, uma banda de proteína adicional (aproximadamente 30 kDa) aparece com Western blot quando se utiliza um anticorpo dirigido contra ENO1 na linha celular PC346C [43]. Aqui nós mostramos que esta banda também está presente em exossomos VCaP e ausente em exossomos de duas linhas de células não-PCA. A origem da banda adicional pode ser um anticorpo não específico de reacção cruzada com uma outra proteína, uma alternativa spliced ​​ENO1, um fragmento traduzido ou um produto de decomposição da proteína inicial. Uma isoforma de proteína conhecida chamada MBP-1 (c-myc-promotor de ligação proteína-1) é produzida forma o gene ENO1 [44]. MBP-1 é idêntica em sequência para ENO1 mas não possui os primeiros 93 ou 96 aminoácidos. Com uma massa molecular calculado de 36 kDa, MBP-1 é improvável que o estimado de 30 kDa banda adicional. A observação de que esta banda adicional ocorre apenas em ambas as amostras cancerosas poderia indicar que ele pode ter uma relação com CaP.

Os novos marcadores que identificamos veio de exossomos de linha de celulares. Embora presença exosomal e expressão tecido de cancro de um conjunto selecionado de candidatos a biomarcadores foi confirmada utilizando Western blot e IHC, validação independente dos marcadores candidatos ainda é necessária em uma grande colecção de amostras tais como exossomos urinário de pacientes ou amostras de tecido. Isto irá elucidar seu papel como um biomarcador para CaP.

A fim de testar a presença de proteínas exosomal em grandes coortes de amostras de doentes, pode-se recorrer a IHC padrão de marcadores candidatos em microarrays de tecido e biópsias da próstata. Em alternativa, os exossomas intactos podem ser isolados a partir da urina ou do plasma usando precipitação, filtração ou protocolos de imunocaptura, após o que o conteúdo de exossomas podem ser medidos por ELISA, específico para as proteínas de interesse. ELISAs estão actualmente a ser desenvolvido para a detecção de exossomos derivados de próstata intactas utilizando anticorpos de captura ou detecção dirigidos contra proteínas transmembrana específicos da próstata conhecidos. Um tal ensaio permite um para identificar a expressão de proteínas transmembranares, mas também estimar o número de exossomos.

Conclusão

Prostate (cancro) células secretam exosomes que podem ser usados ​​para identificar novos biomarcadores candidatos para CaP . Identificação de proteínas exosomal por alto desempenho LC-FTMS resultou na descoberta de PDCD6IP, FASN, XPO1 e ENO1 como novos biomarcadores candidatos à PCA. Na próxima fase, todos os biomarcadores candidatos propostos serão avaliados nas amostras de pacientes (tecido, soro ou urina) para elucidar plenamente o seu valor clínico potencial.

Informações de Suporte

arquivo S1.

Informação de apoio que contém 9 arquivos de suporte de informação. Tabela S1 no arquivo S1: peptídeos Confidently identificados (n = 1494) foram reunidos em um banco de dados tag AMT-specific exosome. Tabela S2 no ficheiro S1: 1494 péptidos não redundantes corresponde a 496 proteínas por pelo menos um péptido.