Sumário

Conseguir um tratamento eficaz do cancro é difícil, particularmente quando a resistência à quimioterapia convencional é desenvolvido. atividade (P-gp) P-glicoproteína governa resistência a múltiplas drogas desenvolvimento (MDR) em tipos de células cancerígenas diferentes. Identificação de agentes anti-câncer com potencial para matar células cancerosas e, ao mesmo tempo inibir a MDR é importante intensificar a procura de novas abordagens terapêuticas. Foram examinados os efeitos de sulfinosina (FS), uma purina nucleósido análogo bastante inexplorado, em MDR (P-gp sobre-expressar) o carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e linhas de células de glioblastoma (NCI-H460 /R e U87-TxR , respectivamente). SF mostraram a mesma eficácia contra linhas celulares de cancro MDR e os seus homólogos sensíveis. No entanto, era não-tóxico para os queratinócitos humanos normais (HaCaT). SF induzida morte celular por apoptose dependente de caspases e autofagia em células cancerosas MDR. Após a aplicação SF, espécies reactivas de oxigénio (ROS) foram gerados e glutationa (GSH) a concentração diminuiu. A expressão da enzima chave para a síntese de GSH, gama-glutamil-cisteína-sintetase (γGCS) foi diminuída assim como a expressão de

GST-π

ARNm. Consequentemente, SF diminuiu significativamente a expressão de

HIF-1α

,

MDR1

e

VEGF

mRNAs, mesmo em condições de hipóxia. SF causou a inibição da P-gp (codificado pelo

MDR1

) expressão e atividade. A acumulação de agente quimioterapêutico padrão – doxorrubicina (DOX) foi induzido por SF na forma da sua concentração e dependente do tempo. Obteve-se o melhor efeito de SF após 72 h, quando se atingiu o efeito de inibidores de P-gp conhecidos (Dex-verapamil e tariquidar). Por conseguinte, SF sensibilizados as células cancerosas resistentes a DOX no tratamento subsequente. Além disso, a diminuição da SF experssion de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em mRNA e o nível de proteína e modulado sua secreção. Em conclusão, os efeitos sobre a P-gp (implicado na farmacocinética e MDR), a GSH (implicado na desintoxicação) e VEGF (implicados em tumor angiogénese e a progressão) qualificar SF como agente anti-cancro de multi-potentes, que o uso deve ser considerado , em especial para doenças malignas resistentes

Citation:. Dačević M, Isaković a, Podolski-Renić a, Isaković AM, Stanković T, Milošević Z, et al. (2013) purina nucleosídeos Analog – sulfinosina modula mecanismos diversos de cancro da Progressão em multi-resistente linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (1): e54044. doi: 10.1371 /journal.pone.0054044

editor: Michihiko Kuwano, da Universidade Kyushu, Japão

Recebido: 26 de julho de 2012; Aceito: 05 de dezembro de 2012; Publicação: 11 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Dačević et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Ministério da educação, ciência e Desenvolvimento Tecnológico da Sérvia (números de subvenção III 41031 e III 41025) apoiou esta investigação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sulfinosina ou SF (Figura 1, [R, S] -2-amino-9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamida) é a forma oxidada da 6-thioguanosine [1]. É um agente anti-cancro bastante explorado em comparação com outros tiopurinas (6-tioguanina e 6-mercaptopurina). SF inibe o crescimento de células de cancro, pelo menos parcialmente, pela incorporação de um seu derivado fosforilado no ADN. A conversão metabólica da SF a correspondente derivado de 5′-monofosfato é mais complexa do que a de outros tiopurinas [2].

Desde SF utiliza diferentes vias metabólicas para a sua activação intracelular, o tratamento SF não induz resistência em células cancerosas. Em contraste, a eliminação de uma única enzima responsável pela activação metabólica de outros análogos de nucleósidos de purina é suficiente para o desenvolvimento de resistência. SF melhor penetra no sistema nervoso central (SNC) do que sua molécula parental – 6-thioguanosine e é mais eficaz no tratamento do câncer. SF é útil contra tumores resistentes a outros tiopurinas [3]. Apesar das limitações para seu uso, alguns análogos de purina estreitamente relacionadas com SF mostrou actividades anti-angiogénicos consideráveis ​​que merecem atenção científica [4].

O metabolismo do SF envolve o sistema glutationa das células. SF adutos prontamente a compostos sulfidrila (glutationa e cisteína) e suprimindo o sistema glutationa desintoxicação e elevando a concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS), SF pode induzir a morte de células cancerosas [2].

Em vista da sua eficácia considerável no tratamento do cancro e toxicidade moderada para as células normais [2], SF é apropriado para combinar com outros agentes quimioterapêuticos. SF actua sinergicamente com doxorubicina (DOX), curcumina (CUR) e verapamil (VER) em linhas de células não-pequenas do cancro do pulmão (NSCLC) [5] – [7]. A eficácia da aplicação combinada com SF permitida a utilização destes fármacos em concentrações mais baixas que são menos tóxicos e com menos efeitos adversos. Nossa hipótese é que todos os efeitos anti-câncer mencionados de SF poderia ser útil para a reversão da resistência a quimioterápicos.

resistência a múltiplas drogas (MDR) é a principal limitação para a realização do tratamento do câncer de sucesso. Fenótipo MDR frequentemente relaciona-se com a expressão excessiva de P-glicoproteína (P-gp), um transportador de membrana que faz a extrusão de forma eficaz os medicamentos citotóxicos de células cancerosas e muda a sua farmacocinética. P-gp actua como uma bomba de efluxo para vários fármacos anticancerígenos hidrofóbicos, tais como antraciclinas, alcalóides da vinca, epipodofilotoxinas, taxanos, e, em alguns dos novos medicamentos (por exemplo, imatinib, nilotinib, everolimus). P-gp a sobre-expressão é comum em modelos experimentais de cancro, bem como em tecidos cancerosos de pacientes [8]. Portanto, P-gp tornou-se o principal alvo terapêutico para a superação da MDR.

Entre as muitas opções para reverter MDR, os agentes com uma actividade anti-câncer do seu próprio poderia ser examinados como potenciais moduladores de MDR. Especulamos anteriormente que, além da sinergia entre SF e DOX como drogas anti-câncer que atuam através de vias distintas, as alterações da expressão de genes relacionados com MDR e redução de actividade P-gp pode contribuir para o efeito quimio-sensibilização dos SF [5], [6].

por isso, realizamos uma investigação mais aprofundada dos mecanismos envolvidos na ação SF em cânceres resistentes e incuráveis. Para o efeito, utilizou duas linhas diferentes de células de cancro MDR com a sobre-expressão de P-gp (NCI-H460 /R e U87-TxR) [9], [10]. Foi estudado o potencial de SF para matar as células cancerígenas resistentes e induzir autofagia, bem como para modular os mecanismos envolvidos na progressão do cancro, tais como a glutationa sistema (GSH) desintoxicação, o transporte da droga mediada por P-gp, factor de crescimento endotelial vascular expressão (VEGF) and.secretion. Encontrámos que a modificação do estado redox por SF levou a uma diminuição na expressão de hipoxia inducible factor-1α (HIF-1α), que regula a expressão de P-gp e VEGF. Assim, a modulação de MDR por SF é a consequência da supressão do sistema de desintoxicação GSH.

Materiais e Métodos

Drugs

SF ([R, S] -2-amino -9-β-D-ribofuranosylpurine 6-sulfinamida) foi sintetizado a partir de 6-thioguanosine de acordo com o procedimento publicado [1]. solução de DOX foi obtido a partir ebewe Arzneimittel GmbH, Viena, Áustria. R ± Verapamil (Dex-VER) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemanha. Tariquidar (TQ) foi gentilmente cedido pelo Dr. Sven Rottenberg de The Cancer Institute Holanda, Amsterdam. CoCl

2 foi obtida a partir de Fisher Scientific, EUA. SF foi mantida a -20 ° C. Antes do tratamento, SF e CoCl

2 foram recentemente diluído em água, enquanto as alíquotas de DOX foram descongeladas de -20 ° C. Dex-VER foi mantido como uma solução de estoque 1 mM à temperatura ambiente. TQ Diluiu-se em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e 10 uM alíquotas foram mantidas a -20 ° C.

Chemicals

RPMI 1640, Meio Essencial Mínimo (MEM), solução de penicilina-estreptomicina, antibiótico-antimicótico solução, L-glutamina e tripsina /EDTA foram adquiridos de PAA, Viena, Áustria. de soro bovino fetal (FBS), sulfo-rodamina B (SRB) e laranja de acridina foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemanha. Matrigel foi gentilmente cedido pelo Dr. Sanja Mijatovic do Institute for Biological Research “Sinisa Stankovic”, Universidade de Belgrado, Sérvia. iodeto de propídio (PI) foi adquirido a partir de Roche Applied Science, Basileia, Suíça e anexina-V-FITC (AV) de Abcam, Cambridge, Reino Unido. anticorpo conjugado com FITC anti-gp-P foi fornecida pela BD Biosciences, Reino Unido, enquanto que o anticorpo anti-VEGF PE-conjugado foi obtido a partir de R D Systems, Minneapolis, MN EUA. éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE), dihydroethidium (DHE) foi obtido a partir de Molecular Probes®, Invitrogen, CA, EUA. Os anticorpos primários contra caspase 3 e β-actina foram adquiridos da Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA, EUA, enquanto anticorpo primário contra gamma-glutamilcisteína sintetase (γGCS) foi um presente amável do Dr. Bato Korac, do Instituto de Pesquisa Biológica “Sinisa Stankovic “, Universidade de Belgrado, Sérvia. IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase foi obtido a partir de Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA.

Células e Cultura de Células

linhas celulares NCI-H460 e U87 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, Rockville, MD. As células NCI- H460 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 4,5 g de glucose /L, 10,000 U /mL de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina, 25 ng /ml de solução de anfotericina B a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. as células NCI-H460 /R foram originalmente seleccionada a partir de células NCI-H460 no nosso laboratório e cultivadas num meio contendo 100 nM de DOX como descrito anteriormente [9]. As células U87 foram cultivadas em MEM suplementado com 10% de FBS, L-glutamina (2 mM) e 5000 U /ml de penicilina, 5 mg /ml de solução de estreptomicina. as células U87-txr foram selecionados a partir de células U87 no nosso laboratório, após exposição contínua a stepwise concentrações crescentes de paclitaxel (100-300 nM) durante um período de 9 meses como já publicada [10]. linha de células HaCaT (queratinócitos humanos normais obtidos a partir CLS – Cell Lines Service, Eppelheim, Alemanha) foi generoso presente de Prof. Andra Jorg, Divisão de Biofísica, Research Center Borstel, Leibniz-Centro de Medicina e Biociências, Borstel, Alemanha. As células HaCaT foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%, 4 g /L de glucose, L-glutamina (2 mM) e 5000 U /ml de penicilina, 5 mg /ml de solução de estreptomicina. células cancerosas MDR foram sub-cultivadas a intervalos de 72 h, usando 0,25% de tripsina /EDTA e semeadas em meio fresco nas seguintes densidades: 8000 células /cm

2 para NCI-H460, 16.000 células /cm

2 para NCI-H460 /R e U87, 32.000 células /cm

2 para U87-TxR. células HaCaT foram sub-cultivadas em intervalos de 144 h, usando 0,25% de tripsina /EDTA e semeadas em meio fresco a 64, 000 células /cm

2.

Sulforodamina B Ensaio

Células cultivadas em 25 cm

2 frascos de tecido foram tratadas com tripsina, semeadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano e incubadas durante a noite. linhas celulares investigadas NCI-H460, NCI-H460 /R, U87, U87-TxR e células HaCaT foram semeadas a 4, 000, 8.000, 8.000 e 16.000 células /poço, respectivamente. tratamento SF (1-100 uM) durou 72 h. As proteínas celulares foram coradas com sulforrodamina B de ensaio (SRB), seguindo o protocolo modificado ligeiramente de Skehan et ai [11]. Resumidamente, as células em placas de 96 poços foram fixados em ácido tricloroacético a 50% (50 uL /​​poço) durante 1 h a 4 ° C, lavadas em água da torneira e coradas com 0,4% (w /v) de sulfo-rodamina B em 1% acético ácido (50 uL /​​poço) durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas três vezes em ácido acético a 1% para remover o corante não ligado. O corante ligado à proteína foi extraído com 200 mL base Tris 10 mM (pH 10,5) por poço. A densidade óptica foi lida a 540 nm, com correção a 670 nm (LKB 5060-006 Leitor de placas Micro, Viena, Áustria).

Crescimento Matrigel

Para tridimensional (3-D ) culturas, as células foram plaqueadas com as mesmas densidades como por dois (2-D) culturas em reconstituída (pr�gelificado) da membrana basal (Matrigel; BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) em meio RPMI 1640 com 10% de FBS. As células foram incubadas durante 72 h e fotografado vivo por microscopia de fase.

Determinação da proliferação celular (CFSE Coloração)

A taxa de proliferação celular foi medida por análise de citometria de fluxo de células marcadas com carboxif luoresceina éster de succinimidilo ou CFSE [12]. células Resumidamente, isolada (5 × 10

6 células /ml) foram coradas com CFSE 1 uM durante 10 min no escuro a 37 ° C, lavadas duas vezes em meio fresco, semeadas em placas de seis poços a 5 x 10

4 por poço, e depois expostos a SF. Após 72 h de cultivo, as células foram tripsinizadas e lavadas duas vezes em PBS. Finalmente, as células foram ressuspensas em PBS e analisadas por citometria de fluxo. emissão de fluorescência verde foi medida usando um FACSCalibur fluxo citómetro (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) e analisados ​​utilizando software Cell-Quest.

Cell Death Detection

Os percentuais de apoptose, necrótica e As células viáveis ​​foram determinados por anexina V-FITC (AV) e rotulagem iodeto de propídio (PI). NCI-H460 /R e células U87-txr foram plaqueadas e incubadas durante a noite em placas de 6 poços a uma densidade de 80.000 e 160.000 células /poço, respectivamente. Depois de 72 h de tratamento SF, as células fixadas e flutuantes foram recolhidos por centrifugação. O sedimento de células foi ressuspenso em 100 uL de tampão de ligação contendo 10 mM de HEPES /NaOH, 140 mM de NaCl, 5 mM de CaCl

2 (pH 7,4), suplementado com 0,2 ug e 1 ug AV PI. Após o período de incubação (30 min a 37 ° C no escuro), adicionou-se mais 400 ul de tampão de ligação e de coloração AV /PI foi analisada dentro de 1 h por citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência (FL1-H verde e vermelho FL2-H) foi medida em FACSClibur fluxo citómetro-(Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). Em cada amostra, 10.000 células foram registrados (fechado para excluir restos celulares), e as porcentagens de viabilidade (AV- PI-), no início de apoptose (AV + PI-), apoptose e necrótica (AV + PI +), e já está morto (AV- células PI +) foram analisados ​​por software de análise de dados CellQuest Pro.

Activação de Caspase

activação de caspases foi medida por citometria de fluxo após marcação das células com um pan conjugado com FITC célula-permeável inibidor de caspases (apostat; R D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante. O aumento na fluorescência verde (FL1-H) como uma medida da actividade da caspase em células individuais da população tratada foi determinada utilizando fluxo FACSCalibur-citómetro (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido).

Autophagy Avaliação

O aparecimento de vesículas ácidas autofágicos foi detectada por citometria de fluxo. Após tratamento as células SF foram tripsinizadas, lavadas e incubadas durante 15 min a 37 ° C com 1 uM de laranja de acridina. Acridina núcleos de células manchadas de laranja são verde fluorescente, enquanto lisossomos autofágicos são fluorescentes vermelho-alaranjado. O aumento em vermelho vs. verde (FL3 /FL1) taxa de fluorescência, refletindo a autofagia, foi determinada usando um FACSCalibur fluxo citómetro (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) e Cell Quest Software Pro.

Western Blot

células cultivadas em placas de Petri de 100 mm a densidades seguintes: 400.000 células por prato de NCI-H460 /R e 750.000 por placa para U87-TxR foram lisadas após o tratamento SF com tampão de lise (Tris-HCl 30 mM pH 8,9, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40) contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo e cocktail de inibidor de protease (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemanha). Após 30 min em gelo, as amostras foram centrifugadas a 14 000 g durante 15 min a 4 ° C, e os sobrenadantes foram recolhidos. Quantidades iguais de proteína de cada amostra foi separada por SDS-PAGE em geles de 6-15% e transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A seguir à incubação com anticorpos primários contra a caspase 3, β-actina e gama sintetase glutamylcstein (γGCS) e IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase como o anticorpo secundário, as bandas específicas de proteínas foram visualizadas usando reagente Amersham ECL (GE Healthcare Life Sciences, Reino Unido) . Os níveis de proteína de γGCS foram quantificadas por densitometria utilizando o software ImageJ e expressas em relação a p-actina.

DHE Coloração

medições de citometria de fluxo de dihydroethidium-(DHE) -fluorescence foram usadas para medir ROS concentração em células cancerosas MDR. As células aderentes foram lavadas com PBS e colhidas por tripsinização. As células foram incubadas em PBS com FBS a 10% e 10 uM de DHE, durante 45 minutos. DHE-fluorescência foi analisada por citometria de fluxo (excitação 488 nm, emissão 585 nm e, canal FL2-H). A intensidade média de fluorescência (MFI) foi calculada após correcção para a autofluorescência.

detecção colorimétrica de glutationa (GSH)

Células cultivadas em 25 cm

2 frascos de tecido foram tratadas com tripsina e contadas. O mesmo número de células (2,5 x 10

6) para cada amostra foi exposta a outro procedimento. Resumidamente, as células foram recolhidas por centrifugação a 700 x g durante 5 minutos a 4 ° C e o sobrenadante foi removido. Em seguida, o sedimento celular foi ressuspenso em PBS a 0,5 ml em gelo e centrifugadas a 700 x g durante mais 5 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi removido e as células foram lisadas em tampão 80 ul gelada glutationa (GSH Kit de Detecção Colorimétrico, Bio-Vision, CA) durante 10 minutos em gelo. Em seguida, foi adicionado 20 ul de 5% de ácido sulfossalicílico e as amostras foram centrifugadas a 8000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi transferido para um tubo fresco e usadas para o ensaio de GSH. Glutationa O tampão foi adicionada a cada (placa de 96 poços) assim a um volume de 160 ul e incubou-se 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, 20 ul de quer padrões ou amostras preparadas foi adicionado a cada poço e incubou-se durante mais 10 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, adicionou-se 20 ul de solução de substrato (GSH Kit de Detecção Colorimétrico, BioVision, CA) e a absorvância do produto gerado (ácido 2-nitro-5-tiobenzóico) foi lida a 405 nm (leitor de placas LKB 5060-006 Micro, Viena , Áustria). As concentrações de GSH foram determinados utilizando a curva de calibração padrão de GSH e relacionada com as concentrações de proteínas nos lisados ​​celulares. A detecção de GSH para cada amostra foi realizada, pelo menos, seis vezes.

Extração de RNA e RT-PCR

O ARN total foi extraído a partir de células /R e U87-txr NCI-H460 não tratadas e as células tratados com SF. O isolamento foi efectuado utilizando Trizol (Invitrogen Life Technologies, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN foi quantificado no espectrofotómetro e a qualidade foi determinada por electroforese em gel de agarose. A transcrição reversa (RT) reacções usando 25 ug de ARN totais foram realizadas com iniciadores oligo-dT utilizando M-MLV da transcriptase reversa (Gibco BRL, EUA) seguindo as instruções do fabricante. As reações de PCR foram realizadas com primers específicos para,

GST-π

,

VEGF

,

MDR1

e

HIF-1α

[13] – [16 ], β

-actina

[17] e

GAPDH

[18] foi usado como um controle interno e co-amplificados com genes de interesse em todos os experimentos de PCR.

as reações de PCR foram realizadas no Sistema GeneAmp® PCR 9700 (Applied Biosystems, CA, EUA) sob as seguintes condições para a

HIF-1α

,

MDR1

e

GST-π

: desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min, 24, 25 ou 28 ciclos (respectivamente) a 95 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s e a 4 ° C indefinidamente. Quando PCR foi realizada para determinar a expressão do

VEGF

gene, 35 ciclos foram aplicadas com a temperatura de recozimento de 62 ° C.

GAPDH

iniciadores foram utilizados na seguintes proporções: 01:04 às

MDR1

primers e 01:06 para o

HIF-1α

primers para atingir amplificação linear condições. O β

-actina

iniciadores foram utilizados na seguintes proporções: 01:02 às

primers GST-π Comprar e 01:05 para o

VEGF

primers para atingir As condições de amplificação lineares. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2% corado com brometo de etídio. Multi-Analyst /PC Software Análise de Imagem (Bio-Rad Gel Doc 1000, CA, EUA) foi utilizado para análise de densitometria.

DOX Acumulação Ensaio

acumulação de DOX foi analisada por citometria de fluxo utilizando a capacidade de DOX para emitir fluorescência. A intensidade da fluorescência era proporcional à acumulação de DOX. Estudos foram realizados após 24 h, 48 h e 72 h de tratamento SF. as células NCI-H460 /R e U87-txr foram cultivadas em 25 cm

2 frascos, tripsinizadas e re-suspensas em 10 tubos de centrífuga ml num meio contendo DOX-(20 uM). Em seguida, as células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 120 minutos. No final do período de acumulação, as células foram sedimentadas por centrifugação, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e colocados em PBS frio. As amostras foram mantidas em gelo no escuro até que a análise de fluxo FACScalibur-citómetro (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). A fluorescência de DOX foi avaliada no canal de fluorescência 2 (FL2-H) a 530 nm. Um mínimo de 10000 eventos foram ensaiados para cada uma das amostras. As diferenças na forma da curva foram quantificadas utilizando uma estatística não paramétrica Komogorov-Smirnov. Os valores de P foram calculados (disponível a pedido) em CellQuest Pro e executado em um computador Macintosh.

Análise de Fluxo-de citometria de P-gp e VEGF Expressão

citometria de fluxo foi utilizada para medir P -GP e níveis de expressão de VEGF em células cancerosas MDR. células tratadas não tratados e SF (2 × 10

5) foram recolhidas por tripsinização, lavadas em PBS arrefecido em gelo, e, em seguida, directamente imuno-coradas por FITC-conjugado anti-P GP anticorpo de acordo com o protocolo do fabricante (BD Biosciences, Reino Unido). Um IgG2bκ de controlo de isotipo (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi avaliada para cada amostra experimental para discriminar o nível de fundo de fluorescência de células negativas. Para análise de expressão de VEGF, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4%, 10 min à temperatura ambiente, lavadas e ressuspensas em saponina a 0,05% (w /v) de tampão e incubou-se com anticorpo anti-VEGF PE-conjugado de acordo com o protocolo dos fabricantes ( R D Systems, EUA). Um IgG2a de isotipo de controlo (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi avaliada para cada amostra experimental para discriminar o nível de fundo de fluorescência de células negativas. Intensidade média de fluorescência foi determinada para as células coradas positivamente. As amostras foram mantidas em gelo no escuro até que a análise de fluxo FACScalibur-citómetro (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). A fluorescência de FITC-conjugado anti-P-gp foi avaliada no canal de fluorescência 1 (FL1-H) a 530 nm, enquanto conjugado com PE anti-VEGF foi avaliada em fluorescência de canal 2 (FL2-H) a 585 nm. Um mínimo de 10000 eventos foram analisados ​​para cada amostra (o portão excluídos os detritos celulares e as células mortas) e os resultados obtidos foram analisados ​​usando celular quest Pro Software (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido).

Ensaio MTT

a actividade metabólica das células foi avaliada através do ensaio de MTT baseada na redução de 3- (4,5-dimetil-2-thizolyl) -2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT, Sigma, St Louis , MO) em corante formazano por mitocôndrias activas de células vivas. Os efeitos combinados de tratamento simultâneo e subsequente foram estudados em linhas celulares de cancro MDR. as células U87-txr preparados por tratamento simultâneo NCI-H460 /R e foram semeadas a 4, 000 e 8000 células /poço, respectivamente. tratamento SF (5 uM), em combinação com diferentes concentrações de DOX durou 72 h. Os tratamentos subsequentes foram realizados em células U87-txr NCI-H460 /R e inicialmente semeadas a densidades mais baixas (500 células /poço e 1000 células /cavidade, respectivamente). O pré-tratamento com 5 uM SF durou durante 72 h e foi seguido por tratamento adicional de 72 h com diferentes concentrações de DOX. Adicionou-se MTT a uma concentração final de 0,1 mg /ml em cada poço de uma microplaca de 96 poços e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 h. Em seguida, foi adicionado DMSO para dissolver o produto de formazano, o qual foi quantidade proporcional ao número de células vivas. A absorvância do corante dissolvidos foi medida a 540 nm utilizando um leitor de microplacas automático (LKB 5060-006 Micro Plate Reader, Viena, Áustria). A inibição do crescimento (I) foi determinada de acordo com o seguinte equitação:., em que A é a absorvância no

CI

50 valor foi definido como a concentração de cada droga que inibiu o crescimento celular em 50%. IC

50 foi calculada pela análise de regressão linear usando software Excel.

ELISA para detecção de VEGF humano

165 no celular Meio de Cultura

células MDR (NCI-H460 /R e U87-TxR), semeadas em placas de 6 poços, foram incubadas durante a noite e, em seguida, tratado com SF. O meio celular (sobrenadante) foi recolhido 24 h, 48 h e 72 h após o tratamento para determinação de VEGF segregada

165 proteína por kit de VEGF imunoensaio (VEGF Quantikine Human ELISA kit, R D Systems, Minneapolis, EUA). O procedimento foi cumprido de acordo com o manual do fabricante. Os resultados foram normalizados com base na mesma quantidade de células analisadas. Uma curva padrão foi gerada utilizando recombinante VEGF

165 fornecido com o kit. As concentrações de VEGF no sobrenadante da cultura livre de células foram examinados em triplicado em duas experiências independentes.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada pelo software Statistica 6.0. Os resultados foram testados quanto à normalidade. Se os valores obtidos não foram distribuídos normalmente, os grupos foram comparados pelo

t

do Estudante – teste. Para as variáveis ​​com distribuição normal, foi utilizada a análise de uma via de variância (ANOVA). Quando foi observada significância estatística, foi aplicado o teste (HSD) Tukey honesto diferença significativa. A significância estatística foi aceite se p 0,05 (*), p 0,01 (**), p . 0.001 (***)

Resultados e Discussão

SF inibe o crescimento de MDR As células cancerosas

Nós estabelecemos NSCLC e glioblastoma P-gp sobre-expressar linhas celulares (NCI-H460 /R e U87-TxR) com MDR fenótipo, a fim de investigar potenciais agentes anti-câncer [9], [10 ]. NCI-H460 /R e U87-TxR são linhas celulares de cancro de MDR que originaram de NCI-H460 (linha celular NSCLC) e U87 (linha celular de glioblastoma). As linhas celulares parentais foram considerados sensíveis uma vez que as células derivadas de pacientes que não tinha sido submetido a quimioterapia. No presente estudo, procurou-se elucidar a ação de sulfinosina (SF), um análogo de nucleosídeo purina sintética, nestas duas linhas celulares de cancro MDR. Nós escolhemos SF por causa de evidências de que as suas concentrações terapeuticamente eficazes não poderia induzir a resistência. SF também penetra de forma eficiente para CNS [2]. Além disso, recente estudo clínico demonstrou que a terapia de combinação incluindo 6-tioguanina (molécula intimamente relacionado com SF) é promissor para pacientes com glioma anaplásico de alto grau recorrente [19].

Os efeitos do SF sobre o crescimento de células de câncer 72 h após o tratamento foram avaliadas pelo ensaio de quimio-sensibilidade – sulforrodamina B (SRB). SF inibiu o crescimento das linhas celulares de cancro sensíveis e MDR de um modo dependente da dose (Figura 2A, C). Uma vez que a aplicação de agentes anti-cancro é limitada pela sua toxicidade contra células normais, testou-se o efeito de SF em células HaCaT (queratinócitos humanos normais). foram também avaliados por ensaio de SRB Os efeitos sobre o crescimento de HaCaT após o tratamento contínuo de 72 horas. SF não reduziram significativamente o número de células normais, mesmo com a concentração mais elevada (100 ^ M) (Figura 2C). Demonstrou-se que SF inibe o crescimento de sensível, assim como as células de glioblastoma e NSCLC resistentes em micro-molar gama de concentrações, e que a sua eficácia não foi afectada pela presença do fenótipo MDR. Além disso, SF era não-tóxico para as células normais (HaCaT) na gama de concentrações necessárias para inibir o crescimento de células cancerosas.

Os efeitos inibidores de crescimento de SF em NCI-H460 e NCI-H460 /R ( A), células U87, U87-txr e HaCaT (C) cultivadas em plástico depois de 72 h de tratamento foram avaliadas pelo ensaio de SRB. Média ± D.P. Os valores foram calculados a partir de cinco expericias independentes (N = 5). as células U87-txr (D) NCI-H460 e NCI-H460 /R (B), U87 e foram coradas com CFSE e incubadas durante 72 h com 10 ^ M de SF. A taxa de proliferação (CFSE declinação) foi determinada por citometria de fluxo no canal FL1. microscopia de luz do NCI-H460 e NCI-H460 /R (E), U87 e U87-TxR (F) o crescimento celular em (cultura de 2-D) de plástico e crescimento matrigel (cultura 3-D) após 72 h de 10 mM SF tratamento.

em seguida, foi avaliado o efeito citostático de 10 mM SF em cada linha celular por CFSE coloração (Figura 2B, D). CFSE é um corante vital estável no citoplasma durante cerca de 7-8 gerações, mas a intensidade de fluorescência CFSE diminui devido à sua redução para metade progressiva dentro de células filhas após cada divisão celular. Desta forma, a distribuição CFSE nas células pode-se estimar a taxa de proliferação celular. A distribuição CFSE no controlo e amostras tratadas com SF é ilustrado pelos histogramas perfiladas citometria de fluxo (Figura 2B, D). A inibição da proliferação observada na presença de SF foi o mais pronunced em células NCI-H460 /R. Estes resultados indicaram que a inibição de proliferação é em parte responsável pela actividade anti-cancro de SF.

Uma vez que as linhas celulares de glioblastoma e NSCLC apresentam um elevado potencial metastático, que comparou os efeitos de SF para inibir o crescimento de células após 72 h em plástico (cultura de 2-D) e na membrana basal reconstituída – Matrigel (cultura de 3-D) (Figura 2E, F). Descobrimos que SF inibiu o crescimento em cultura em 3-D, com a mesma eficácia observada em cultura de 2-D. O facto de as células foram separadas a partir de cada tratamento após outra SF em Matrigel, especialmente células de glioblastoma, aponta para a alteração das suas propriedades adesivas. Por isso, especula-se que SF poderia afetar a afinidade de células cancerosas para invadir os vasos sanguíneos, induzir tumor-angiogênese e metástase.

SF induz apoptose dependente da caspase em MDR Cancer Cells

Em seguida, procedeu-se a examinar se a indução de apoptose contribui para a ação anti-câncer do SF em linhas celulares de cancro MDR. Para avaliar a apoptose induzida por SF após 72 horas, as células foram semeadas a uma densidade óptima para as suas propriedades de crescimento. Dessa forma, os controlos não tratados não atingir confluência no final do período de incubação. Anexina V-FITC /iodeto de propídio a coloração revelou que SF aumenta a percentagem de células apoptóticas (AV + PI-) em ambas as linhas celulares de cancro MDR. Os resultados estão resumidos na (Figura 3A, B, C, D): as células vivas são negativas para ambos, Anexina-V e iodeto de propídio (AV-PI-);