Abstract

Alfa-fetoproteína (AFP) -producing câncer gástrico (AFPGC) , representada pela produção de AFP, tem um comportamento mais agressivo do que o câncer gástrico comum. Os mecanismos subjacentes não são bem compreendidos. O trióxido de arsénio (A

2O

3) é utilizada clinicamente para tratar a leucemia promielocítica aguda (APL) e tem actividade de

In vitro

contra várias linhas celulares de tumores sólidos, com a indução de apoptose e inibição da proliferação os efeitos principais. transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) tem um papel importante em tumorigénese de vários cancros primários e células de cancro por upregulating célula-a sobrevivência e downregulating proteínas supressoras de tumor. Aqui, encontramos diminuição da expressão de AFP e STAT3 após a indução de apoptose por Como

2O

3 nas células AFPGC FU97. Além disso, o nível do oncogene alvo STAT3 Bcl-2 foi reduzida com A

2O foi aumentada

3, e que o supressor de tumor de Bax. Além disso, a expressão STAT3 e profundidade de invasão e metástase ganglionar foram associados. Sobrevida de pacientes com câncer gástrico foi menor com AFP e STAT3 dupla superexpressão do que com superexpressão de isoladamente. Regulação negativa da expressão de AFP e STAT3 desempenha um papel importante na medida

apoptose induzida por 3 2O

de células AFPGC, o que sugere um novo mecanismo de A

2O

3-induzida apoptose celular. Como

2O

3 pode ser um possível agente para o tratamento AFPGC

Citation:. Jia Y, Liu D, Xiao D, Ma X, Han S, Zheng Y, et al. (2013) Expressão da AFP e STAT3 está envolvido em trióxido de arsénico-apoptose induzida e inibição da proliferação em células AFP-Producing câncer gástrico. PLoS ONE 8 (1): e54774. doi: 10.1371 /journal.pone.0054774

editor: Matias A. Avila, Universidade de Navarra Escola de Medicina e Centro de Investigação Médica Aplicada (CIMA), Espanha |

Recebido: 04 de novembro, 2012; Aceito: 14 de dezembro de 2012; Publicação: 30 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é suportado por Natureza National Science Foundation Grant da China (NSFC, No. 81000869 e 81272588). (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Alfa-fetoproteína (AFP) é uma das principais proteínas do plasma produzido pelo saco vitelino e do fígado durante a vida fetal. Na prática clínica, a AFP é frequentemente utilizado como um marcador tumoral do carcinoma hepatocelular e gema de tumores do saco. Alguns estudos demonstraram que os outros tumores em humanos também podem produzir AFP e cancro gástrico foi uma das mais comuns [1] – [8]. AFP produtoras de câncer gástrico (AFPGC) tem um comportamento mais agressivo do que o câncer gástrico comum porque a doença progride rapidamente e metástases com frequência nos gânglios linfáticos regionais e fígado [7] – [10]. Além disso, AFPGC está associado com menor metástase hepática livre de intervalo após a cirurgia radical, ea taxa de sobrevivência é significativamente mais pobres com AFPGC do que sem produção AFP [1], [9], [10]. Assim, a AFP pode ser um marcador tumoral passiva e um estimulador de crescimento de tumor activo. Downregulating expressão AFP pode ser uma abordagem eficaz à AFP produtoras de câncer

trióxido de arsênio (As

2O

3) foi usada com sucesso para tratar a leucemia [11] -. [13] e está ativo em diversos tumores sólidos, incluindo o cancro gástrico [14]. O mecanismo de acção do A

2O

3 inclui afectar as actividades da AKT, quinases JNK, NF-kB, a glutationa, a sinalização de cálcio, espécies reactivas de oxigénio (ROS), e as caspases, bem como pro- e anti proteínas -apoptotic [15] – [18]. Nenhuma quimioterapia padrão é disponível para AFPGC, embora alguns regimes demonstraram eficácia em um pequeno número de casos [19] – [21]. Além disso, os efeitos e o mecanismo de A

2O

3 contra AFPGC permanecem obscuros.

transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) está envolvido na transdução de sinal e tanto a activação de transcrição e tem papéis importantes em vários processos biológicos, tais como o metabolismo e a tumorigénese [22], [23]. STAT3 é activada constitutivamente em uma ampla variedade de tipos de cancro [24], [25]. Segmentação STAT3 pode ser uma abordagem eficaz para tratar a progressão do tumor. Este efeito STAT3 é mediado através de uma regulação de vários genes alvo STAT3, incluindo inibidores de apoptose e reguladores do ciclo celular, tais como Bcl-2, Mcl-1, a survivina, p53, c-myc, ciclina D1 [26] – [31], e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [32]. No entanto, o papel da STAT3 em AFPGC é mal compreendida.

Aqui, nós examinamos o efeito de Como

2O

3 sobre a proliferação e AFP e expressão STAT3 em células AFPGC FU97. Foram avaliados os eventos a jusante da STAT3 sinalização, Bcl-2 e expressão Bax, para explorar os possíveis mecanismos subjacentes a este fenómeno. Além disso, avaliamos a expressão de AFP e STAT3 por imuno-histoquímica em amostras de câncer gástrico humanos. Downregulation AFP e expressão STAT3 contribuiu para Como

2O apoptose e inibição da proliferação

3-induzida em AFPGC.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

A protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética andHuman Clínica Comité do Hospital Central Jinan Medical julgamento. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

Cultura de Células e Tratamento de Drogas

A linha celular humana AFPGC FU97 foi obtido a partir da coleção japonesa dos recursos biológicos de Pesquisa (Japão) e foi mantida em DMEM ( Invitrogen) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS;. Invitrogen), com 1% de antibióticos, a 37 ° C em 5% de CO

2 ar humidificado

a

2O

3 ( Sigma) foi dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1 mol /L como uma solução estoque e armazenado a 4 ° C. Para

In vitro Use, a solução-mãe foi diluída para a concentração apropriada em meio de crescimento sem FBS. Exponencialmente as células em crescimento foram tratados com A

2O

3 em concentrações finais de 1, 5, ou 10 umol /L. As culturas de controlo foram tratados com PBS destilada a uma concentração final de 0,1% em meio de cultura. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

MTT Ensaio de citotoxicidade

O efeito da medida

2O

3 na inibição

in vitro

foi determinada crescimento de células FU97 medindo MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio) tingir absorvância de células vivas. FU97 células foram semeadas em placas de 96 poços a 1,6 x 10

3 células por poço em 100 ul de DMEM contendo 10% de FBS durante a noite. Depois de exposição a várias concentrações de A

2O

3 para 24, 48 e 72 h, 20 mL (5 g /L) de MTT (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionada a cada poço e as placas foram incubou-se durante um adicional de 4 h a 37 ° C. Formazina foi dissolvido em 150 mL sulfóxido /poço de dimetilo (DMSO) e a absorvência foi detectada a 490 nm. Velocidade de inibição (%) = (1-Um valor no grupo experimental /Um valor no grupo de controlo) x 100%. O grupo 0 mmol /L foi utilizado como testemunha.

DNA Análise de Fragmentação por eletroforese

Um total de 10

6 células foi suavemente raspadas dos pratos, lavadas duas vezes em PBS frio, e centrifugado a 15000 rpm durante 10 min, em seguida lisaram-se em 200 uL de tampão de lise (1 mL de tampão Tris 1 M-HCl, pH 7,4, 0,2 mL de ácido etilenodiaminotetra-acético 0,5 M [EDTA], 0,5 mL de 10% de Triton X-100 ). As células lisadas foram mantidas a 4 ° C durante 10 min, e os sobrenadantes foram incubados com 2 ul de ARNase A (10 mg /mL em tampão de Tris-EDTA) a 50 ° C durante 30 min, em seguida, com 2 ul de proteinase K (10 mg /ml em água destilada) durante 45 min a 50 ° C. A solução foi misturada com NaCl 5 M (20 mL) e 2-propanol (120 mL), incubados a 20 ° C durante 24 h, depois centrifugada a 15000 rpm durante 20 min. O ADN precipitado foi dissolvido em Tris-EDTA (5 mL) foram submetidos a electroforese em tampão e com o gel de agarose a 2% e tampão de Tris-acetato-EDTA a 50 V. O padrão de fragmentação do ADN foi visualizado com o uso de um transiluminador de UV.

Hoechst 33258 coloração Análise de apoptose celular

células cultivadas nas lamelas de vidro foram fixadas com paraformaldeído a 4% /PBS durante 30 min, lavou-se durante 15 min em 0,1% de Triton X-100 /PBS e incubadas no escuro com Hoechst 33258 (10 ug /ml) durante 15 min. Depois de as lamelas foram lavadas em PBS, núcleos positivos foram contadas. núcleos normais e núcleos apoptóticos (condensadas ou cromatina fragmentada) foram facilmente distinguidos.

Quantitative PCR em tempo real

As células foram cultivadas com Como

2O

3 (5 mmol /L ) durante 72 h. O ARN total foi extraído com o uso de reagente de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e quantificado por espectrofotometria. O ADNc da primeira cadeia foi preparado com a utilização de iniciadores aleatórios seguindo as instruções do kit (Takara, Japão). PCR em tempo real quantitativa de AFP, STAT3 e os seus genes a jusante envolvido o sistema de PCR em tempo real 7300 (ABI, EUA) com reagentes Takara SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japão). Os iniciadores foram concebidos e validados por Invitrogen. A informação de iniciadores é na Tabela 1. As reacções de PCR foram realizadas em triplicado num volume de 20 uL, durante 2 min a 94 ° C para desnaturação inicial, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 30 s e a 60 ° C durante 45 s. Um gene GAPDH de limpeza de controlo foi utilizado como um controlo interno. Cada conjunto de iniciadores foi primeiro testado para determinar as concentrações óptimas, e os produtos foram corridos num gel de agarose a 1% para confirmar o tamanho apropriado. Subsequentemente, o software ABI curva de dissociação foi usado para controlar várias espécies de cada amplificação por PCR. ADNc a partir de células sem FU97 Como

2O

3 tratamento foi usada para construir uma curva padrão para cada gene.

Análise Western Blot

As pelotas de células foram homogeneizadas em extracção tampão (50 mmol /L de Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% de SDS, 150 mol /L de NaCl, 100 mg /fluoreto L de fenilmetilsulfonilo, 1 mg /L de aprotinina, 1% de NP-40 e 0,5% de ortovanadato de sódio), incubou-se a 4 ° C durante 30 minutos, e centrifugou-se durante 20 min a 12 000 g /min. A proteína total no lisado celular foi medida com a utilização do kit colorimétrico da Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para a análise de Western Blot, proteína total foi separado em 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, EUA), que foram incubadas durante 24 h a 4 ° C com os anticorpos para AFP (1 :500, R D), a STAT3 (1:1000), caspase 3 (1:500), Bcl-2 (1:500), BAX (1:500) e GAPDH (1:1000; toda a tecnologia de sinalização celular) , em seguida, a peroxidase de rábano conjugado com anti-murganho /coelho anticorpo IgG (Santa Cruz Biotechnology), após uma lavagem final. As reacções foram desenvolvidas com o uso de 4-cloro-1-naftol (Sigma) e H

2O

2. Os sinais foram detectados com o uso de um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido). nível GAPDH foi um padrão interno.

Immunoassay da AFP Concentração no sobrenadante

O sobrenadante de FU97 células foram recolhidos após o tratamento com Como

2O

3 ou negativa de controle para 24, 48 e 72 concentração h.AFP no sobrenadante foi determinada por ensaio de dois locais imunoenzimométrico num sistema TOSOH AIA (Japão). O valor de corte para a AFP foi de 10 ng /ml.

Os pacientes

Nós analisou dados de registros cirúrgicos e patológicos de 24 pacientes com AFPGC e 24 pacientes selecionados aleatoriamente com níveis normais de AFP no soro e combinados para AFPGC pacientes por estágio do câncer gástrico. Os pacientes foram submetidos a ressecção cirúrgica no Hospital de Clínicas da Universidade de Shandong, China, de janeiro de 1996 a dezembro de 2011. Os pacientes AFPGC mostrou nível de AFP no soro elevada, mas há doenças hepáticas concomitantes. presença histopatológica da AFP positividade foi confirmada por imuno-histoquímica. Entramos em contato com cada paciente para confirmar a sobrevivência ou a data da morte.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica uso envolvido de biotina-estreptavidina-peroxidase com um kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, CA, EUA). Resumidamente, secções de tecido (4 mm) foram preparadas a partir de amostras de tecido embebidas em parafina. Os cortes foram desparafinados com xileno seguida de desidratação em álcool graduado. Os cortes foram aquecidos num forno de microondas durante 2 minutos a 900 W para recuperar o antigénio e, em seguida incubada com 0,3% H

2 solução

2O em metanol durante 30 minutos para bloquear a peroxidase endógena. Após 3 lavagens com solução salina phosphatebuffered (PBS), as lâminas foram incubadas com soro de cavalo normal a 10% para bloquear a coloração de fundo não específica, em seguida, incubadas com anticorpos primários de coelho anti-AFP (1:100 diluição) e anti-STAT3 (1:200) em numa câmara húmida a 4 ° C durante a noite. Após uma lavagem com PBS, as secções foram incubadas com anticorpos anti-rato de cavalo biotinilado-durante 30 min, lavadas 3 vezes com PBS, e incubadas com estreptavidina-peroxidase conjugada durante 30 min. As secções foram visualizadas por incubação com 3, solução de 3′-diaminobenzidina (0,3% H

2O

2 e 0,05% de 3, 3′-diaminobenzidina) e contrastadas com hematoxilina. A omissão do anticorpo primário foi um controlo negativo. Cada corrida incluiu um controlo positivo e um controlo negativo. Para o controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído com PBS.

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± DP e foram analisados ​​por utilização do programa SPSS V11.5 (SPSS Inc., Chicago , IL, EUA). A associação das variáveis ​​clínico-patológicas e AFP e expressão STAT3 foi determinada pelo teste do qui-quadrado, e correcção de Yate foi aplicado em um pequeno número de amostras. O teste do qui-quadrado ou bicaudal

t

teste de Student foi utilizado para avaliar diferenças entre os grupos. Análise de sobrevivência envolveu o teste de log-rank, com curvas de Kaplan-Meier. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A inibição do crescimento e apoptose Indução em FU97 Cells pela Como

2O

3

FU97 células foram tratadas com. diferentes concentrações de a

2O

3 (1, 5 e 10 pmol /L) a 24, 48 e 72 h. Como

2O

3 inibiu a proliferação de FU97 concentração e tempo células dependente (Fig. 1A). Em células tratadas com 5 pmol /L e 10 nmol /L como

2O

3, durante 72 h, a inibição do crescimento foi 56,27 ± 3,91% e 73,46 ± 4,64%, respectivamente. fragmentação de ADN é uma característica do processo apoptótico. escadas de fragmentação do DNA típica foram detectados em FU97 células tratadas com 5 pmol /L e 10 nmol /L como

2O

3 (Fig. 1B). Aqui, estudar mais a mudança morfológica de celular por apoptose. FU97 células tratadas com 5 mmol /L e 10 nmol /L Como

2O

3 durante 72 h foram coradas usando Hoechst 33258, e observados em resultados microscope.The fluorescentes mostrou que Como

2O

3 induzida FU97 células de apoptose de um modo dependente da concentração, tal como indicado por núcleos fragmentados e condensados ​​(fig. 1C). Para elucidar a ainda mais a influência de Como

2O

3 na apoptose celular, caspase3 foi medida por resultados blot.The ocidentais de Fig. 1D claramente demonstrado que caspase 3 expressão da proteína aumentou significativamente em FU97 cells.Therefore, como

2O inibição do crescimento celular

3 pode inibir o crescimento celular e induzir a apoptose de células AFPGC FU97.

(A), medido por ensaio MTT. Os dados são média ± SD de 3 ensaios independentes. (B) análise em gel de agarose de fragmentação do DNA em FU97 células tratadas com As2O3 durante 72 h. (C) apoptótica núcleos corados com Hoechst 33258, apresentam fluorescência intensa que corresponde a condensação da cromatina e a fragmentação. (D) A análise de transferência de Western de proteína caspase3 no total de células extractos de FU97 células tratadas com a concentração indicada de As2O3 durante 72 h. expressão GAPDH serviu como controle de carga.

Efeito Inibidor de Como

2O

3 sobre a expressão de AFP e STAT3 em FU97 Cells

Para elucidar o papel da AFP e STAT3 no Como

2O

3 inibição induzida de proliferação e apoptose, o efeito de a

2O

3 em AFP e STAT3 expressão foi examinada utilizando quantitativa PCR em tempo real e western blot. As células foram tratadas com 1, 5 e 10 pmol /L como

2O

3 para 72 h.The ARNm e a expressão da proteína de AFP e STAT3 e fosforilação da STAT3 foram significativamente regulada negativamente com A

2O

3 tratamento de uma forma dependente da concentração (Fig. 2, Fig. 7).

As células foram expostas a As2O3 a 5 mmol /L durante 72 h. (A) RT-PCR quantitativa da expressão de ARNm. (B) Análise de transferência de Western e a quantificação da expressão da proteína. Os dados são representativos de 3 expericias independentes com resultados semelhantes. * P . 0,05 em comparação com 0 umol /L

AFP concentração associada com a inibição do crescimento e apoptose celular no sobrenadante da cultura FU97

Para confirmar ainda mais o efeito inibidor de A

2O

3 em AFP, medimos o nível de proteína AFP no sobrenadante de FU97 células. Como

2O

3 poderia diminuir AFP nível de concentração de proteína dependente (Fig. 3, Fig. 7). Este resultado concorda com a taxa de crescimento celular de inibição (Fig. 1A), a apoptose de FU97 células (Fig. 1B, C, D), e redução da expressão de ARNm de AFP e STAT3 (Fig. 2A) e a expressão da proteína de AFP, STAT3 e pSTAT3 (Fig. 2B).

As

2O

3 diminuíram AFP concentração nível de proteína dependente. Os dados são representativos de 3 expericias independentes com resultados semelhantes. * P . 0,05 em comparação com 0 mmol /L

Redução dos níveis de STAT3 Genes segmentação, Bcl-2 e Bax, com Como

2O

3 Tratamento em FU97 Cells

Para explorar a expressão de genes de segmentação da STAT3, nós examinamos a expressão de anti-apoptótica de Bcl-2 e Bax pró-apoptótico em células tratadas com FU97 Como

2O

3. A expressão de ARNm e proteína de Bcl-2 foi regulada negativamente em A

2O

3 células tratadas (Fig. 4), mas que de Bax foi regulada positivamente, o que sugere que o efeito de A

2O

3 na apoptose celular foi mediada pela inibição da STAT3 constitutivamente activada (Fig. 7).

(a) RT-PCR quantitativo e (B) análise de western blot e quantificação de células tratadas com a

2O

3 a 5 mmol /L durante 72 h. A expressão de ARNm e proteína de Bcl-2 foi regulada negativamente em sub como o

2O

3 células tratadas, mas que de Bax foi regulada positivamente. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. *

p

. 0,05 comparado com o controle

características clínicas dos selecionados População

Houve 34 do sexo masculino (70,8%) e 14 do sexo feminino (29,2% ) pacientes, com idade média de 66 anos (variação, 45-83 anos). As características clinicopatológicas dos pacientes foram resumidos na Tabela 2. Houve 48 pacientes tinham dados completos de acompanhamento, eo período de acompanhamento foi de 3 meses a 60 meses, com um período médio de 33,7 meses. O tempo de sobrevida global foi definida como os meses a partir da data da cirurgia até a data da morte ou perda de seguimento.

Expressão imuno-histoquímica de STAT3

Uma vez que não dispõem de informações sobre a expressão de STAT3 em AFPGC, determinou-se a sua expressão através de coloração imuno-histoquímica de tecido do paciente AFPGC. Em 24 tumores primários AFPGC, 11 foram positivas (46%) e 13 foram negativos (54%) para a expressão da STAT3. Nas amostras de 24 AFP-negativos cancro gástrico, 8 (33%) tumores primários foram positivas e 16 (67%) eram negativas para a expressão da STAT3. Além disso, apesar de o número relativamente reduzido de doentes com dados completos, STAT3 sobre-expressão foi significativamente associado com a profundidade de invasão e metástase de nódulo linfático (P 0,05). Nos grupos AFP-positivos e negativos (Fig 5, Tabela 2, Fig . 7).

(a) imunocoloração para a AFP. (B) imunocoloração STAT3 forte com depósitos granulares marrom no citoplasma e núcleo. (C) coloração imuno-histoquímica de controlo negativo para a AFP. (D) coloração imuno-histoquímica controlo negativo para STAT3.

A expressão de AFP e STAT3 associada com mau prognóstico do câncer gástrico

O tempo médio de sobrevivência de pacientes positivas AFP foi de 23 meses ( intervalo de confiança de 95%, 16-30 meses). que foi significativamente menor do que nos pacientes AFP-negativos, 53 meses (intervalo de confiança de 95%, 47-59 meses) (P 0,05) .O tempo médio de sobrevivência no grupo STAT3-positivo foi de 38 meses (intervalo de confiança de 95% , 29-47 meses), o que foi significativamente menor do que no grupo de STAT3-negativa, 54 meses (intervalo de confiança de 95%, 47-61 meses) (p . 0,05, Fig 6A e B, figura 7) .Furthermore. , sobrevivência foi inferior nos doentes de AFP e STAT3 duplo-positivos do que com a expressão de AFP ou STAT3 sozinho (P 0,05, Figura 6C e D, Fig. 7.). Em pacientes com AFP e STAT3 expressão double-positivo o tempo médio de sobrevivência foi de 22 meses (95% intervalo de confiança de 11-33 meses). Em comparação, em pacientes com expressão única da AFP ou STAT3, o tempo médio de sobrevivência foi de 54 meses (95% intervalo de confiança de 44-64 meses) e 59 meses (95% intervalo de confiança de 47-71 meses).

(A) AFP positividade sozinho. positividade (B) STAT3 sozinho. (C) a AFP e STAT3 dupla positividade comparação com AFP positividade. (D) a AFP e STAT3 dupla positividade em comparação com positividade STAT3 (todos P 0,05)

A inativação do gene ATBF1 em AFPGC, através de mutação ou expressão reduzida, pode permitir que as células AFPGC para produzir a proteína AFP. e sobre-expressar STAT3, que contribui para o comportamento agressivo e mau prognóstico de AFPGC. As2O3 pode inibir o crescimento celular AFPGC e induzir a apoptose celular. Os mecanismos subjacentes pode envolver a regulação negativa da expressão de AFP e STAT3 e STAT3 regular negativamente a expressão de anti-apoptótica de Bcl-2 e que a regulação positiva do supressor de tumor de Bax. Além disso, a AFP pode dimerizar com outras proteínas tais como os receptores nucleares, factores de transcrição e as caspases, todas as quais podem promover o crescimento de células tumorais. AFP podem dimerizar com o factor de transcrição STAT3 para promover o crescimento AFPGC. Portanto, AFP podem interagir com STAT3 na via de sinal para a eficiência quimioterápico de agentes em AFPGC.

Discussão

AFPGC tem sido difícil de tratar, principalmente, por causa da propensão para metástase e resistência a terapias convencionais. Terapias alternativas sejam especificamente estas questões são urgentemente necessários. Como

2O

3 foi utilizado em ensaios clínicos de APL durante anos, e 10 mg /dia como

2O

3 foi eficaz em induzir a remissão completa em pacientes com diagnóstico recente e recidivante APL [ ,,,0],33]. Como

2O

3 a proliferação celular inibida e a apoptose induzida da linha celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 [34], o qual foi ainda apoiada por um estudo clínico que mostra como o

2O

3 para ser eficaz e segura para pacientes com carcinoma primário avançado do fígado [35], a toxicidade era ligeira nível de AFP e o soro foi diminuída. Portanto, nós investigamos se como

2O

3 também induziu a inibição do crescimento celular e apoptose de adenocarcinoma hepatóides de estômago células AFPGC FU97 e encontrou as propriedades antitumorais de Como

2O

3 em células AFPGC.

Os dados mostram que a

2O

3 tem um efeito anti-proliferativo forte em FU97 células de uma forma dependente da concentração e do tempo. O nível plasmático de arsénio no manejo clínico de leucemia promielocítica aguda pode atingir 5,5-7,3 mM [36]. Em nosso estudo, todos os resultados mostraram que 5 mmol /L Como

2O

3 eficiente inibiu a proliferação e apoptose celular induzida às 72 horas. Esta dosagem é clinicamente relevante, o que sugere que as células AFPGC são sensíveis à medida

2O

3.

AFPGC, representado pela produção de AFP, exibe maior atividade proliferativa, a apoptose mais fraco, e mais rico neovascularização de cancros gástricos AFP-negativos. Por outro lado, altos níveis de AFP em hepatocarcinoma ou totalmente desenvolvida no soro do hospedeiro estão associados a um comportamento mais agressivo, e aumentou anaplasia [37], [38]. Estudos da AFP knockdown por siRNA encontrada proliferação celular inibida em hepatomas [39]. Portanto, a AFP pode funcionar em um passo fundamental na progressão do cancro da AFP-positiva. Regulação negativa da expressão AFP pode representar uma estratégia terapêutica relevante. Descobrimos que Como

2O

3 poderia regular negativamente mRNA AFP e expressão da proteína. Além disso, a regulação negativa da AFP por Como

2O

3 poderia inibir a proliferação celular e induz a apoptose de células em células AFPGC FU97. Além disso, a secreção de AFP em como o

sub células

3-tratados foi 2O dose e dependente do tempo diminuiu no sobrenadante. Regulação negativa da expressão da AFP pode contribuir para a inibição

2O

3-induzida do crescimento celular e apoptose. Assim, estes dados indicam que a expressão é regulada negativamente AFP em resposta a A

2O

3 tratamento. AFP pode desempenhar um papel importante na proliferação e apoptose de AFPGC.

Para além de ser um ponto de convergência de numerosas vias de sinalização oncogénicos, STAT3 também participa no crescimento e sobrevivência celular. Em células de leucemia, A

2O

3 activa numerosas vias de transdução de sinal intracelular, resultando na indução de apoptose [40]. Como

2O

3 inibição da STAT3, antes da inibição da proliferação celular, foi descrita em células de mieloma múltiplo [41]. Além disso, como

2O

3 inibe a quinase de tirosina de proteína, assim indirectamente a activação de proteínas STAT diminuindo [42] .Portanto, regulação negativa da STAT3 foi considerada um dos mecanismos de acção de A

2O

3 em leucemia promielocítica aguda (APL) .que encontramos STAT3 ativados nas células AFPGC e Como

2O

3 poderia regular negativamente a expressão do mRNA STAT3 e expressão da proteína STAT3 e pSTAT3. Especialmente, expressão subregulado da STAT3 e pSTAT3 foi consistente com a expressão subregulado da AFP por Como

2O

3. STAT3 pode ser inibida por algum fator durante a sua ativação em resposta a Como

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3. em AFPGC. Independentemente dos possíveis mecanismos envolvidos na regulação da STAT3, a alta expressão de AFP no AFPGC pode ter implicações importantes. Estudos anteriores também demonstraram que a AFP pode dimerizar com outras proteínas, tais como os receptores nucleares (isto é, receptores retinóico), factores de transcrição e as caspases, todas as quais podem promover o crescimento de células de tumor [43], [44]. Este, por sua vez, levou à especulação de que a AFP pode dimerizar com factores de transcrição STAT3 para promover o crescimento AFPGC. São necessários mais investigações sobre a regulação da expressão STAT3 relacionada à AFP.

STAT3 pode induzir a apoptose celular por downregulating transcricionalmente Bcl-2 expressão [45]. Bcl-2 é uma molécula efectora a montante na via apoptótica e um supressor potente da apoptose. Ele pode oligomerizar Bax, que despolariza subsequentemente o potencial de membrana mitocondrial para a libertação de citocromo c e induzir a apoptose [46]. A proporção de Bcl-2 para o Bax é importante para determinar se as células vão sofrer apoptose ou sobrevivência. Encontramos redução da expressão de Bcl-2, juntamente com a expressão STAT3 inibido com Como

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3 tratamento em células AFPGC. Em contraste, a expressão do Bax foi aumentada. Juntamente com os resultados de outros sistemas celulares, onde o nível de STAT3 inibido foi encontrada para diminuir a Bcl-2 de expressão e induzir a apoptose [45] efeitos,

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3-induzidas a Como descobrimos pode ser mediado pela inibição da constitutivamente activada STAT3.

Para demonstrar ainda mais se a STAT3 desempenha um papel fundamental na AFPGC, examinámos pacientes AFPGC em termos de expressão de STAT3. STAT3 positividade nos tumores AFP-positivos foi de 46% e em tumores AFP negativo de 33%. Pacientes com AFPGC tinha uma taxa mais elevada de expressão de STAT3, embora não significativo, talvez devido a um pequeno número de pacientes. No entanto, a expressão STAT3-positivo foi associada com tecido de câncer, profundidade de invasão e metástase ganglionar em AFPGC. Clinicamente, os pacientes com AFPGC têm mau prognóstico [1], [9], [10]. Nós confirmamos que o prognóstico era pior para os pacientes com do que sem AFP que foram pareados por estágio do câncer. Além disso, a sobrevida de pacientes com ambas AFP e positividade STAT3 foi significativamente pior do que aqueles apenas com AFP ou STAT3 positividade. Assim, neste tipo específico de cancro gástrico, STAT3 parece ter um papel importante na sobrevivência e proliferação celular. expressão STAT3 em AFPGC pode explicar a agressividade com que AFPGC, e expressão STAT3 pode ser um indicador de progressão útil, se validado por extensos estudos prospectivos em coortes maiores. Regulação negativa da expressão de AFP e STAT3 pode representar uma estratégia terapêutica relevante no AFPGC. No que respeita à relação entre a produção e a expressão da AFP STAT3, não há nenhum relatório disponível descrevendo os mecanismos subjacentes a date.It tem sido relatado que a expressão da AFP no cancro gástrico é devido à ausência do factor de transcrição ATBF1 [47]. Além disso, ATBF1, como um gene supressor de tumor, enhancesthe supressão de sinalização STAT3 por interacção com PIAS3 [48] .Portanto, é razoável considerar que a inactivação do gene ATBF1 em AFPGC, através de mutação ou expressão reduzida, pode ser permitir AFPGC células para produzir a proteína AFP e overexpres STAT3. Para esclarecer quais os fatores que estão envolvidos em AFP produção e STAT3 expressão, é necessário um estudo mais aprofundado.

Em conclusão, como

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3 pode inibir a linha de células AFPGC FU97 crescimento e induzir a apoptose. Os possíveis mecanismos foram relacionadas com a regulação negativa da AFP e STAT3 e STAT3 direccionamento de genes anti-apoptóticos Bcl-2 e regulação positiva do gene supressor de tumor Bax (Fig. 7). A expressão da STAT3 em AFPGC desempenha um importante papel na invasão tumoral e prognóstico. Como

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3 pode ser uma possível nova droga adjuvante no tratamento de AFPGC. O presente estudo fornece alguma base teórica para o seu uso clínico digno de um estudo mais aprofundado.