Abstract
A ciclina dependente de quinase 5 (CDK5) é uma serina citoplasmática /treonina-quinase. Knockdown de CDK5 aumenta a sensibilidade paclitaxel em células de cancro do ovário humanos. Este estudo explora os mecanismos pelos quais CDK5 regula a sensibilidade paclitaxel no cancro do ovário humanos. Várias linhas celulares de cancro do ovário e xenoenxertos foram tratados com CDK5 pequeno ARN interferente (siRNA) com ou sem paclitaxel para examinar o efeito sobre a viabilidade celular de cancro, a paragem do ciclo celular e o crescimento do tumor. proteína CDK5 foi medida por coloração imuno-histoquímica de um tissue microarray do cancro do ovário para correlacionar expressão CDK5 com a sobrevida global dos pacientes. Knockdown de CDK5 com siRNAs inibe a activação de AKT que correlaciona-se significativamente com a diminuição do crescimento celular e a sensibilidade aumentada de paclitaxel em linhas celulares de cancro do ovário. Além disso, CDK5 knockdown sozinho e em combinação com paclitaxel induzida G1 paragem do ciclo celular e caspase 3 morte celular apoptótica dependente associada com a regulação positiva de pós-translacional e a translocação nuclear de TP53 e p27
KIP1 bem como TP53-dependente indução da transcrição de p21
Cip1 no tipo selvagem células cancerosas TP53. Tratamento de HEYA8 e A2780 tipo selvagem TP53 xenoenxertos em ratinhos nu nu /com CDK5 siARN e paclitaxel produzidos significativamente maior de inibição do crescimento do que qualquer tratamento sozinho. A expressão aumentada de CDK5 nos cânceres de ovário humano se correlaciona inversamente com a sobrevida global. CDK5 modula a sensibilidade de paclitaxel através do controlo de activação AKT, o ciclo celular e apoptose dependente da caspase. inibição de CDK5 pode potenciar a actividade paclitaxel em células de cancro do ovário humanos
Citation:. Zhang S, Lu Z, Mao W, Ahmed AA, Yang H, Zhou J, et al. (2015) CDK5 Regula Paclitaxel Sensibilidade em células de cancro do ovário, modulando AKT Activation, p21Cip1- e interrupção do ciclo G1 celular mediada por p27Kip1 e apoptose. PLoS ONE 10 (7): e0131833. doi: 10.1371 /journal.pone.0131833
editor: Peiwen Fei, Universidade do Havaí Cancer Center, United States |
Recebido: 02 de março de 2015; Aceito: 06 de junho de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Anne e Zarrow Fundação Henry e presentes amáveis de Stuart e Gayle Lynn Zarrow, bem como doações da Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas RP110-595, a Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer, o SPORE MD Anderson no cancro do ovário NCI P50 CA83639, U54 CA151668, UH2 TR000943-01, a Fundação RGK, eo CA16672 CCSG P30 MD Anderson NCI (citometria de fluxo e Pesquisa animal instalações de apoio). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
nos Estados Unidos, em 2014, havia cerca de 21.980 novos casos de câncer de ovário e 14.270 mortes por esta doença, de acordo com uma taxa de cura de apenas 30% para todas as fases. Melhoria dos resultados pode ser alcançado se a sensibilidade à quimioterapia primária foram reforçadas. Foram identificados dois tipos principais de câncer de ovário epitelial. Tipo I cancros de “baixo grau” crescem lentamente e muitas vezes são detectados em fase precoce. Em nível molecular, Tipo I cancros têm tipo selvagem
TP53 Comprar e são acionados por mutações ativadoras em Ras e diferentes membros da via de sinalização PI3K. Tipo II cancros “alto grau” crescer mais rapidamente e muitas vezes são diagnosticados em estágio avançado. cancros do ovário alto grau exibem mutado
TP53
, bem como anomalias frequentes de reparação recombinação homóloga do DNA e são movidos por várias anormalidades no número de cópias de DNA, mas só muito raramente por mutações ativadoras. Ambos os tipos de cancro do ovário são tratados com cirurgia citorredutora e uma combinação de drogas, que inclui paclitaxel e carboplatina. Para melhorar a eficácia de paclitaxel para o tratamento de cancro do ovário, foi realizado um rastreio da biblioteca kinome siRNA na presença e ausência de paclitaxel para identificar quinases que regulam a sensibilidade paclitaxel. Knockdown de sensibilidade paclitaxel CDK5 melhorada [1]. CDK5 é necessária para a migração adequada neuronal, a formação de sinapses, e sobrevivência. Hiperactivação de CDK5 é ligado a perturbações neurodegenerativas graves, incluindo a doença de Alzheimer [2-5]. Recentemente, a desregulação de CDK5 tem sido associada a doenças malignas, incluindo os cancros da próstata, do pâncreas, da tiróide, pulmão, cérvix, mieloma, e da mama [6-13].
Neste estudo, verificou-se que CDK5 knockdown inibe a fosforilação de AKT, e induz a paragem do ciclo celular G1, apoptose e aumento da sensibilidade ao paclitaxel em linhas celulares de cancro do ovário. Além disso, a indução de parada G1 e apoptose pelo CDK5 knockdown refere-se a indução de TP53, p21
Cip1 e p27
proteína KIP1. inibição de CDK5 fornece uma nova estratégia para a gestão de cancros do ovário com e sem tipo selvagem TP53 função.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e culturas
HEY, A2780, CAOV3, linhas celulares de cancro do ovário humano ES-2 e SKOV3 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). EF021, EF027, OAW42, OC316 e IGROV1 foram gentilmente cedidas pelo laboratório Dr. Gordon Mills ‘[14-17] e todas as linhas celulares foram confirmados com impressões digitais de DNA STR que foi feito pelo núcleo Linha celular MDACC Caracterizado (apoiado pelo NCI # CA016672). células SKOV3 foram cultura com 5A de Macoy; OC316, EFO27, EFO21, IGROV1, ES-2, células A2780 e Hey eram de cultura com RPMI1640; CAOV3 e OAW42 células foram cultivadas com DMEM. Todos os meios foram obtidos a partir da Facilidade de mídia Preparação do núcleo em M. D. Anderson Cancer Center. As células foram cultivadas com SW626 de Leibovitz L-15 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Todas as linhas celulares foram testadas para micoplasma com um MycoSensor PCR Assay Kit de Stratagene (La Jolla, CA) e considerados livres de contaminação.
siRNA e transfecção de plasmídeo
Todas as linhas celulares foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo ou um ARNsi específico usando reagente DharmaFECT 4 (GE Dharmacon, Lafayette, CO). Uma mistura de ARNsi (15 nM de concentração final) e 4 DharmaFECT reagente (12,5 nM de concentração final), foi incubada durante 20 quarto minat temperada antes de ser aplicado às células.
ensaios de crescimento celular
A ensaio de violeta de cristal foi utilizado para avaliar o crescimento de células dependentes de ancoragem, como descrito anteriormente. Resumidamente, HEY (6 × 10
3) ou A2780 (8 × 10
3) células foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços de cultura de células e reverta transfectadas durante 24 horas com um controlo negativo de siRNA ou um CDK5 siRNA e incubadas durante um período adicional de 48 horas com ou sem paclitaxel (3 nM). As células foram lavadas com PBS, fixadas em glutaraldeído a 1%, e coradas com 0,5% de violeta de cristal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dissolvido em metanol. O corante que coraram as células nas placas foi eluída com tampão de Sorenson (citrato de sódio a 0,9%, HCl 0,02 e 45% de etanol) e directamente medida com a utilização de um leitor de microplacas Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) numa comprimento de onda de 570 nm.
ensaios clonogénicos
Um ensaio clonogénico foi realizada como descrito anteriormente [18]. Resumidamente, as células HEY ou A2780 foram semeadas a 500 e 800 células por poço, em triplicado, após transfectadas durante 24 horas com um siRNA de controlo negativo ou um ARNsi CDK5 durante 14 dias. As células foram depois fixadas em glutaraldeído a 1% e coradas com 0,5% de violeta de cristal em metanol. As colónias com mais de 30 células foram contadas.
A citometria de fluxo
A percentagem de células na fase sub-G1 do ciclo celular (isto é, células apoptóticas) foi determinada com base na concentração de ADN relativamente medido com uma citometria de fluxo como descrito anteriormente [1]. Resumidamente, ei células foram transfectadas durante 24 horas com um siRNA de controlo negativo ou um ARNsi CDK5 e tratou-se com ou sem paclitaxel (3 nM) durante 24 h e foram depois destacadas por incubação com 0,05% de tripsina-EDTA, lavadas com PBS e fixadas durante a noite em 70% de etanol. As células fixadas foram então centrifugadas, lavadas, ressuspensas em PBS contendo ARNase A e iodeto de propídio (50 ug /mL de cada) e incubou-se durante 20 minutos a 37 ° C com agitação suave. As células coradas foram filtrados através de malha de nylon (41 mícrons de tamanho de poro) e analisadas num citómetro de fluxo Coulter XL-MCL (Coulter Corporation, Miami, FL). As percentagens de população sub-G1 e distribuição do ciclo celular foram determinadas usando o programa de software multicycle (Phoenix Fluxo Systems, San Diego, CA).
qRT-PCR análise
As células foram colhidas e totais o ARN foi extraído a partir de células utilizando ARN kit fácil (Qiagen, Hilden Strasse 1, 40724Germany) de acordo com as instruções do fabricante. pureza ARN foi avaliada medindo a absorção a 260 nm (A260) e a 280 nm (A280). As amostras que tinham razão A260 /A280 de 1,9-2,1 foram considerados aceitáveis. A integridade do ARN foi determinada por coloração com brometo de etídio de ARN 18S e 28S em geles após electroforese. As concentrações de RNA foram determinadas a partir da absorvância a 260 nm (A260). qRT-PCR foi realizada com a utilização de um 7900HT sistema de prismas sequência de detecção (Applied Biosystems Incorporated, Foster City, CA) e SYBR Green Universal PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), como descrito anteriormente [1]. O ARN total isolado a partir de Ei células transfectadas com ARNsi individuais foi transcrito de forma inversa em ADNc com o uso de um kit de ADNc (Invitrogen, Carlsbad, CA), e o cDNA foi sujeito a qRT-PCR para avaliar os níveis de mRNA de p21Cip, TP53, p27Kip1 Bcl2 e CDK5. TP53 (VHPS-9498) e p21Cip (VHPS-1770) iniciadores foram adquiridos a partir Tempo real Primers (Elkins, PA). p27kip1 iniciadores são 5′-GAGTGGCAAGAGGTGGAGAA-3 ‘(F) e 5′-GCGTGTCCTCAGAGTTAGCC-3′ (R), os iniciadores são Bcl2 5’-GGAGGATTGTGGCCTTCTTT-3 ‘(F) e 5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3′ (R) e iniciadores de CDK5 foram 5’-ACTCCTACATGGGCAACGAG-3 ‘(F) e 5′-CGTTCTTCAGGTCGGAGAAG-3’ (R). A PCR foi realizada num volume total de 30 ul, que incluía 15 ul de 2X PCR universal Master Mix, 3 ul de 10 x SYBR Green, 20 | iM de cada iniciador directo e inverso, e 50 ng de cada amostra de cDNA. As amplificações foram realizadas em triplicado em placas de microtitulação de 96 poços. condições de ciclos térmicos foram as seguintes: 95 ° C durante 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 10 segundos, e 59 ° C durante 40 segundos. Uma análise da curva de fusão foi utilizada para todos os conjuntos de iniciadores para excluir a amplificação não específica e consistiu de 95 ° C durante 15 segundos, 59 ° C durante 15 segundos, seguido de aumento da temperatura de 1 ° C a cada 2 segundos até 95 ° C, e em seguida 95 ° C durante 15 segundos.
imunoblot e imunoprecipitação
As células foram extraídas com tampão de lise (HEPES 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, 1% de Triton X-100 a pH 4) contendo inibidores de fosfatase e protease. A concentração de proteína de lisados foi determinada com um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Quantidades iguais de proteína total foram fervidas em tampão de amostra e separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). As membranas foram incubadas com anticorpos específicos contra o p-AKT (Cell Signaling, Danvers, MA), p53 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27Kip1 (laboratório BD Transdução, Franklin Lakes, New Jersey), p21Cip (Santa Cruz Biotech , Santa Cruz, CA), de caspase 3 (a sinalização celular, Danvers, MA). Actina ou GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) foram utilizados como um controlo de carga nas experiências com proteínas celulares. HEY células (2 x 10
6) foram transfectadas com ARNsi durante 72 h e, em seguida, submetidas a lise em tampão RIPA (20 mM de Tris-HCl [pH 7,5], NaCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% NP-40, 1% desoxicolato de sódio, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, 1 mM de b-glicerofosfato, e ortovanadato de sódio 1 mM). Resumidamente, as alíquotas dos lisados de células inteiras (~ 500 pg) foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo de ratinho anti-CDK5 (~ 1 ug) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). soro de ratinho foi utilizado um controle imunoprecipitação negativo. complexos anticorpo-antigénio foram colhidas com a utilização de esferas de agarose de proteína A-(GE Healthcare, Piscataway, NJ) e lavou-se três vezes a lavagem com tampão RIPA.
fraccionamento subcelular
HEY células foram transfectadas com controlo negativo e CDK5 siRNA e depois fraccionado com o uso de um kit de extração nuclear e citoplasmática (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Quantidades iguais de proteína dos extractos citoplasmáticos e nucleares (10 ug) foram submetidas a análise de imunotransf erência com anticorpos contra p21Cip1 (1: 300), p27Kip1 (1: 1500), PARP (diluição 1: 1000; BD, Franklin Lakes, New Jersey ), e a-tubulina (diluição 1: 1000; Sigma, St. Louis, MO)
Os ensaios de quinase
O ensaio de cinase in vitro foi realizada por EnzyChrom Kinase Assay Kit (MEDIBENA vida. Science Diagnostic Solutions, Viena, Áustria) de acordo com a fabrica ‘instruction. Resumidamente, definir-se 75 mistura reaccional ul contendo recombinante CDK5 /p25 (Invitrogen) como cinase, ATP e p53 recombinante (Millipore, Billerica, MA), p27Kip1 (Abcam, Cambridge, MA), p21Cip1 (Abcam, Cambridge, MA), Histione H1 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) e Arhi NTD (OriGene, Rockville, MD) como substrato no tampão de ensaio, respectivamente. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Aliquota mistura de 20 ul em 3 poços separados em placa de 96 cavidades, adicionar 40 ul de reagente de trabalho a cada poço de ensaio. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos e ler a intensidade da fluorescência (excitação = 530 nm e emissão = 590 nm). Calcular a actividade de quinase como a fórmula abaixo.
= δFluorescence (intensidade de fluorescência da amostra bem bem em branco) e do declive é o declive da curva padrão a ADP.
Os ensaios de luciferase do promotor
ensaios de actividade de luciferase foram realizados como se segue. As células foram semeadas em placas de 6 poços, ou co-transfectadas com ARNsi de controlo negativo e o seu vector de luciferase de Renilla (pRL-TK) serviu como um controlo interno. Depois de transfecção durante 16 h, as células foram divididas em placas de 12 poços, colhidos após 24 h e do vaga-lume e as actividades da luciferase Renilla foram medidas sequencialmente usando o kit de ensaio de duplo de luciferase (Promega, Madison, WI) e um luminómetro (BD Parmingene, Sparks, MD). WWP-Luc 9p21 promotor /WAF1 foi comprado de Addgene (16451, Cambridge, MA). Os resultados foram expressos como a actividade de luciferase após a normalização em relação com a actividade da luciferase de Renilla. unidades de luminescência relativa (RLU) foram normalizadas com concentrações de proteína em cada amostra, e os valores finais de RLU foram expressas como RLU por micro-grama de proteína por mililitro.
A apoptose bloqueio com caspase Inibição
HEY células foram tratadas durante 2 h com 20 uM de um inibidor da pan-caspase (Z-VAD-FMK, Promega, Madison, WI), ou um controlo negativo (Z-FA-FMK, Promega, Madison, WI), depois transfectados com um siRNA de controlo negativo ou um ARNsi CDK5 durante 24 h. As células foram então fixadas em etanol a 70%, coradas com iodeto de propídio, e sujeitas a análise por citometria de fluxo. A fracção de células sub-G1 é considerada a população celular por apoptose.
Proteína meia-vida ensaio
HEY células foram transfectadas com um ARNsi de controlo negativo ou um ARNsi CDK5 durante 24 h, lavou-se, e tratou-se com 5 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) durante os tempos indicados. As células foram colhidas e usar para os lisados de células completas preparados, os quais foram submetidos a análise de immunoblot com anticorpos contra p27Kip1 e desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH).
xenoenxertos de cancro do ovário humano em ratinhos nus
Experimentos com camundongos nu /nu foram revistos e aprovados pela Comissão Cuidado e Uso Institucional animal (IACUC ID: 00001052-RN00) (MD Anderson Cancer Center). 60 ratos nus fêmeas foram injectados por via intraperitoneal (i.p.) com células A2780 1×106. No dia 7 após a injecção, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente pelos seguintes grupos de tratamento (N = 10 murganhos por grupo para cada linha celular): 1) por via i.p. injecção com STP (duas vezes por semana, 100 ul /ratinho), 2) i.p. injecção com paclitaxel (uma vez por semana, 30ug /ratinho), 3) i.p. injecção com controle de siRNA-DOPC (duas vezes por semana), 4) i.p. injecção de, 5) i.p. CDK5 siRNA-DOPC (duas vezes por semana, 5 ug /murganho) injecção com uma combinação de ARNsi de controlo-DOPC (duas vezes por semana) com paclitaxel (uma vez por semana, 30 ug /ratinho), e 6) por via i.p. injecção com uma combinação de CDK5 siRNA-DOPC (duas vezes por semana, 5 ug /murganho) com paclitaxel (uma vez por semana, 30 ug /ratinho). Todos os ratinhos foram tratados durante 3 semanas e sacrificados por deslocamento cervical e o CO2 no final dos estudos. Todos os tumores foram recolhidos imediatamente após a morte e pesados.
A imuno-histoquímica
A, embebido em parafina de microsséries de tecido fixado em formalina (TMA) amostras de cancros do ovário primárias (215 amostras de pacientes) foi obtido a partir do MD Anderson Departamento de Patologia. Os protocolos para a manipulação de amostras de cancro do ovário embebidos em parafina e análise de dados do paciente foram aprovados pelos comitês de ética dos MDACC Institucionais Review Boards. Amostras e informações clínicas associadas foram coletados sob consentimentos informados por escrito, que foram assinados por cada paciente inscrito, de acordo com as diretrizes e aprovação dos MDACC Institucionais Review Boards ética. Para este estudo, a construção de microsséries de tecido foi realizado como anteriormente descrito [19]. lâminas tissue microarray foram submetidos a coloração imuno-histoquímica de acordo com o protocolo do fabricante (Biocare médica, Concord, CA, EUA). Seis micron secções foram cortadas a partir de cada TMA. A incubação a 60 ° C durante 20 min foi usado para restaurar reactividade antigénica seguido de duas incubações 20 min em xileno. Após as lâminas foram re-hidratadas, a recuperação de antigénio foi realizado em mM de tampão de citrato de sódio 6,5 (pH 6,0) durante 10 min. 3% de albumina de soro de bovino em solução salina 0,1 M tamponada com Tris foi utilizado para o bloqueio. As secções foram incubadas a 4 ° C durante a noite com o anticorpo anti-CDK5 (1: 100, Sigma HPA018977). anticorpos secundários anti-imunoglobulina de coelho foram então aplicado durante 1 h à temperatura ambiente, seguido por lavagem 3 vezes em PBS durante 10 min. DAB cromogénio foi adicionado durante 1 minuto, por lâmina, seguido de 3 lavagens adicionais em PBS durante 10 min e, em seguida, foi realizada a coloração com hematoxilina durante 1 min, por lâmina, seguido de 3 lavagens adicionais em PBS durante 10 min. Dois patologistas ginecológicas (J.L, R.M.) analisados de forma independente os slides imuno-histoquimicamente coradas para expressão CDK5.
A análise estatística
Os dados são representados como média +/- desvio padrão, a menos que especificado em contrário. A significância estatística foi determinada pelo teste de amostra independente de Mann-Whitney. A análise de sobrevida foi realizada pelo método de Kaplan-Meier. O nível mínimo de significância foi de P = 0,05.
Resultados
CDK5 knockdown inibe o crescimento celular e aumenta a sensibilidade paclitaxel em células de cancro do ovário
Enquanto knockdown de CDK5 com siRNA poderia alterar o crescimento celular e sensibilidade paclitaxel em linhas celulares de cancro do ovário com TP53 mutante (EFO21, EFO27, IGROV1, CAOV3, OAW42 e ES-2, SKOV3 e OC316) (Fig 1A), foram observados os efeitos mais marcados em duas linhas celulares de cancro do ovário com tipo de TP53 selvagem (HEY e A2780) (Fig 1A e 1B). Silenciamento CDK5 reduziu significativamente o IC50 do paclitaxel em Ei e células A2780 (Fig 1B). Forçado expressão de CDK5 crescimento aumentada e diminuição da sensibilidade ao paclitaxel em células HEY (S1 FIG). O roscovitina inibidor CDK também inibiu a atividade CDK5 e crescimento celular em células Hey como fez CDK5 siRNA em HEY e células A2780 (S1 FIG). Para além da inibição do crescimento em ensaios de curto prazo, knockdown de CDK5 a formação de colónias e inibiu significativamente a sensibilidade aumentada para paclitaxel em HEY e células A2780 (Fig 1B e Fig S2).
Ensaio de crescimento de células
(A) de curta duração. Ei e células A2780 em placas de 96 poços foram transfectadas com ARNsi de controlo reverso ou CDK5 siRNA (Dhamarcon) durante 24 h e tratou-se com 5 nM de paclitaxel (PAC) ou diluente (controlo) por um adicional de 48 h. Um ensaio de proliferação de célula de cristal violeta foi utilizado para medir o crescimento das células. (B) e ensaios clonogénicos de células de crescimento. HEY e células A2780 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou CDK5 ARNsi durante 24 h, e, em seguida, as células foram tratadas com diluente (controlo) ou de 3 nM de paclitaxel (Pac) durante 14 dias (ensaio clonogénico) ou as células foram tratadas com várias concentrações de paclitaxel ( Pac) ou diluente (de controlo) durante um adicional de 48 h (ensaios de crescimento de células). Os IC50 do paclitaxel com ou sem tratamento CDK5 siRNA no Hey e células A2780 foram calculados em GraphPad.
CDK5 knockdown inibe a ativação do AKT
O phosphatidyinositol-3-quinase (PI3K ) cascata sobrevivência -Akt é pensada para ser associada com a sensibilidade a fármacos anti-cancerígenos. Para explorar o mecanismo pelo qual CDK5 silenciar o crescimento celular do cancro do ovário inibida e sensibilidade melhorada de paclitaxel, que primeiro examinado o efeito do knockdown CDK5 na activação de AKT Ser473 por detecção de fosforilação de AKT. Após o tratamento com CDK5 ou ARNsi de controlo, foi realizada análise de Western. Silenciamento CDK5 activação inibiu significativamente de AKT em 2 TP53 tipo selvagem (Figura 2), bem como em 4 de 8 linhas mutantes TP53 celulares de cancro do ovário (Fig 2). inibição siRNAs de activação AKT em 6 linhas de cancro do ovário correlaciona-se significativamente com a diminuição do crescimento celular e sensibilidade paclitaxel melhorada (figuras 1A e 2).
análise de Western para medir a inibição da fosforilação de AKT (Ser473), utilizando anti-p-específica anticorpo AKT. HEY células foram tratadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CDK5 durante 72 h. lisados celulares foi submetido a análise de immunoblot.
CDK5 knockdown aumenta a apoptose e G1 parada do ciclo celular na presença e ausência de paclitaxel
Para explorar os mecanismos adicionais pelos quais CDK5 silenciamento inibe selvagem tipo de crescimento de células de cancro do ovário e TP53 sensibilidade paclitaxel melhorada, examinámos o efeito do knockdown CDK5 com ou sem tratamento com paclitaxel sobre a indução de apoptose e do ciclo celular em prisão Ei células que é de tipo selvagem TP53. Após o tratamento com CDK5 ou ARNsi de controlo, análise citométrica de fluxo foi realizada. CDK5 silenciamento induzido a paragem em G1 e a morte celular por apoptose produzida com um aumento da fracção de células em sub-G1 (Figura 3A e 3B). CDK5 silenciamento também reforçada a apoptose induzida por paclitaxel (Figura 3B).
(A, B) Queda de p53 reduziu a apoptose induzida por CDK5 knockdown (A) e a paragem em G1 (B). HEY células foram transfectadas com ARNsi de controlo reverso ou CDK5 ARNsi durante 24 h e tratou-se com 5 nM de paclitaxel (PAC) ou diluente (de controlo) durante um adicional de 48 h, e depois do ciclo celular analisada por citometria de fluxo. Os dados apresentados são valores médios de três experiências independentes. (C) CDK5 knockdown aumentou a expressão da p21
Cip1, p53 e p27
KIP1. HEY células foram tratadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CDK5 durante 24 h e, em seguida, com paclitaxel (3 nM) ou diluente durante 48 h. A análise de imunotransferência foi realizada com anticorpos contra p21
Cip1, p53 e p27
Kip. (D) Queda da expressão de p53 reduziu-CDK5 siARN induzida a inibição do crescimento e reduziu o aumento da sensibilidade de paclitaxel. As células foram co-transfectadas com ARNsi CDK5 e p53 ARNsi durante 24 h, e tratada com paclitaxel (PAC) ou diluente. A proliferação das células foi medida com um ensaio de proliferação de célula de cristal violeta. (E, F) Queda de apoptose de p53 induzida por CDK5 reduzida knockdown (E) e a paragem em G1 (F). HEY células foram tratadas como em (A) e do ciclo celular analisada por citometria de fluxo. Os dados apresentados são valores médios de três experiências independentes. (G) análise de Western confirmou o aumento da expressão do gene TP53, silenciando CDK5. HEY células foram tratadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CDK5 durante 24 h e, em seguida, com paclitaxel (3 nM) ou diluente durante 48 h. Células lisados foi submetido a immunoblot análise com p53, o anticorpo CDK5 e actina.
CDK5 knockdown induz TP53-dependente inibição do crescimento, apoptose e G1 prender
Para testar o efeito de silenciamento CDK5 sobre proteínas que regulam a paragem do ciclo celular e apoptose, foi realizada a análise de Western de TP53, p21Cip1 p27Kip1 e após o tratamento de células HEY com ARNsi de controlo e CDK5 siRNA na presença e ausência de paclitaxel. Knockdown de CDK5 aumentou significativamente TP53, p21
Cip1 e p27
KIP1 (Fig 3C). O tratamento com paclitaxel aumentou ainda mais os níveis destas três proteínas (Figura 3C). Além disso, o knockdown da inibição do crescimento induzida CDK5 e knockdown de TP53 reduzida silenciando a inibição do crescimento mediada por CDK5 na presença ou ausência de paclitaxel (Figura 3D). Em conformidade com isso, a CDK5 siARN aumentada célula G1 a paragem do ciclo celular de cancro e apoptose, no entanto knockdown de TP53 reduzida G1 paragem do ciclo celular induzida por siARN CDK5 na presença ou ausência de paclitaxel (Figura 3E e 3G) e diminuiu a CDK5 siRNA apoptose induzida (Fig 3F e 3G) em HEY células. Em células SKOV3, que são nulos TP53, knockdown de CDK5 aumentou a fracção de células em G2 /M, após o tratamento com paclitaxel (Figura S3). A expressão forçada de tipo selvagem TP53 em células SKOV3 aumentou a fração de células em G1 (S3 Fig).
CDK5 knockdown produz regulação positiva pós-translacional e translocação nuclear de TP53 e p27
KIP1 e induz TP53-dependentes transcrição da p21
Cip1
CDK5 knockdown no HEY células significativamente prolongada a meia-vida de TP53 e p27
proteínas KIP1 (Fig 4A). Silenciamento de CDK5 aumento de localização nuclear de TP53 e p27
proteínas KIP1 e níveis citoplasmáticos de p21
Cip1 (Fig 4B). O p27
nível de proteína KIP1 é principalmente regulada pós-transcricionalmente [20, 21]. CDK5 siARN diminuiu a fosforilação de p27Kip1 em Thr187 (Fig 4C), que é necessária para a ligação a ligase de ubiquitina e leva à degradação do proteassoma 26S. TP53 tem sido relatado para ser um substrato directo de CDK5 [22-24]. Utilizando proteína CDK5 purificado e um por fluorescência com base em ensaio de cinase in vitro, observou-se a fosforilação de TP53 e p27
KIP1 (figura 4D), usando uma proteína não relacionada, Arhi-DTN, como um controlo negativo e histona H1 como um controlo positivo (S4 Fig) [25, 26]. Porque p21
Cip1 pode ser regulada por TP53 ao nível da transcrição e CDK5 silenciamento também pode regular a expressão do gene TP53, testamos o efeito de CDK5 knockdown e TP53 knockdown em p21
atividade do promotor Cip1. Quando comparado com o ARNsi de controlo, CDK5 siARN aumentou significativamente a actividade do promotor de p21
Cip1, que foi abolido por co-transfecção com o gene TP53 siRNA (Figura 4E). Além disso, knockdown de p21
Cip1 e p27
KIP1 simultaneamente (Figura 4F) reduziu o aumento induzido por siARN CDK5 em apoptose (Figura 4G) e diminuiu o G1 paragem do ciclo celular induzida por siARN CDK5 na presença ou ausência de paclitaxel (Figura 4H) em células HEY. Assim, silenciamento de CDK5 produzida regulação positiva pós-tradução de TP53 e p27
KIP1 associada com a indução de transcrição TP53 dependente de p21
Cip1.
(A) A transfecção com CDK5 siRNA aumentou a meia-vida de p53 e p27
proteína KIP1. HEY células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CDK5 durante 24 h e depois tratou-se com 5 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) durante os intervalos indicados. Os lisados celulares foram sujeitos a análise de Western com os anticorpos indicados. (B) CDK5 siRNA aumentou a localização nuclear de p53 e p27
KIP1. HEY células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CDK5 durante 24 h e submetida a fraccionamento em componentes citoplasmáticos e nucleares. Citoplasmático (CE) e extractos nucleares (NE) foram analisados por imunotransf erência. (C) CDK5 siARN diminuiu a fosforilação de p27Kip1 no T187. A análise de imunotransferência de células foi realizada com anticorpos contra p27Kip1 fosforilada e total. (D) CDK5 fosforilação de TP53 e p27
Kip reforçada. A fluorescência com base em ensaio de cinase in vitro foi utilizada para avaliar a interacção de CDK5 com TP53 e p27
KIP1. (E) CDK5 siRNA transcricionalmente regulada a expressão da p21
Cip1. HEY células foram transfectadas com sozinho ou em combinação com ARNsi TP53 e um ensaio de repórter de luciferase CDK5 siARN foi usada para medir a proteína p21
Cip1 actividade do promotor. (F) CDK5, p21
Cip1 e p27
KIP1 knockdown diminuiu a expressão de CDK5, p21
Cip1 e p27
KIP1. HEY células foram tratadas com ARNsi de controlo ou CDK5 e /ou p21 mais siARN p27 durante 48 h e, em seguida, com paclitaxel (6 nM) ou diluente durante 24 h. A análise de imunotransferência foi realizada com os anticorpos indicados. (G, H) Queda de p21and p27 reduziu a apoptose induzida por CDK5 knockdown (G) e a paragem em G1 (H). HEY células foram tratadas como em (F) e do ciclo celular analisada por citometria de fluxo após a transfecção siRNA. SubG1 células foram consideradas células apoptóticas. Os dados apresentados são valores médios de três experiências independentes.
CDK5 knockdown-induz a apoptose que depende da activação de caspase-3 e está associada com Bcl-2 downregulation
Para elucidar o mecanismo através que CDK5 knockdown apoptose induzida, foi perguntado se knockdown CDK5 e tratamento paclitaxel activado caspase-3. análise de Western mostrou que CDK5 knockdown pode induzir a activação de caspase-3 e esta foi adicionalmente aumentada por tratamento com paclitaxel (Figura 5A). Z-VAD-FMK, um inibidor da pan-caspase, bloqueou a apoptose em células transfectadas CDK5 siRNA (Fig 5B). Consequentemente, a morte celular por apoptose induzida por CDK5 silenciamento era dependente da caspase. Bcl-2 é um inibidor importante da apoptose. silenciamento CDK5 foi encontrada para diminuir o nível de expressão de Bcl-2 de ARNm por qRT-PCR (Figura 5C), o que pode ser responsável pela regulação positiva do p27Kip1, como relatado anteriormente [1]. A combinação de CDK5 siARN e paclitaxel mostrou uma maior inibição de mRNA a Bcl-2 do que CDK5 siARN sozinho.
(A) CDK5 knockdown induz a activação da caspase-3 na presença e ausência de paclitaxel. HEY células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CDK5 durante 24 h, tratada com paclitaxel (3 nM) ou diluente durante 48 horas, lisadas e a proteína total analisados por imunotransf erência utilizando anticorpos contra a caspase-3 activado e GAPDH. (B) Um inibidor da pan-caspase bloqueou a apoptose induzida CDK5-knockdown. HEY células foram pré-tratadas durante 2 h com 20 uM de um inibidor da pan-caspase (Z-VAD-FMK), ou um controlo negativo (Z-FA-FMK), seguido por tratamento durante 24 h com ou sem paclitaxel (3 nM). As células foram então fixadas em etanol a 70%, coradas com iodeto de propídio, e submetido a análise do ciclo celular por citometria de fluxo. A população de células sub-G1 foi considerado apoptótica e expressa como uma percentagem da população de células inteiras. (C) CDK5 knockdown diminuiu a expressão de ARNm de Bcl-2.