Abstract

Crescimento Epidérmico receptor do factor de tirosina quinase (EGFR TK) inibidores são úteis no tratamento de diferentes cancros humanos avançados; no entanto, sua eficácia clínica varia. Este estudo detectou

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mutações para prever a eficácia de EGFR-TK tratamento com cetuximab inibidor em pacientes chineses com câncer colorretal metastático (mCRC). Um total de 87 pacientes com câncer colorretal metastático foram tratados com cetuximab para 2-16 meses, em combinação com quimioterapia, entre agosto de 2008 e julho de 2012, e as amostras de tecido foram usados ​​para detectar

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mutações. Os dados mostraram que

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mutação ocorreram em 27/87 (31%). As taxas de resposta e controle da doença taxa de objectivo em

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tipo selvagem e mutantes pacientes foram de 42% (25/60) versus 11% (3/27) (p 0,05) e 60% (36 /60) contra 26% (27/07) (p 0,05), respectivamente. Pacientes com o tipo selvagem

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tinham significativamente maior mediana de tempo de sobrevida e sobrevida livre de progressão, do que pacientes com mutado

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(21 meses versus 17 meses, p = 0,017 , 10 meses versus 6 meses, p = 0,6). Estes resultados sugerem que uma alta frequência de

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mutações ocorre em pacientes com CCRm chineses e que

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mutação é necessária para selecionar pacientes para a elegibilidade para a terapêutica com cetuximab. São necessários mais estudos prospectivos usando um grande tamanho da amostra para confirmar estes resultados preliminares

Citation:. Li Z, Liu XW, Chi ZC, Sun BS, Cheng Y, Cheng LW (2015) Detecção de

K Ras

Mutações no Prevendo Eficácia do Fator de Crescimento epidérmico Receptor de tirosina-quinase (EGFR-TK) Inhibitor em pacientes com câncer colorretal metastático. PLoS ONE 10 (5): e0101019. doi: 10.1371 /journal.pone.0101019

Editor do Academic: Laszlo Buday, da Academia de Ciências da Hungria, HUNGRIA

Recebido: 27 de setembro de 2013; Aceito: 02 de junho de 2014; Publicado em: 07 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em todo o mundo e é um dos problemas de saúde mais significativos na China [1]. Embora a incidência de CRC costumava ser menor na China do que nos países ocidentais, tem aumentado rapidamente nos últimos anos [2]. A cirurgia é a melhor opção de tratamento para CRC, como a maioria dos outros tipos de câncer, mas metastático CRC precisa de terapia de combinação, como a cirurgia mais quimioterapia ou terapia-alvo. Durante as últimas décadas, 5-fluorouracilo (5-FU) regimes produziram médio de sobrevivência de cerca de 12 meses para CRC avançada, enquanto que o folinato de cálcio (CF), mais 5-FU prolonga a sobrevivência mediana de 14 meses [3]. Além disso, oxaliplatina e irinotecano aumentaram a sobrevivência global mediana de pacientes com mais de 20 meses [4]. Mais recentemente, o alvo da terapia, incluindo o anti-factor de crescimento epidérmico tirosina-cinase do receptor (EGFR-TK) foi mostrado para melhorar a sobrevivência global dos doentes com KRAS tipo selvagem (V-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rato homólogo do oncogene viral) metastático CRC [ ,,,0],5]. No entanto, a terapia anti-EGFR-TK utilizando gefitinib, erlotinib ou cetuximab produz resultados diferentes em diferentes cancros humanos. O motivo pode ser porque anti-EGFR-terapia em pacientes com mutantes

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não só pode ser ineficaz, mas também prejudicial [5]. cetuximab Assim, 2011 diretrizes da National Comprehensive Cancer Network (NCCN) têm recomendado como terapia de primeira linha para pacientes com o tipo selvagem

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desde EGFR e

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mutações são exclusivos [6].

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gene codifica uma proteína de 21 kDa, que é uma proteína de ligação GTP /GDP com actividade de GTPase e está envolvido na transdução de sinais mitogénicos para ligar o receptor activação da tirosina-quinase para efectores a jusante. Depois de o PIB se liga à proteína p21 ras, que vai converter em uma forma inactiva, a perder a sua função de transdução de sinal. As mutações do gene ras geralmente causam activação constitutiva de RAS GTPase, levando à activação das vias de sinalização a jusante e que resulta na transformação celular e a tumorigénese [7-9]. Em CRC, mais de 90% de

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mutações ocorrem em

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exão 1 codão 12 e o codão 13 [7,8].

é Cetuximab a /anticorpo monoclonal quimérico rato humana contra EGFR-TK e o desenvolvimento e uso de cetuximab têm melhorado a sobrevida de pacientes com CCRm. Dados anteriores indicaram que o efeito do cetuximab foi fortemente associado com o

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mutações, então os EUA Food and Drug Administration recomenda que os pacientes devem ser submetidos a

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análise de mutação antes de receber tratamento com cetuximab . No entanto, nem todos os pacientes com o tipo selvagem

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irão beneficiar de tratamento com cetuximab, como não houve associação entre a expressão de EGFR e eficácia cetuximab. A taxa de resposta global dos pacientes com o tipo selvagem

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ao cetuximab é de apenas 40-60%, mas a taxa de resposta dos pacientes com

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mutações foi de apenas 10% ou menos [10,11], assim, neste estudo, detectamos

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mutações para prever a eficácia do cetuximab inibidor EGFR-TK em pacientes chineses com câncer colorretal metastático.

Materiais e Métodos

Os pacientes

neste estudo, foram recrutados um total de 87 pacientes com diagnóstico histológico de mCRC em Jilin Hospital Provincial Cancer entre janeiro de 2008 e agosto de 2010, que foram tratados com cetuximab semanal (400 mg /m

2 como uma dose inicial de carga, e 250 mg /m

2 dose subsequente) em combinação com a quimioterapia (dose padrão). Especificamente, 55 pacientes receberam cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina e um adicional de 32 pacientes receberam cetuximab mais quimioterapia à base de irinotecano para 2-16 meses. Cetuximab foi administrado como tratamento de primeira linha em todos os 87 pacientes semanais até progressão da doença ou no final deste estudo. O Hospital do Câncer de conselho de revisão Província de Jilin aprovou este estudo e consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os assuntos. No entanto, os pacientes foram excluídos do estudo se eles não tinham recebido quimioterapia pós-operatória, ou se eles eram 25 ou 80 anos de idade.

Avaliação da resposta ao tratamento e sobrevida dos pacientes

A resposta ao tratamento foi avaliado a cada dois meses por tomografia computadorizada (TC) do local da metástase (do fígado e pulmão) de acordo os critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST) [12]. Os pacientes foram classificados como uma resposta completa (CR), resposta parcial (PR), a doença estável (SD), ou doença progressiva (DP). A taxa de resposta objectiva foi definido como (CR + PR) /Total, enquanto a taxa de controlo da doença foi definida como (CR + PR + SD) /Total. A sobrevivência global foi definida como o tempo desde o diagnóstico histopatológico para morte devido a qualquer causa. A doença estável indiciado que, após tratamento, a doença seria persistir durante pelo menos quatro semanas sem mudança significativa na lesão tumoral. O último acompanhamento desses pacientes foi em julho de 2012. No entanto, todos os indivíduos incluídos no estudo tinham doença em estágio IV e se a doença progrediu, o tratamento com cetuximab seria interrompido. Assim, o estudo apresenta dados sobrevida livre de progressão

extração de DNA e detecção de mutações K-ras

Os blocos de parafina de tecidos tumorais foram reavaliados utilizando H . E-coradas secções de tecido para assegurar que o número total de células de tumor foi semelhante para amostras diferentes. secções de tecido seleccionada a partir de pacientes de CRC que contêm uma elevada proporção de células de tumor (tipicamente ≥ 60%) foram identificados por três patologistas experientes. Depois disso, o ADN genómico foi depois extraído a partir de três secções de 10 um de espessura de cada amostra de tumor de acordo com protocolos anteriormente descritos [13]. Resumidamente, as secções de tecido foram desparafinados em xileno, lavado em etanol absoluto, e incubou-se à temperatura ambiente com 150 uL de tampão de digestão (1 mg /ml de proteinase K; M de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,5; mM de ácido etilenodiaminotetra-acético a 1; 0,5% de Tween 20, 2% de sulfato de dodecilo de sódio) durante 24 h. No dia seguinte, as reacções foram centrifugadas a 15 000 g durante 15 minutos e o DNA foi extraído usando um kit de ADN de tecido FFPE QIAamp (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Depois disso, a concentração de ADN foi espectrofotometricamente avaliada utilizando um comprimento de onda de 280/260 nm e ajustada a uma concentração final de 100 ug /ml e armazenada a -20 ° C até à sua utilização.

Para detectar

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mutações, em cadeia da polimerase polimorfismo de conformação em hélice reação-única (PCR-SSCP) foi realizada utilizando primers e um kit de PCR (Takara Biotecnologia (Dalian) Co. Ltd, Dalian, China). Resumidamente, uma mistura de PCR de 50 uL foi preparado para cada amostra, o qual continha 2 mL de ADN genómico, 1 ul de 10 mmol /l de cada iniciador e 25 de pré-mistura ul (1,5 U Takara polimerase Taq, 10x tampão de PCR, 3,0 mmol /L Mg2 +, 0,4 mmol /l deoxynucleotidetriphosphate). Os iniciadores para detectar

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mutações nos codões 12 e 13 foram 5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3 ‘e 5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3’, tal como descrito anteriormente [14]. A PCR foi realizada em um sistema 7900HT rápido PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 30 seg, uma última extensão de 72 ° C durante 5 min, e em seguida armazenado a 4 ° C indefinidamente. Depois disso, os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 1,5% e purificado utilizando um kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, Venlo, Países Baixos) e enviadas para análise de sequenciação de ADN do

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mutações no Shanghai Generay Biotech Co. Ltd. (Xangai, China).

a análise estatística

a associação entre a

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mutações ea resposta ao tratamento com cetuximab foi analisada por meio de Fisher teste exato. As curvas de Kaplan-Meier eo teste Log-rank foram utilizados para analisar a associação entre o

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mutações ea sobrevida global (SG) e sobrevida livre de progressão (PFS) de pacientes. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizada para determinar os fatores relacionados à sobrevida global. A análise estatística foi realizada usando SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). P . 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

Neste estudo, nós tratamos um total de 87 pacientes com CCRm com cetuximab plus-base de oxaliplatina (55 pacientes) ou à base de irinotecano (32 pacientes) quimioterapia durante 2 a 16 meses. Os tecidos tumorais foram sujeitas a detecção de

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mutações. Encontramos 27 pacientes com mutado

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e os globais

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taxa de mutação foi de 31%. As características detalhadas dos pacientes são apresentados na Tabela 1.

Os pacientes com o tipo selvagem

tumor K-ras

melhor Orr e DCR do que a de pacientes com mutação

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tumor, ou seja, DCR, 60% vs. 26% (χ

2 = 23,582, p 0,05), Orr, 42% vs. 11% (χ

2 = 24,669, p 0,05, Tabela 2), indicando que a detecção de

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mutação pode prever a resposta dos pacientes ao cetuximab mais quimioterapia. Entre 32 casos de receber irinotecano, nove casos de

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mutação, enquanto entre os 55 casos que receberam oxaliplatina, 18 casos tiveram

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mutação; No entanto, não houve diferença significativa de

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mutação entre os pacientes que receberam o irinotecan e os submetidos a oxaliplatina (P 0,05, tabela 3). Além disso, os pacientes tratados com cetuximab e do irinotecano à base de quimioterapia teve melhor Orr e DCR do que os pacientes tratados com cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina, ou seja, DCR, 66% vs 40% (χ

2 = 13,569, p 0,05), Orr, 38% vs. 29% (χ2 = 1,818, p . 0,05, Tabela 3)

Além disso, verificou-se que o tempo médio de sobrevivência foi de 21 meses em pacientes com o tipo selvagem

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, enquanto que o tempo médio de sobrevivência foi de 17 meses em pacientes com mutação

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. Esta diferença foi estatisticamente significativa (χ

2 = 5,703, P = 0,017; Fig 1). A sobrevida livre de progressão foi de 10 meses em pacientes com o tipo selvagem

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, enquanto que a sobrevida livre de progressão foi de 6 meses em pacientes com mutação

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. Esta diferença não foi estatisticamente significativa.

Além disso, o tempo médio de sobrevivência foi de 22 meses em pacientes tratados com cetuximab mais quimioterapia à base de irinotecano, enquanto o tempo médio de sobrevivência foi de 18 meses em pacientes tratados com cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina Esta diferença também foi estatisticamente significativa (χ

2 = 3,957 p = 0,047; Fig 2). Depois de CT e nuclear ressonância magnética, os pacientes com CCRm recebeu cetuximab mais irinotecano ou cetuximab acrescido de oxaliplatin quimioterapia e quatro pacientes com CCRm foram mostrados na figura 3. Especificamente, no caso 1, o CR (completamente de resposta) paciente foi tratado com quatro ciclos de cetuximab quimioterapia mais à base de irinotecano. Caso 2 era um paciente que CR foi tratada com três ciclos de cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina. Caso 3 foi um PR (resposta parcial) paciente que recebeu quatro ciclos de cetuximab mais quimioterapia à base de irinotecano. Caso 4 também foi um paciente PR, que foi tratado com quatro ciclos de cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina. O foco do fígado desapareceram no Caso 1 e 2, eo foco foi grandemente diminuído no processo 3 e 4. A análise univariada mostrou que

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mutações e escolha do tratamento foram associados com pior prognóstico em pacientes de CRC (

p

= 0,017 e,

p

= 0,047, respectivamente), enquanto que a análise multivariada mostrou que,

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mutação, a escolha do tratamento e diferenciação tumoral pobres eram independentes fatores de sobrevivência de pacientes com mCRC (

p

= 0,004,

p = 0,006

e

p

= 0,015, respectivamente; Tabela 4).

esses pacientes foram tratados com

Caso 1 é um paciente CR, que foi tratado com quatro ciclos de cetuximab mais irinotecano à base de irinotecano à base de (n = 32) e (n = 55). baseada em oxaliplatina quimioterapia. Caso 2 é um paciente que CR foi tratada com três ciclos de cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina. Caso 3 é um paciente PR que recebeu quatro ciclos de cetuximab mais quimioterapia à base de irinotecano. Caso 4 também é um paciente PR, que foi tratado com quatro ciclos de cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina. CR, completamente resposta; PR, resposta parcial.

Discussão

No presente estudo, detectamos

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mutações em tecidos tumorais de prever a resposta dos chineses pacientes com câncer metastático colo-retal para cetuximab mais oxaliplatina ou a quimioterapia à base de irinotecano. Descobrimos que os pacientes com o tipo selvagem

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após estes tratamentos tiveram melhor Orr e DCR do que os pacientes com mutação

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(42% vs. 11% e 60% vs. 26%, respectivamente). Além disso, descobrimos que o tempo médio de sobrevivência de pacientes com o tipo selvagem

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foi de 21 meses em comparação com 17 meses em pacientes com mutantes

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(p = 0,017). Além disso, o tempo médio de sobrevivência de pacientes tratados com cetuximab e do irinotecano à base de quimioterapia foi de 22 meses em comparação com 18 meses em doentes tratados com cetuximab mais quimioterapia baseada em oxaliplatina (p = 0,047). Este estudo apoia a observação de que a detecção de

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mutação é um preditor útil para o tratamento anti-EGFR-TK em câncer colorretal metastático. Outras estudo deve investigar o mecanismo molecular subjacente responsável pela mutação

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na progressão do câncer colorretal avançado.

O câncer colorretal frequentemente metástase para o fígado, o que leva à dificuldade em controlá-la clinicamente . Em nosso estudo, houve 65 de 87 pacientes (74,7%) que tiveram a doença metastática no fígado, seguido por metástase para o pulmão, ovário e pele. Sem tratamento progressivo, pacientes com doença metastática tem um prognóstico muito pobre [15]; Assim, avanços no tratamento de câncer colorretal metastático vai salvar vidas e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Neste estudo, avaliamos

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mutações em 87 pacientes com CCRm para prever a resposta de pacientes com cetuximab mais oxaliplatina ou a quimioterapia à base de irinotecano. Encontramos 27 pacientes com mutação

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(31%), que foi consistente com os de pacientes ocidentais CRC [16] e pacientes com CCR chineses [17]. Estudos anteriores demonstraram que os pacientes com o tipo selvagem

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tiveram uma melhor resposta ao tratamento com cetuximab do que aqueles com mutação

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[10,11]. No estudo atual, nós também confirmar estes resultados [10,11,18]. Em nível molecular, outras quinases não-tirosina pode também ativar a via de sinalização EGFR que pode explicar por que

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mutação é útil, mas não é perfeito em predizer resistência ao cetuximab. Além disso, nós, ou outros, assim detectadas as mutações mais comuns em

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(isto é, o exão codão 12 e 13), mas outras

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também podem desempenhar um papel na resistência anti-EGFR-TK. Além disso, é necessário verificar se os subtipos ou local de câncer colorretal metastático desempenhar um papel na resposta à terapia anti-EGFR-TK, como cetuximab.

Além disso, o estudo combinado cetuximab atual com oxaliplatina ou quimioterapia, que também podem afectar a resposta dos pacientes à base de irinotecano. A diferença que mostramos neste estudo pode ser devido à interação medicamentosa entre cetuximab e irinotecano ou oxaliplatina; Assim, mais estudos são necessários para esclarecer esta questão. No entanto, Van Cutsem et ai. investigado resultado quimioterapia em K-

ras

pacientes com câncer colorretal metastático e mostraram que não houve diferença significativa na sobrevida livre de progressão e sobrevivência global entre os doentes que receberam cetuximab mais irinotecan, fluorouracil e leucovorina (FOLFIRI) ou FOLFIRI sozinho [19]. Portanto, é possível que um regime de quimioterapia diferentes pode levar a diferentes respostas em pacientes.

Activado proteína K-Ras interage com fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) para activar os seus efectores a jusante (tal como alvo da rapamicina em mamíferos ) para modular indirectamente a sobrevivência celular. Além disso, através da quinase Braf /mitogen-activated (MAPK), proteína activada K-ras também influencia a proliferação das células [20]. Até à data, uma série de terapias dirigidas contra a sinalização do EGFR foram estabelecidos e cetuximab é um anticorpo IgG1 monoclonal quimérico humano /murganho que se liga ao domínio extracelular do EGFR e inibe a sinalização mediada pelo EGFR [21]. Um estudo recente mostrou que o tratamento com cetuximab foi eficaz no tipo selvagem

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e pacientes EGFR chinesa CRC, que forneceram evidências sobre a eficácia de previsão de EGFR alvo estratégias terapêuticas [22,23].

no entanto, é preciso muito mais para a terapia cetuximab bem sucedida de pacientes avançados CRC na clínica. Poderíamos avaliar primeiro

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mutações para selecionar pacientes elegíveis para tratamento com cetuximab e depois investigar como mutado

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antagoniza eficácia cetuximab ou ignora a inibição EGFR-TK. Uma combinação de fármacos novos podem ser necessários para suprimir a actividade de proteínas K-ras mutado.