Abstract

Objectivo

A interação de células estromais e tumorais desempenha um papel dinâmico em iniciar e reforçar a carcinogênese. Neste estudo, investigou-se a diafonia entre o cancro colo-rectal células (CRC) com fibroblastos do estroma e os efeitos anti-cancro da curcumina e 5-fluorouracilo (5-FU), especialmente em células estaminais cancro (CSC) sobrevivência num 3D-CO modelo -cultura que imita

in vivo

microambiente do tumor.

Métodos

Colon células de carcinoma HCT116 e MRC-5 fibroblastos foram co-cultivadas em monocamada ou de alta densidade microambiente do tumor modelo

in vitro

com /sem curcumina e /ou 5-FU.

resultados

monocamada microambiente do tumor co-culturas suportados crosstalk intensiva entre as células cancerosas e fibroblastos e reforçada até -regulação de moléculas de adesão (metastáticos activas β1-integrina, ICAM-1), factor de crescimento transformante-β moléculas de sinalização (TGF-β3, p-Smad2), a proliferação associada proteínas (ciclina D1, Ki-67) e epitelial-a- mesenquimal (EMT) fator (vimentina) em comparação com tumores HCT116 mono-culturas. Alta densidade microambiente tumoral co-culturas sinergicamente aumentada factores promotores de tumor (NF-kB, a MMP-13), TGF-β3, favoreceu a sobrevivência CSC (caracterizado por sobre-regulação de CD133, CD44, ALDH1) e EMT-factores (aumento da vimentina e Slug, diminuição da caderina-e) em HCT116 comparação com alta densidade HCT116 mono-culturas. Curiosamente, esta diafonia sinérgica foi ainda mais pronunciada na presença de 5-FU, mas drasticamente diminuída na presença de curcumina, induzindo alterações bioquímicas a transição epitelial-mesenquimal (TEM), assim sensibilizar CSCs ao tratamento com 5-FU.

Conclusão

Enriquecimento de CSCs, ativação notável de fatores promotores de tumor e EMT em co-cultura de alta densidade destaca que a interferência no microambiente tumoral desempenha um papel essencial no desenvolvimento e progressão tumoral, e essa interação parece ser mediada, pelo menos em parte, por TGF-β e EMT. Modulação deste crosstalk sinérgica pela curcumina pode ser uma terapia potencial para CRC e suprimir a metástase

Citation:. Buhrmann C, Kraehe P, Lueders C, Shayan P, Goel A, Shakibaei M (2014) curcumina Suprime Crosstalk entre células-tronco do câncer de cólon e estromais fibroblastos no microambiente tumoral: papel potencial da EMT. PLoS ONE 9 (9): e107514. doi: 10.1371 /journal.pone.0107514

editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 26 de junho de 2014; Aceito: 13 de agosto de 2014; Publicação: 19 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Buhrmann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão incluídos dentro do papel

Financiamento:.. Os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum no mundo e coloca grandes problemas clínicos devido à sua alta taxa de metástases e recidiva [1], [2]. Evidências sugerem que o desenvolvimento e progressão do cancro colo-rectal é devido a alterações genéticas e epigenética que são o resultado de interacções complexas de células transformadas com o seu microambiente [1], [3]. O microambiente do tumor é considerado como o leito tumoral, o qual compreende de componentes residentes, tais como células do estroma e os factores que são estáveis ​​dentro do meio do estroma, e componentes não residentes, tais como diferentes populações de células imunes, que influenciam a invasão tumoral e metástase [4]. O impacto sinérgico do microambiente em respostas inflamatórias e a progressão do tumor é agora considerada como uma característica essencial da carcinogénese [1], e existe um interesse crescente na identificação de agentes que visam especificamente a interacção caminho entre as células tumorais e estromais [5 ].

tem sido proposto que a formação de CRC surge a partir de uma pequena sub-população de células estaminais de tumor auto-renovação localizados dentro da cripta do cólon [6], [7]. Com efeito, o CRC células estaminais propriedades (CSC) de exposição semelhantes a células estaminais fisiológicas e são responsáveis ​​para a progressão tumoral [7], [8]. Recentemente, tem sido proposto que os CSCs são o único tipo de célula no microambiente tumoral que manter o micro-ambiente e melhorar a metástase e invasão do cancro [4], [9]. Além disso, tem sido mostrado que a CSC pode interagir directamente ou indirectamente com várias populações de células imunitárias dentro do microambiente do tumor, o que se pensa que influenciam marcadamente a progressão tumoral [4].

os agentes que são capazes de suprimir a interferência Identificando entre o cancro e as células do estroma no microambiente do tumor pode ser um alvo terapêutico importante para reprimir o potencial metastático das CSCs. A fim de desenvolver novas estratégias de tratamento para CRC, por isso é essencial para estudar mais detalhadamente a interação de CSCs com o

residente Comprar e

componentes

não residentes em seu microambiente para elucidar a detalhada mecanismos pelos quais o desenvolvimento CRC e progressão é controlada.

como uma grande proporção dos CRCs estão relacionadas a fatores ambientais [1], nutracêuticos oferecer-se como candidatos ideais para modulam o microambiente do tumor e, assim, apoiar a quimioterapia. Na verdade, esta é importante como mais do que 15% dos pacientes desenvolvem resistência à quimioterapia convencional /corrente com 5-fluorouracilo (5-FU) e mais de 50% dos pacientes desenvolvem recaída [10]. Nós e outros autores mostraram anteriormente que nutracêuticos, tais como a curcumina, pode influenciar directamente as células estaminais por CRC aumentando a sua quimiossensibilidade ao tratamento quimioterapêutico, aumentando marcadamente resultado positivo terapêutica [11] – [13]. Derivado dos rizomas da planta

Curcuma longa

, a curcumina (diferuloylmethane) é um polifenol amarelo que ocorre naturalmente que medeia os seus efeitos através da modulação de vários alvos moleculares importantes, incluindo fatores de transcrição (NF-kB, AP-1, β -catenina), enzimas (por exemplo, COX-2, MMP), citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-a, IL-1 e IL-6), e moléculas de adesão da superfície celular (por exemplo, caderinas, integrinas) [14] – [ ,,,0],16]. A modulação da expressão da metaloproteinase de matriz (MMP), em que o tumor (micro) -Ambiente é importante como MMPs conhecidos são marcadores para a progressão CRC [17] – [19]. metástase e invasão do tumor é ainda influenciada pela interacção de células de tumor com células epiteliais e endoteliais. Adesão e moléculas sinalizadoras, como integrinas desempenham um papel importante durante a progressão e metástase CRC [20], [21]. Além disso, a molécula de adesão intracelular-1 tem sido mostrado (ICAM-1) para aumentar a proliferação de células tumorais e invasão e foi identificada como sendo responsável pela adesão endotelial de células cancerosas, assim, influenciar fortemente o potencial metastático [22], [23]. O microambiente do tumor, além disso, induz a activação de NF-kB, que é conhecido por regular vários genes envolvidos na iniciação do tumor, promoção, e metástase [24], [25], e induzir actividade de Wnt que desempenha um papel fundamental na biologia das células estaminais CRC [ ,,,0],26].

factor de crescimento transformante β (TGF-β) é um polipéptido multifuncional que desempenha um papel essencial na diferenciação, a proliferação e o desenvolvimento embrionário, em tecidos normais. células de tecido sintetizar e secretar o TGF-β no microambiente onde se liga a receptores específicos de TGF-p para parácrino e autócrino sinalização. O complexo de ligando e receptor estimula cascatas de sinalização intracelular que incluem a via canonical Smad2 sinalização [27], que formam complexos com Smad4 e acumula-se e transloca-se para o núcleo. No núcleo, complexos de Smad activados regular a transcrição de genes específicos e, finalmente, regular o ciclo celular e a reparação de tecidos [27]. Sabe-se que o TGF-β é um supressor de tumor em células de tecido normal e nas fases iniciais de progressão tumoral. Em células tumorais o efeito inibidor do crescimento de sinalização de TGF-β é desregulado e comuta de supressor de tumor para tumor factor promotor de órgãos diferentes [27], [28]. Além disso, tem sido relatado que a estimulação de TGF-β em células estromais provoca a secreção de IL-11 e aumenta a capacidade de metástases de células de CRC enquanto que os animais tratados com um inibidor específico de receptor de TGF-β 1 são resistentes a formação de metástases [ ,,,0],29]. Curiosamente, foi relatado que a secreção de citocinas e factores de crescimento pelas células estromais em um microambiente do tumor desencadeia uma transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) que suporta a resistência às drogas, a recorrência do tumor, invasão e metástase de células neoplásicas [30]. Além disso, a expressão de E-caderina é regulado negativamente durante EMT e este pode ser bloqueada por eliminadores de transcrição de dedos de zinco, tais como Lesma e este processo é reversível [31] – [34].

Caracterização dos mecanismos moleculares envolvidos no papel indutor de tumores de sinalização de TGF-β e EMT num microambiente do tumor entre os fibroblastos e as células de tumor pode ajudar a desenvolver estratégias terapêuticas contra o desenvolvimento do tumor, tais como CRC. Por conseguinte, o objectivo do estudo apresentado foi investigar em mais detalhe a interacção de células de CRC com fibroblastos do estroma, a activação de proteínas inflamatórias promotoras do câncer, mediadores parácrinos e os efeitos moduladores da curcumina e 5-FU, especialmente em células estaminais de CRC e EMT em um

in vitro

co-cultura microambiente do câncer, que simula as

in vivo

microambiente do tumor.

Materiais e Métodos

os anticorpos

monoclonal anti-ALDH1 foi obtido a partir de Acris Anticorpos GmbH (Herold, Alemanha). Monoclonal anti-CD133 e anti-CD44 foram adquiridos a Abcam PLC (Cambridge, Reino Unido). Anti-β-actina, anti-ciclina D1, anti-ICAM-1, anti-vimentina, anti-caderina-E, anti-Slug, anti-TGF-β3, anti-TGF-β3R e anti-p-Smad2 eram obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Anti-MMP-1, anti-MMP-9 e anti-MMP-13 foram adquiridos a partir de R D Systems, Inc., (Heidelberg, Alemanha). Anti-fosfo-p65 específico (NF-kB) e p50 anti-fosfo-específico (NF-kB) foram obtidas a partir de tecnologia celular (Beverly, MA, EUA). Anticorpo neutralizante pan-TGF-β, IgG normal de coelho e anti-β1-integrina foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemie (Munique, Alemanha). Os anticorpos secundários utilizados para marcação de fluorescência anti-Ki-67 e foram adquiridos a partir de Dianova (Hamburgo, Alemanha). anticorpos secundários fosfatase alcalina ovelhas ligada anti-ratinho e de ovelha anti-coelho para immunoblotting foram adquiridos da Millipore (Schwalbach, Alemanha).

O meio de crescimento, produtos químicos e citocinas

O meio de crescimento (F- de Ham 12 /meio de Eagle modificado por Dulbecco (50:50) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), ácido ascórbico /ml 25? g, 50 UI /ml de estreptomicina, 50 IU /ml de penicilina, 2,5 ug /mL de anfotericina B, aminoácidos essenciais e L-glutamina), Tripsina /EDTA (CE 3.4.21.4) foram adquiridos da Biochrom (Berlim, Alemanha). 5-FU foi adquirido a partir de Sigma (Munique, Alemanha). BCM-95 curcumina, com uma pureza superior a 95% foi adquirido a Dolcas Biotech LLC (NJ, EUA). Esta fonte comercial de curcumina contém três componentes principais: diferuloylmethane (o componente mais abundante e ativo da cúrcuma) (82%) e seus derivados demethoxycurcumin (15%) e bisdemetoxicurcumina (3%), em conjunto referidas como curcuminoids [35], [ ,,,0],36]. A curcumina foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) na forma de uma concentração de caldo de 5,000 uM e armazenadas a -80 ° C. As diluições em série foram preparadas em meio de cultura. estoque de 100 mM de 5-FU (5-fluorouracilo) foi preparada em DMSO absoluto e armazenados a -20 ° C. A concentração de DMSO era inferior a 1% do tratamento medicamentoso. Para o tratamento, o 5-FU foi diluída em DMEM e adicionadas às culturas para dar a concentração final desejada.

linhas de células e cultura de células

células de cólon humano (HCT116) e células de fibroblastos humanos normais (MRC-5) foram obtidas da European Collection of Cell Cultures (Salisbury, Reino Unido). As células foram mantidas em frascos de cultura de tecidos com meio de crescimento num incubador humidificado a 37 ° C numa atmosfera de 95% de ar e 5% de CO

2. O meio foi mudado três vezes por semana e as células passadas quando 70% de confluência foi atingido. Para monocamada microambiente tumoral co-culturas, HCT116 e MRC-5 foram co-cultivadas numa proporção de 01:01 em cultura de monocamada e as co-culturas foram deixadas durante até 3 dias. O meio DMEM suplementado foi trocado a cada 3-4 dias e as células colhidas nos pontos de tempo indicados. Todas as co-culturas foram semeadas em confluência a assegurar um contacto óptimo entre as células. Por alta densidade microambiente tumoral co-culturas, culturas de alta densidade HCT116 foram co-cultivadas com células MRC-5 em monocamada. Para a formação de culturas de alta densidade, uma gota de 10 ul de suspensão de células que contém cerca de 1 milhão de células HCT116 foi colocado sobre um filtro de nitrocelulose no topo de uma ponte steelnet, como previamente descrito [37]. Neste sistema as células agregar e são nutridos por difusão. células MRC-5 são crescidas em monocamada sobre o fundo do prato de petri. Este modelo imita um dimensional

in vivo

situação três e permite a troca entre os componentes residentes e as células cancerosas no microambiente tumoral no meio do ar interfase. Alta densidade microambiente tumoral co-culturas foram deixadas não tratadas ou tratadas apenas com curcumina (5 uM) ou 5-FU sozinho (1, 5, e 10 uM), ou foram pré-tratadas durante 4 h com a curcumina (5 uM) seguido por tratamento com 5-FU (0,1, 1, 2 e 3 um) durante o tempo indicado. Em algumas experiências, para investigar o papel de TGF-β durante a diafonia no microambiente tumoral co-culturas, as culturas foram tratadas com um anticorpo neutralizante para TGF-β (10, 20, 30 ng /ml) ou IgG de controlo (10 , 20, 30 ng /ml) durante o tempo indicado.

análise de microscopia de imunofluorescência indireta de monocamada e microambiente do tumor de alta densidade co-culturas

HCT116 e MRC-5 foram co-cultivados em um proporção de 1:01 em placas de vidro em monocamada ou em alta densidade microambiente tumoral co-culturas. Após fixação com metanol durante 10 min, as células foram lavadas três vezes com PBS e cobertas com albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min. Os anticorpos primários foram diluídos 1:50 em PBS /BSA, incubadas durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida, lavadas três vezes com PBS /BSA, seguido por incubação com anticorpos secundários acoplados com rodamina (diluído 1:80 em PBS /BSA) durante 1 h à temperatura ambiente e finalmente lavadas de novo três vezes com água destilada. Contador de coloração foi realizada com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole, Sigma) para visualizar os núcleos das células. As lâminas foram cobertas com montagem Fluoromount e examinada sob um microscópio de fluorescência (Leica, Alemanha).

Toluidine coloração azul da monocamada e microambiente do tumor de alta densidade co-culturas

células MRC-5 foram cultivadas em monocamada em alta densidade microambiente do tumor co-culturas com células HCT116. Alta densidade microambiente tumoral co-culturas foram quer deixados sem tratamento, tratados com curcumina por si só (5 uM), 5-FU sozinho (1 | iM) ou foram pré-tratadas durante 4 horas com curcumina (5 uM), seguido por tratamento com 5-FU (0,1, 1, 2, 3? M). HCT116 e culturas MRC-5 foram avaliados após 10 dias. HCT116 alta densidade microambiente tumoral co-culturas foram embebidos em Tissue-Tek (Sakura Finetek Europa, Holanda), criopreservado a -80 ° C e cortado em secções de 5-7 ^ M, utilizando um cryomicrotome (Zeiss, Alemanha). Monocamada de células MRC-5 foram fixadas com metanol durante 10 min. seções HCT116 e MRC-5 monocamadas foram coradas com azul de toluidina e examinada sob um microscópio de luz (Leica, Alemanha).

A absorção de curcumina em monocamada e microambiente do tumor de alta densidade co-culturas

A a absorção celular de curcumina nas monolayer- e alta densidade de co-culturas, como descrito acima, foi avaliada com o método de fluorescência. Resumidamente, para as secções HCT116 exame de fluorescência e MRC-5 culturas foram fixadas com paraformaldeído, coberto com Fluoromount montagem e examinado sob um microscópio de fluorescência (Leica, Alemanha).

análise Western blot

célula inteira Os lisados ​​de mono- alta densidade HCT116 ou co-culturas foram preparadas e fraccionados por SDS-PAGE [12]. Resumidamente, as células foram lavadas em PBS, e as proteínas foram extraídas com tampão de lise (50 mM Tris /HCl (pH 7,2), NaCl 150 mM, 1% (v /v) de Triton X-100, ortovanadato de sódio 1 mM, 50 mM pirofosfato de sódio, fluoreto de sódio 100 mM, 0,01% (v /v) de aprotinina, pepstatina a (4 ug /ml), leupeptina (10 ng /mL), e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF)) durante 30 min em gelo. Depois de ajustar a concentração de proteína total com o sistema ácido bicinconínico (Pierce) usando a albumina do soro bovino como padrão, quantidades iguais (500 ug de proteína por faixa) das proteínas totais foram separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras. As proteínas separadas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e incubados em tampão de bloqueio (5% (w /v) de leite em pó desnatado em PBS, 0,1% de Tween 20) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite com o anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio, a 4 ° C num agitador, lavou-se 3 vezes com tampão de bloqueio, e, em seguida, incubadas com o anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina, durante 90 minutos à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas 3 vezes em Tris 0,1 M (pH 9,5) contendo 0,05 M de MgCl

2 e 0,1 M de NaCl. complexos específicos antigénio-anticorpo foram detectados utilizando azul de nitrotetrazólio e 5-bromo-4-cloro-3-indoylphosphate (

p-toluidina

sal; Pierce, Rockford, IL, EUA). como substratos para fosfatase alcalina

a análise estatística

os dados numéricos são expressos como os valores médios (+/- DP) para uma experiência representativa realizada em triplicado. As médias foram comparadas utilizando

t

Student assumindo variâncias iguais. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas se a

valor p

foi inferior a 0,05.

Resultados

Para entender alguns dos comportamentos biológicos fundamentais de células estromais e tumores e para simular um

in vivo

microambiente do tumor,

in vitro sistemas

co-cultura foram estabelecidas. O foco deste estudo foi investigar a interação de HCT116 células cancerosas colorectal com fibroblastos humanos células MRC-5 em um modelo microambiente co-cultura de alta densidade, com ou sem a curcumina e /ou 5-FU na proliferação de células tumorais, factores promotores de tumor , invasão, EMT e CSCs colorretais.

o crosstalk intensiva entre HCT116 e células MRC-5 na co-cultura em monocamada influências microambiente expressão de moléculas implicadas na adesão, invasão e /ou proliferação

HCT116 e células MRC-5 foram co-cultivadas numa proporção de 1:01 durante três dias em monocamada e avaliadas com microscopia de luz. células HCT116 literalmente acumulada e agrupado em torno das células MRC-5 em busca e o estabelecimento de contacto íntimo célula-a-célula, com as células MRC-5 na co-cultura do tumor (Fig. 1, PC). Em seguida, foi realizada a coloração por imunofluorescência de co-culturas em monocamada para investigar se a interacção celular observada leva a alterações funcionais nas células. As células HCT116 na cultura em monocamada ou HCT116 e células MRC-5 em monocamada de co-culturas foram marcadas com β1-integrina, ICAM-1, Ki-67, ciclina D1, TGF-β3, p-Smad2 e vimentina (Fig. 1, SE ). Observou-se forte expressão de adesão e moléculas metastáticos β1-integrina, ICAM-1, de proteínas do ciclo celular activas Ki-67, ciclina D1, de TGF-β3, p-Smad2 e de EMT marcador vimentina em HCT116 co-culturas em comparação com HCT116 mono-cultura (Fig. 1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a interacção de células de estroma é crucial para a promoção do tumor, criando assim um microambiente celular que regula a progressão do cancro.

células HCT116 (setas) ou foram cultivadas isoladamente ou foram co-cultivadas com células MRC-5 células (*) numa proporção de 1:01 durante três dias em placas de vidro em monocamada e fixada com metanol. Para as células de imunomarcação foram incubadas com anticorpos primários contra β1-integrina, ICAM-1, Ki-67, ciclina D1, TGF-β3, p-Smad2 e vimentina), seguido por incubação com anticorpos secundários acoplados com rodamina e contrastação com DAPI para visualizar célula núcleos. As imagens mostradas são representativos de três experiências diferentes. PC: contraste de fase; SE: imunofluorescência; Ampliação 400 ×; bar = 30 nm.

curcumina e /ou 5-FU afetar fortemente a integridade da célula em alta densidade microambiente do tumor co-culturas

Em seguida, avaliamos alta densidade microambiente do tumor co-culturas , HCT116 em alta densidade em co-cultura com células MRC-5 em monocamada, que imitam o

in vivo

situação para investigar a influência de agentes terapêuticos parácrinos na interferência entre as células e sobre a proliferação de células de tumor, tumor de promoção factores, invasão e a formação de esferas de tumor, uma característica proeminente do cancro de células estaminais. Na verdade, tem sido relatado que células de fibroblastos normais são capazes de induzir a diferenciação de células de tumor, tais como uma linha celular de carcinoma do cólon humano [38], [39]. Os efeitos de 5-FU e /ou curcumina na integridade celular e formação colonosphere em culturas microambiente do tumor foi avaliada em células HCT116 depois de 10 dias. As células foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina ou 5-FU (0, 0,1, 1, 5 e 10 uM) e formação colonosphere foi avaliada por microscopia de luz, como descrito em Materiais e Métodos. O indivíduo IC

50 de curcumina ou 5-FU foram de aproximadamente 5 uM ou 3.5μM, respectivamente (p 0,05). Para avaliar o efeito do tratamento combinado, as células HCT116 foram pré-tratadas com 5 uM curcumina durante 4 h e, em seguida, co-tratados com diferentes concentrações de 5-FU (0, 0,1, 1, 5 e 10 uM) durante 10 dias. Interessantemente, o pré-tratamento com a curcumina reduzida IC

50 valores para 5-FU a 0,1 uM em HCT116 (p 0,05) (Fig. 2A). Isto sugere que a curcumina sensibiliza células HCT116 de 5-FU. Além disso, a coloração com azul de toluidina em culturas de controlo mostraram que as células formaram colónias bem desenvolvidas esferóides durante o período de cultura (Fig 2B:. A). O tratamento de culturas HCT116 com 5-FU (5 uM) ou curcumina (5 uM), isoladamente ou com a curcumina e 5-FU (5 uM /0,1 uM) foi demonstrado ser altamente eficaz na inibição da formação e colonosphere reforço desintegração de esferas de alta densidade do tumor em comparação com os controlos correspondentes (Fig 2B:. a). Este efeito foi maior com a curcumina ou curcumina /5-FU tratada co-culturas (Figura 2B:. A). Em seguida, investigou-se a captação celular de curcumina por HCT116 no microambiente tumoral co-culturas com microscopia de fluorescência. Os resultados mostraram claramente que a curcumina foi recolhido por todas as células HCT116 em curcumina tratada microambiente co-culturas (Figura 2B:. B). Para investigar se a monocamada de células MRC-5 no microambiente co-culturas sobreviver ao tratamento com 5-FU, a curcumina e /ou 5-FU, que as células coradas com azul de toluidina. Como mostrado na Fig. 2C: um, as células MRC-5 são bem corados que é um sinal de vitalidade. Além disso, a curcumina foi recolhido por todas as células MRC-5 em curcumina tratada microambiente tumoral co-culturas (Figura 2C:. B).

A: Quantificação do número de colonosheres foi alcançada através da contagem do número de esferóide colónias de 10 campos microscópicos no microambiente de alta densidade co-culturas. As culturas foram quer deixados sem tratamento (Co) ou foram tratados com 5-FU (0,1, 1, 5 ou 10 uM), curcumina (0,1, 1, 5 ou 10 uM), ou foram pré-tratados com curcumina (5 uM), durante 4 h, e, em seguida, exposta a 5-FU (0,1, 1, 5 ou 10 uM) durante 10 dias e avaliados por microscopia de luz. Os valores foram comparados com os valores estatisticamente significativos com

p

0,05 foram designados por um asterisco (*) e

p

0,01 foram designados por um asterisco (**). Azul de toluidina perfil de coloração (2B /C, um) e a absorção celular curcumina (2B /C, b) de HCT116 (B) em alta densidade e em células MRC-5 (C) em co-cultura em monocamada. Tumor microambiente co-culturas foram quer deixados sem tratamento (Co) ou foram tratados com 5-FU (5 uM) (5-FU), curcumina (5 uM) (CUR) ou foram pré-tratados com curcumina (5 uM), durante 4 h, e, em seguida, exposta a 5-FU (0,1 uM) (Cur + 5-FU) por 10 dias e avaliadas sob um microscópio fluorescente ou luz. As imagens mostradas são representativos de três experiências independentes. F = Filter. (*) = Colonosheres HCT116. Ampliação 4B, 4ca: 200x, 4BC: 400x; bar = 30 nm.

CSCs cólon em populações de células CRC são alvo de alta densidade microambiente do tumor co-culturas por 5-FU, a curcumina eo tratamento combinado

Tem sido relatado que o microambiente do tumor desempenha um papel essencial na perpetuação da CSCs promovendo afectado por estroma, células inflamatórias, citocinas e factores de crescimento segregado pelos fibroblastos estromais [26], [40]. Portanto, examinámos o comportamento de CSCs dentro da população de células de CRC, de alta densidade mono-culturas de células HCT116 foram deixados sem tratamento. Tumor microambiente co-culturas de /células HCT116 MRC-5 foram quer deixados sem tratamento, ou tratados com 5-FU (5 uM), curcumina (5 uM) ou pré-tratados com curcumina (5 uM) durante 4 h e, em seguida, expostos a 5-FU (0,1 ^ M) durante 10 dias. As culturas foram submetidas a rotulagem de imunofluorescência com anticorpos primários para CSC marcador (CD133). expressão ligeira de CD133 foi detectado no controle mono-culturas basais (Fig. 3a). Curiosamente, em contraste, as células positivas CD133 de células HCT116 em microambiente co-culturas foram maior comparada com a de controlo de mono-cultura (Fig. 3A), indicando o papel sinérgico importante da diafonia entre HCT116 e células MRC-5 em apoiar promoção de tumores. Além disso, as células positivas de CD133 a população linha celular HCT116 mostraram um aumento significativamente a sobrevivência após o tratamento com 5-FU em comparação com a curcumina ou /e 5-FU (Fig. 3A). Na presença de curcumina e /ou 5-FU, que exibiram marcada regulação negativa de células positivas CD133 (Fig. 3a e 3b), demonstrando o efeito de quimiosensibilização proeminente da curcumina na CSCs. Por quantificação, confirmou-se que o número de células marcadas com CD133 aumento no microambiente HCT116 co-culturas em relação ao controle de tumor de mono-cultura de células positivas (Fig. 3A), e CD133 aumento na população de células sobreviventes após o tratamento com 5-FU , mas não com a curcumina ou o tratamento combinado (Fig 3B).

a:. alta densidade mono-culturas de células HCT116 foram deixados sem tratamento (a, Co.HD-mono-cultura), microambiente do tumor alta densidade co-cultura de HCT116 /MRC-5 As células foram deixadas sem tratamento (A, Co.Microenv-HD-co-cultura), ou tratados com 5-FU (5 uM) (A, 5-FU-Microenv-HD-co- cultura), curcumina (5 uM) (a, Cur-Microenv-HD-Co-cultura) ou pré-tratados com curcumina (5 uM), durante 4 h, e, em seguida, expostos a 5-FU (0,1 uM) (a, Cur + 5FU -Microenv-HD-Co-cultura) durante 10 dias. Imunomarcação foi realizada com anticorpos primários para cólon CSC marcador (CD133), seguido por incubação com anticorpos secundários acoplados com rodamina e contracoloração com DAPI para visualizar os núcleos das células. As imagens mostradas são representativos de três experiências diferentes. Ampliação 400 ×. barra 30 nm. B: Para quantificar a quantidade de células CD133-positivos em culturas de alta densidade acima descritos, a partir de 100 células 15 campos microscópicos foram contadas. O exame foi realizado em triplicado, e os resultados são apresentados como os valores médios com S.D. a partir de três experiências independentes. Os valores foram comparados com os valores estatisticamente significativos com

p

0,05 foram designados por um asterisco (*) e

p .

0,01 foram designados por um asterisco (**)

a curcumina tem efeito quimiossensibilização potente em células-tronco de câncer de cólon em populações de células CRC em alta densidade microambiente do tumor co-culturas

em seguida, marcadores CSC (CD133, CD44 e ALDH1) expressão foi examinado para capacidade de formação de tumores e o efeito quimiossensibilização da curcumina em marcadores CSC em HCT116 3D microambiente do tumor de alta densidade co-culturas. As co-culturas foram quer deixados sem tratamento, tratados com curcumina (5 uM), 5-FU (1, 5, e 10 uM) sozinho ou foram pré-tratadas durante 4 h com a curcumina (5 uM) seguido por tratamento com 5-FU (0,1, 1 , 2, 3 um) durante 10 dias (Fig. 4). Além disso, num outro conjunto de experiências, as células HCT116 foram incubadas em alta densidade mono-culturas, sem f ibroblastos como controlo basal. O controlo de alta densidade mono-culturas de HCT116 mostraram expressão basal de marcadores CSC (Fig. 4: a, b, c). Em contraste com isto, a análise de imunotransferência de lisados ​​de células inteiras mostraram marcada sobre-regulação de CD133, CD44 e ALDH1 em HCT116 no controle e tratados com 5-FU alta densidade microambiente tumoral co-culturas em uma maneira dependente da concentração (Fig. 4 :abc). No entanto, interessante notar que o pré-tratamento com a curcumina, seguido por tratamento com 5-FU significativamente regulada negativamente a expressão do marcador de CSC de um modo dependente da concentração, em células HCT116 em alta densidade tumorais co-culturas (Fig. 4: a, b, c). A análise densitométrica das experiências típicas de transferência de Western mostram a regulação por diminuição dos marcadores CSC em células HCT116 em culturas tratadas com 5-FU, a curcumina e /ou 5-FU curcumina (Fig. 4: a, b, c). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a interacção entre parácrina células tumorais e do estroma é crucial no que promovem CSCs e que existe um efeito de quimiosensibilização forte da curcumina no cólon CSC em alta densidade microambiente tumoral co-culturas.

HCT116 alta densidade mono-culturas foram quer deixados sem tratamento (HCT, Co.) ou foram co-cultivadas com células MRC-5 no microambiente tumoral. Microambiente tumoral co-culturas foram quer deixados sem tratamento (Co.), tratado com a curcumina por si só (5 uM), 5-FU sozinho (1, 5, e 10 uM), ou foram pré-tratadas durante 4 h com a curcumina (5 uM) seguido por tratamento com 5 -FU (0,1, 1, 2, 3 um). Após 10 dias de cultura, foram preparados lisados ​​celulares totais de culturas de alta densidade HCT116 e analisadas por transferência Western e densitometria quantitativa com CSC marcador ALDH1 (a), CD133 (b), e CD44 (c). avaliação densitométrica da expressão da proteína, conforme revelado por análise Western Blot foi realizada em triplicado. proteína de limpeza β-actina serviu como um controlo de carga em todos os experimentos. Os valores foram comparados com o controlo e com valores estatisticamente significativos

P

0,05. Os valores significativos são marcados com (*).

A curcumina e /ou 5-FU interferir na crosstalk sinérgico entre /CSC-células e fibroblastos CRC- em alta densidade microambiente do tumor co-culturas

para analisar a interacção entre células /CSC-CRC- e fibroblastos e para avaliar o efeito da curcumina e /ou 5-FU sobre esta diafonia sinérgico, em proliferação de células de tumor, invasão e factores promotores de tumor (MMPs, NF -κB) expressão em mais detalhe, foi realizada a análise de western blotting de alta densidade microambiente tumoral co-culturas.