Abstract

erradicação de células tumorais Durable pela quimioterapia é desafiada pelo desenvolvimento de multirresistência (MDR) ea incapacidade de induzir a morte celular imunogênica. O objetivo deste trabalho foi investigar se MDR e morte celular imunogênica compartilhar uma via bioquímica comum, eventualmente passíveis de intervenção terapêutica. Descobrimos que a atividade da via do mevalonato, Ras e isoprenilação proteína RhoA, ras- e RhoA-jusante sinalização atividades da via, induzido por hipóxia activação Fator-1alfa foram significativamente maiores no MDR + comparação com células cancerosas humanas MDR, levando a um aumento da expressão da glicoproteína-P, e protecção contra a citotoxicidade induzida por doxorrubicina e morte celular imunogénica. O ácido zoledrônico, um aminobifosfonado potente alvo a via do mevalonato, interrompeu ras- e vias de sinalização a jusante RhoA-dependentes, revogada a expressão da glicoproteína-P hipóxia inducible factor-orientado 1alfa, e restaurado citotoxicidade induzida pela doxorrubicina e morte celular imunogênica em células MDR +. recuperação morte celular imunogénica foi documentada por a capacidade de fagocitar células dendríticas para as células MDR + tratados com ácido zoledrónico mais doxorubicina, e para recrutar citotóxicos anti-tumor de linfócitos T CD8 +. Estes dados indicam que as células MDR + ter uma via do mevalonato hiper-activo que pode ser segmentado com ácido zoledrónico para antagonizar a sua capacidade para resistir a citotoxicidade induzida por quimioterapia e evitar a morte celular imunogénica

citação:. Riganti C, Castella B, Kopecka J, Campia I, Coscia H, Pescarmona L, et ai. (2013) Ácido zoledrónico Restaura Doxorrubicina Chemosensitivity e morte celular imunogênica em multi-resistente células cancerosas humanas. PLoS ONE 8 (4): e60975. doi: 10.1371 /journal.pone.0060975

editor: Derya Unutmaz, Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Janeiro, 2013; Aceito: 01 de março de 2013; Publicação: 12 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Riganti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Associação Italiana para Cancer Research (AIRC, www.airc.it; MFAG 11475 para Chiara Riganti, IG 13119 para Massimo Massaia); Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa (www.miur.it; PRIN 2010-2011 para Massimo Massaia, FIRB 2012 para Chiara Riganti); Fondazione Internazionale Ricerche Medicina Sperimentale (www.cerms.it, a Amália Bosia, Massimo Massaia); Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 para Chiara Riganti, Amalia Bosia; Progetto Immonc para Massimo Massaia). Joanna Kopecka é o destinatário de uma bolsa “Mario e Valeria Rindi” da Fundação italiana para Pesquisa do Câncer (FIRC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O mevalonato (MeV) é via uma cascata metabólica altamente conservada que produz esteróis, tais como colesterol e isoprenóides, tais como pirofosfato de farnesilo (FPP) e pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). Estes últimos são necessários para a actividade e a isoprenilação de proteínas G pequenas tais como Ras e Rho, que controlam a proliferação celular, e angiogénese pode ser notada citoesqueleto [1].

A sobre-expressão de enzimas da via MeV tem sido correlacionada com um mau resultado clínico em vários cancros humanos [2], [3]. os níveis de colesterol intracelular podem modular a resistência a uma variedade de fármacos anti-cancerígenos, dentro de um fenótipo funcional denominado multirresistência (MDR), que pode ser constitutiva ou induzida depois da exposição a ciclos repetidos de quimioterapia não erradicar [4]. As membranas plasmáticas de células MDR + tumorais são particularmente ricas em colesterol que facilita a actividade da P-glicoproteína (PGP) [5], um transportador de membrana integral extrusão drogas de quimioterapia tais como antraciclinas, taxanos, alcalóides de vinca, epipodofilotoxinas, topotecano, e mitomicina C [4]. Outra marca de células MDR + tumorais é aumentada a isoprenilação e a actividade das proteínas G que são também depende da taxa da actividade da via Mev [6], [7].

Acumulando evidências indicam que o tumor bem sucedida e durável erradicação de células é dependente da capacidade das drogas de quimioterapia para matar as células de tumor de uma maneira que é detectável pelo sistema imunológico. A morte celular imunogénica termo (CDI) tem sido utilizado para descrever a capacidade de certas drogas, tais como doxorrubicina (Dox), para matar células tumorais e simultaneamente induzir respostas imunes antitumorais desencadeadas pelas células tumorais morrem [8]. eventos-chave moleculares em CID induzida por Dox são a libertação extracelular da proteína de alta mobilidade caixa de grupo 1 (HMGB1) e a translocação da superfície celular de calreticulina (CRT) a partir do retículo endoplasmático, onde se exerce funções de cálcio-sensores e acompanhante. Estes eventos desencadear fagocitose de células tumorais por células dendríticas (DC) e o subsequente recrutamento de DC mediada por outras subpopulações imunes com actividade anti-tumor [9], [10]. Interessantemente, as células MDR + são muitas vezes refractária a CID [11], indicando que as células tumorais pode produzir múltiplas estratégias para sobreviver e proliferar no hospedeiro tratado por quimioterapia.

O ácido zoledrónico (ZA) é um aminobifosfonado amplamente utilizado em clínicas de prevenir a reabsorção óssea e tratar a doença óssea em tumores sólidos, incluindo cancro da mama, da próstata, cancro do pulmão e mieloma múltiplo. ZA é um inibidor específico da sintetase de FPP na via do MEV e exerce efeitos pleiotrópicos nas células tumorais e não tumorais, tais como os osteoclastos, macrófagos, células endoteliais e células do sistema imune [12], [13]. Estes efeitos são devidos à privação intracelular de proteínas isoprenylated e /ou a acumulação de pirofosfato de isopentenilo que é explorado para activar células Vγ9Vδ2 T, um único subconjunto de células T não convencionais com funções de regulação e efectoras contra micróbios, forçado e células tumorais [14 ] – [16]

os dados anteriores demonstraram que ZA aumenta o efeito anti-proliferativo das Dox em células tumorais sensíveis à droga [17], [18] e os estudos clínicos foram iniciadas em pacientes com câncer de mama para. tirar proveito desta sinergia [19]. No entanto, é atualmente desconhecido se ZA tem qualquer impacto sobre MDR e /ou ICD nas células tumorais. O objetivo deste estudo foi duplo: 1) para investigar a actividade da via Mev e Ras /RhoA-jusante vias de sinalização em MDR e células MDR + tumorais; 2) para avaliar a relação, se qualquer, entre a citotoxicidade induzida por inibição ZA MeV via, induzida por Dox e CID susceptibilidade. Verificou-se que uma via Mev hiper-activo é responsável tanto pela quimioterapia e imuno-resistência; graças à inibição de sinais dependentes Mev-via, ZA restaurado citotoxicidade induzida por Dox e ICD em células MDR +.

Materiais e Métodos

Chemicals

soro fetal bovino (FBS ) e meio de cultura foram de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Utensílios de plástico para cultura de células era de Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). ZA foi um presente da Novartis (Basileia, Suíça). Os inibidores específicos da farnesil transferase de FTI-277, geranilgeranil transferase GGTI-286 e de RhoA quinase Y27632 foram adquiridos a partir de Calbiochem (San Diego, CA). reagentes de electroforese foram obtidos a partir de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). O teor de proteína de monocamadas de células e lisados ​​foi determinada com o kit BCA de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Salvo disposição em contrário, todos os outros reagentes foram adquiridos da Sigma Chemical Co.

As linhas celulares

Humano HT29 do cancro do cólon, A549 câncer de pulmão e câncer de mama MCF7 são Dox-sensível, tumor MDR linhas de células (ATCC, Rockville, MD). homólogos-resistentes Dox (HT29-DX, DX-A549 e MCF7-DX) foram gerados através da cultura de células parentais, na presença de concentrações crescentes de Dox para até 20 passagens [11], [20], [21]. Para o presente estudo, as células HT29-DX foram cultivadas em meio contendo 250 nmol /L Dox, células A549-dx em meio contendo 100 nmol /L Dox, células MCF7-dx em meio contendo 0,5 nmol /L, e representados modelos de adquiridos MDR. A linha celular HepG2 do hepatoma humano (ATCC) e as células cancerosas HP06 e HMM foram utilizados como modelos prototípicos de células com um fenótipo de MDR constitutiva e foram anteriormente descritos ([7], [11], [21]; em todas estas obras HMM As células foram denominadas células MM98). células HP06 primário (dom do Prof. Anna Sapino, do Departamento de Ciências Biomédicas e Oncologia da Universidade de Torino, Itália) foram provenientes da metástase peritoneal de um paciente do sexo feminino com um cancro da mama invasivo, enquanto as células HMM primários (Mesotelioma maligno Biologic Bank, Azienda Ospedaliera Nazionale, Alessandria, Itália) foram derivadas do derrame pleural de um paciente com diagnóstico histológico de mesotelioma maligno, após consentimento informado por escrito dos pacientes. O uso de HP06 células foi aprovado pelo Comitê de Bioética ( “Comitato de Bioetica d’Ateneo”), da Universidade de Torino, Itália; o uso de células HMM foi aprovado pelo Comitê de Bioética ( “Comitato Ético Interaziendale”) da “Azienda Ospedaliera Nazionale SS. Antonio e Biagio e Cesare Arrigo “de Alessandria, Itália. As células primárias foram usadas em passagens 2-4. Todas as culturas foram suplementadas com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de L-glutamina, e mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2.

intracelular Dox acumulação

conteúdo intracelular Dox foram detectados com um ensaio baseado fluorimétrico-como relatado [20] e expressas em mg /proteínas celulares nmol Dox de acordo com uma curva de calibração previamente preparada.

em tempo real em cadeia da polimerase reacção (RT-PCR)

o ARN total foi extraído e reversamente transcrito utilizando o Kit de Transcrição reversa QuantiTect (Qiagen, Hilden, Alemanha). RT-PCR foi realizada com QI ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). A mesma preparação de cDNA foi usada para a quantificação de

MDR1

gene, que codifica para a Pgp humana, e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), escolhido como um gene de arrumação. As sequências de

MDR1

iniciadores foram: 5′-TGCTGGAGCGGTTCTACG-3 ‘, 5′-ATAGGCAATGTTCTCAGCAATG-3’. As sequências dos iniciadores GAPDH foram: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘, 5′-CATGGTGGAATCATATTGGAA-3’. A quantificação relativa de cada amostra foi realizada comparando a

MDR1

produto de PCR com o produto GAPDH PCR com o Expression quantificação Software Gene Bio-Rad.

De novo

síntese de colesterol e isoprenóides

as células foram marcadas com 1 uCi /ml

3H-acetato de etilo (3600 mCi /mmol; Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) e a síntese do colesterol marcado radioactivamente, FPP e GGPP foi medido como descrito [22]. Os resultados foram expressos como proteínas celulares pmol /mg, de acordo com as curvas de calibração relativos.

Ras e RhoA isoprenilação ea atividade

Para detectar as RAS ou RhoA proteínas associadas à membrana isoprenylated ea não formas citosólicas isoprenylated, as células foram lisadas em tampão de MLB (125 mmol /L de Tris-HCl, 750 mmole /L de NaCl, 1% v /v de NP40, a 10% v /v de glicerol, 50 mmol /L de MgCl

2, 5 mmol /L de EDTA, 25 mmol /L, NaF, 1 mmol /L NAVO

4, 10 ug /ml de leupeptina, 10 ug /mL de pepstatina, 10 ug /ml de aprotinina, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo; pH 7,5) e centrifugado a 13 000 × g durante 10 min a 4 ° C. Uma alíquota de sobrenadante foi tomado para a transferência de Western de um total de Ras e RhoA, enquanto a parte restante foi centrifugado a 100 000 × g durante 1 h a 4 ° C; tanto o sobrenadante (extractos citossólicos) e o sedimento (fracções de membrana) foram solubilizados em tampão de Laemli (125 mmol /L de Tris, 4% w /v de SDS, 20% v /v de glicerol e 1% w /v β-mercaptoetanol) e submetido a transferência de Western, utilizando um anti-Ras (Millipore, Billerica, MA) e um anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) de anticorpo. Para avaliar a actividade do RAS e RhoA, a fracção ligada a GTP, tomada como um índice de G-proteínas activas [23] foi medida, utilizando um ensaio de pull-down (com a proteína de fusão Raf-1 com GST, esferas de agarose-conjugados, Millipore) e um ensaio ELISA (com o Kit ™ G-LISA RhoA Activation Assay Biochem, Cytoskeleton Inc., Denver, CO), respectivamente, como descrito anteriormente [22].

RhoA actividade quinase

RhoA actividade da cinase foi avaliada com o CycLex Rho cinase Assay Kit (CycLex Co., Nagano, no Japão) seguindo as instruções do fabricante [22].

análise Western blot

as células foram lisadas em MLB tampão, sonicada e centrifugada a 13 000 × g durante 10 min a 4 ° C. 10? G de lisados ​​celulares foram sujeitos a Western blotting e sondados com os anticorpos seguintes: anti fosfo- (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 (Millipore); anti-ERK 1/2 (Millipore); anti-hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α; BD Bioscience, San Jose, CA); anti-Pgp (Santa Cruz Biotechnology Inc.); anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.), seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Bio-Rad). As proteínas foram detectadas por quimioluminescência aumentada (PerkinElmer, Waltham, MA).

Para avaliar a fosforilação de HIF-1α, todo o ligado celular foi imunoprecipitado com um anticorpo anti-HIF-1α policlonal (Santa Cruz Biotechnology Inc.), então sondadas durante 1 h com um anticorpo anti-fosfo-serina conjugado com biotina (Sigma Chemical Co.) seguido por poliméricos estreptavidina-peroxidase de rábano conjugados (Sigma Chemical Co.).

actividade de transcrição HIF-1α

as proteínas nucleares foram extraídas utilizando o Kit de extracto nuclear (Activo motivo, Rixensart, Bélgica). A actividade de HIF-1 em 10 ug extractos nucleares foi avaliada com o transam ™ HIF-1 Factor de Transcrição Assay Kit (Activo Motif). Para cada conjunto de experiências, em branco (com água bidestilada), controle negativo (com oligonucleotídeo mutante) e ensaio de competição (usando 20 pmol do tipo oligonucleotídeo selvagem com extractos nucleares de células HMM cresceu em 3% O

2 para 24 h) foram incluídos. Em condições hipóxicas, a actividade de HIF-1 foi de 257,53 ± 3,77 mU /mg de prot; no ensaio de competição, a correspondente actividade de HIF-1 foi reduzido para 33,14 ± 1,39 mU /mg de prot (n = 5). Os dados foram expressos como absorvância mU /mg de proteínas celulares.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) experiências para medir a ligação de HIF-1α na “Hipoxia Responsive elemento” de

MDR1

promotor eram realizada como descrito noutro local [24].

Lactato desidrogenase (LDH) ensaio de actividade de Citotoxicidade

foi medida no meio extracelular e no lisado celular, como descrito [20]. Para medir a libertação extracelular de HMGB1, 20 uL do meio de cultura de células foram fervidas, resolvidas por SDS-PAGE e sonda com um anticorpo anti-HMGB1 (Sigma Chemical Co.). As membranas foram pré-coradas com vermelho Ponceau para verificar o carregamento igual de proteínas. A libertação de ATP foi medida em 100 uL de meio de cultura celular com o ATP Bioluminescent Assay Kit (FL-AA, Sigma Aldrich Co.), utilizando uma sinergia HT multi-Detecção leitor de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT). Os resultados foram expressos como nmol de ATP /ml, de acordo com a curva de titulação anteriormente definido.

Análise de superfície celular CRT

células foram incubadas durante 45 minutos (4 ° C) com um anti- anticorpo CRT (Affinity Bioreagents, Rockford, IL), como descrito em [11], e analisadas utilizando um sistema FACS Calibur (BD Biosciences). Para cada análise foram coletadas 100.000 eventos. A percentagem de células viáveis ​​CRT-fluorescente (iodeto de propídio-negativo) foi calculada com o software celular Quest (BD Biosciences). As experiências de controlo incluídos incubação das células com os anticorpos isotípicos não imunes, seguido pelo anticorpo secundário adequado. A citometria de fluxo resultados foram confirmados por ensaios de biotinilação [25], utilizando o kit de isolamento de proteínas de superfície celular da Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). A entrada de biotina em células foi excluído, verificando a ausência de proteínas citosólicas (GAPDH, actina) em extratos biotinilados (não mostrados).

células dendríticas (DCs) geração e

in vitro

fagocitose ensaio

DCs foram gerados a partir de amostras de sangue periférico obtidas de doadores saudáveis ​​gentilmente fornecidos pelo Banco de sangue local (Fondazione Strumia, Torino, Itália), conforme relatado anteriormente [11]. As células foram colhidas no dia 6 e confirmado como DCs imaturas por morfologia e imunofenotipagem.

MDR-HT29 e MDR + HT29-DX e HMM células foram verde-coradas com PKH2-FITC (Sigma Chemical Co.), lavada duas vezes e incubou-se com a uma razão de 1:01 durante 18 h a 37 ° C. Co-culturas foram então coradas durante 20 min a 4 ° C com anticorpo conjugado com APC-HLA-DR (Miltenyi Biotec, Tetrow, Alemanha) para marcar as DCs. Bicolor de citometria de fluxo foi realizada com um classificador de células de FACScan e o software CellQuest (Becton Dickinson). Pelo menos 10.000 eventos foram acumulados especificamente backgating na morfologia DC (região 1: FSC contra o SSC). fagocitose de células de tumor foi avaliada como a percentagem de células duplamente coradas com FITC (mais APC). As células tumorais não exprimem quantidades significativas de HLA-DR, e são excluídas da região 1 pela sua morfologia. Em cada conjunto de experiências, um ensaio de fagocitose foi realizada por DCs co-incubação e as células tumorais a 4 ° C, em vez de 37 ° C, e a percentagem de células duplamente coradas obtido após a incubação a 4 ° C foi subtraído dos valores observada a 37 ° C. A taxa de fagocitose foi expressa como um índice de fagocitose, calculado como relatado anteriormente [9].

Em ensaios baseados em microscopia de fluorescência, as células de tumor coradas de verde PKH2-FITC foram incubadas durante 6 h ou 24 h a 37 ° C com 1 × 10

5 DCs na proporção 01:01. Co-culturas foram cytospun a 1500 × g durante 5 min, para enxertos de vidro, fixadas com 4% w /v de paraformaldeído, lavadas e coradas com um anticorpo de ratinho policlonal anti-MHCII (Thermo Fisher Scientific Inc.). Após a lavagem, as amostras foram incubadas com um ratinho anti-IgG de anticorpo de cabra Alexa Fluor 350-conjuganted (Invitrogen) durante 1 h à temperatura ambiente, lavou-se, montadas com Gel de montagem aquoso de montagem e examinado sob um microscópio de fluorescência, tal como descrito acima.

estimulação de células T mediada por DC-T CD8 +

Após a fagocitose de células tumorais, as DCs foram lavadas e co-cultivadas com células T autólogas, isolado a partir de células CD14 por imunomagnética triagem com o Kit de isolamento celular Pan-T (Miltenyi Biotec). As células DC e T foram co-cultivadas durante 10 dias a uma razão de 1:05 em meio completo suplementado com IL-2 (10 U /mL). No dia 10, a expressão CD107 nas células T CD8 + foi determinada por citometria de fluxo para determinar a activação das células T citotóxicas específicos de tumores [26]. Pelo menos 100.000 eventos na barreira linfocitária foram adquiridos e analisados ​​por fluxo de duas cores citometria. morte de células tumorais induzida por células T CD8 + também foi quantificada por CFSE-rotulagem, a medição da percentagem de células HT29-DX duplo positivos para CFSE e iodeto de propídio como descrito anteriormente [14], [15].

Estatística análise

Todos os dados do texto e números são fornecidos como média ± SD. Os resultados foram analisados ​​por uma análise de uma via de variância (ANOVA) com

P Art 0,05 como o significado de corte. O coeficiente de r foi calculado com Fig.P software (Fig.P Software Inc., Hamilton, Canadá).

Resultados

Correlação entre

MDR1

expressão e atividade da via Mev

retenção intracelular Dox,

MDR1

níveis de mRNA e síntese de colesterol foram medidos como marcadores de atividade Pgp, expressão Pgp e atividade via do MEV em HT29, A549, células MCF-7 (MDR células) , HT29-DX, DX-A549, células MCF7-DX (MDR adquirida + células) e células HepG2, HP06, células constitutivas HMM (células MDR +), respectivamente. Ambas as células MDR + adquiridos e retidos constitutivos significativamente menos Dox (Figura 1A) e apresentaram maior

MDR1

níveis de ARNm (Figura 1-B) do que as células MDR. síntese de colesterol foi também significativamente maior em MDR + que em células MDR (Figura 1C). As diferenças entre as células MDR + adquiridos e constitutivos não foram estatisticamente significativos, embora estes últimos tendem a reter menos Dox, para expressar mais

MDR1

níveis de ARNm, e para gerar mais colesterol do que o anterior. Observou-se uma correlação muito significativa entre a taxa de síntese de colesterol e

MDR1

níveis de mRNA (Figura 1D).

A. doxorrubicina intracelular (Dox) concentrações em MDR células (HT29, A549 e MCF7), nos + homólogos MDR adquiridos correspondentes (células HT29-DX, células A549-DX, MCF7-DX), e constitutivos MDR + células (HepG2, HP06, HMM ). Significativamente as concentrações mais baixas foram detectadas em células com MDR adquirida

vs

células MDR (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,001; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,001), e em células com constitutiva MDR

vs MDR células

(valor da doxorrubicina intracelular significa em HepG2 /HP06 /HMM

vs

valor no HT29 /A549 /MCF7 dizer: ° p 0,001). B.

MDR1

mRNA expressão. Significativas

níveis de MDR1

foram observadas em células com MDR adquirida

vs

MDR células mais elevadas (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,002; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,001), e em células com constitutiva MDR

vs MDR células

(valor da média ; 0,001) ° p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,002; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,002), e em células com constitutiva MDR

vs

MDR células (valor médio da síntese de colesterol no HepG2 /HP06 /HMM vs valor médio em HepG2 /HP06 /HMM: ° p 0,001). D. correlação direta entre a taxa de síntese de colesterol e os níveis de

MDR1

em linhas celulares individuais de expressão de (R

2 = 0,95). Para os painéis A, bares B, e C representam a média ± SD de 3 ensaios independentes.

ZA inibe vias de sinalização Mev-dependentes em MDR + células

ZA foi usado para investigar o efeito de inibição da via do MEV em células HT29, HT29-DX e HMM que foram selecionados como modelos prototípicos de MDR, adquirida MDR + e as células MDR + tumorais constitutivos, respectivamente.

ZA induziu uma dose (Figura 2A, painel esquerdo ) e dependente do tempo (Figura 2A, painel da direita) diminuição da síntese do colesterol com uma inibição significativa a 1 mol /L, que foi mais evidente em células MDR + HT29-DX e HMM que MDR HT29 células (Figura 2A). Um pmol /L também é semelhante à concentração de soro observados em pacientes que recebem ZA em doses clinicamente aprovado [27], [28] e, por conseguinte, esta concentração foi usada ao longo do estudo.

MDR HT29, e MDR + HT29 -Dx e HMM células foram cultivadas sem (CTRL) ou com ácido zoledrónico (ZA). Para os painéis B-E, ZA (1 pmol /L) foi utilizado para 48 h, FTI-277 (10 umol /L, o FTI), GGTI-286 (10 umol /L, GGTI), Y27632 (10 umol /L, Y276) durante 24 h. A.

Painel esquerdo

: inibição dependente da dose da síntese de colesterol em células tratadas com 0,01-10 umol /L ZA durante 24 h. A inibição foi estatisticamente significativa em HT29 (* p 0,001), HT29-DX (° P 0,01) células d HMM (

◊p 0,005)

vs valores

linha de base (0).

Painel direito

: inibição dependente do tempo da síntese do colesterol em células tratadas com 1 umol /L ZA durante 24-72 h. A inibição foi estatisticamente significativa em HT29 (* p 0,001), HT29-DX (° P 0,0001) e células HMM (

◊p 0,001)

vs valores

linha de base (0). Para ambos os painéis: HT29-dx /HMM

vs

HT29: * p 0,001. quantidades B. MDR + células sintetizadas superiores de FPP (

esquerdo do painel

) e GGPP (

painel direito

) do MDR células (* p 0,005). ZA reduzido significativamente a síntese FPP

vs células

não tratados (Ctrl) (HT29: * p 0,001; HT29-dx: ° p 0,002; HMM:

◊p 0,001) e síntese GGPP

vs células

não tratados (Ctrl) (HT29: * p 0,02; HT29-dx: ° p 0,001; HMM:

◊p 0,005). células C. MDR + exibida uma distribuição desequilibrada entre isoprenylated ligada à membrana (

M

) e citosólica não isoprenylated (

C

) Ras (

painel esquerdo

) e RhoA (

painel

direita) em comparação com MDR células. tratamento ZA aumentou a quantidade de citosólica Ras e RhoA.

T

: quantidade de Ras e RhoA em lisados ​​de células inteiras. D. ZA diminuição da atividade Ras, medido como quantidade Ras-GTP, e fosfo- (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 montante. dados de GAPDH são mostrados para confirmar carga de proteína equivalente. células de E. MDR + tinham quantidades significativamente superiores de RhoA-GTP (

barras abertas) e RhoA-quinase (

barras tracejadas) do que as células MDR (* p 0,005); ZA diminuiu tanto RhoA-GTP e RhoA quinase

vs células

não tratados (Ctrl) (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:

◊p 0,02). Os resultados mostrados nos painéis C e D são representativos de 3 experiências. Nos painéis A, B e E os resultados representam a média ± desvio padrão de 3 experiências.

De acordo com a via do MEV hiper-ativa, as células HMM MDR + HT29-dx e apresentaram maior FPP (Figura 2B , painel esquerdo) e GGPP (Figura 2B, painel da direita) síntese de MDR-HT29 células. Ambas as células MDR e MDR + tinham quantidades detectáveis ​​de isoprenylated Ras e não isoprenylated, citosólica Ras, embora o primeiro foi predominante em MDR células em grande parte +, como consequência do aumento da oferta FPP favorecendo Ras isoprenilação Figura 2C, painel esquerdo, ligada à membrana ( ). Membrane-bound e citosólica RhoA também mostrou um padrão semelhante em MDR + HT29-dx e HMM

vs

MDR-HT29 células como consequência do aumento da produção GGPP e RhoA isoprenilação (Figura 2C, painel da direita).

O excesso de Ras e RhoA resultou num aumento da actividade das correspondentes vias de sinalização a jusante ligada à membrana: os níveis intracelulares de Ras (Figura 2D) ligada a GTP, um marcador da activação de Ras, e ERK1 /2 fosforilação (Figura 2D ), bem como as quantidades de RhoA ligada a GTP (Figura 2E) e a actividade de quinase RhoA (Figura 2E) foram maiores no MDR + HT29-DX e HMM células de MDR-HT29 células.

tratamento ZA revogada as diferenças entre TB-MR + e células MDR. Ao inibir FPP e síntese GGPP (Figura 2B), ZA diminuição nos teores de RAS e RhoA (Figura 2C), intracelular de Ras-GTP e RhoA-GTP ligado à membrana, e a actividade das suas vias de sinalização a jusante (Figura 2D-E ). Estes efeitos foram mais evidentes em células MDR + HT29-DX e HMM de MDR-HT29 células de acordo com a sua actividade via do MEV.

ZA diminui expressão Pgp ao reduzir a ativação HIF-1α via Ras /ERK1 /2 e RhoA /Rho-quinase downregulation

HIF-1α, um regulador mestre de vários genes, incluindo

MDR1

[29], pode tornar-se constitutivamente activado, mesmo sob condições de normóxia sobre fosforilação da serina por RhoA quinase [30 ] e MAP quinases [31]. Fosforilados (pHIF-1α) e não-fosforilados de HIF-1α não eram detectáveis ​​por mancha de Western em células MDR HT29, ao passo que tanto pHIF-1α e HIF-1α foram expressos em células HMM (Figura 3A) + MDR HT29-DX e. HIF-1α foi transcricionalmente activos em células MDR +, como se mostra pelos valores significativamente mais elevados de HIF-1 nuclear ligada à sua sequência alvo de ADN específica (Figura 3B). ZA não teve efeito sobre MDR células, enquanto que reduziu a quantidade de pHIF-1α e diminuiu os níveis totais de HIF-1α e atividade no MDR + células (Figura 3A-B).

A. Detecção de fosforilada (pHIF-1α) e HIF-1α total MDR-HT29, e as células MDR + HT29-DX e HMM após 48 horas de incubação, sem (CTRL) ou com 1 mol /L ZA (ZA). B. actividade de HIF-1 foi mais elevada (* p 0,001) em células MDR + HT29-DX e HMM que as células HT29. Após o tratamento ZA (como relatado em A), uma diminuição significativa da actividade de HIF-1 foi observada em HT29-DX (° P 0,001) e células HMM (

◊p 0,001). C. cromatina imunoprecipitação de HIF-1α em

MDR1

promotor em células MDR e MDR +, tratados como relatado em um.

pro MDR1

: produto da PCR de amostras imunoprecipitadas.

Input

: produto da PCR de amostras não imunoprecipitados (ADN genómico).

Ab não há

: amostras incubadas na ausência de anticorpo anti-HIF 1α. “-“: Em branco. D. Detecção de transferência de Western de Pgp em células tratadas como descrito em AE doxorrubicina intracelular foi medido spectrofluorimetrically: significativamente as concentrações mais baixas foram detectadas em HT29-DX e HMM

vs células HT29

(* p 0,002), as concentrações significativamente mais elevados em células tratadas com ZA

vs homólogos

não tratados (Ctrl) (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:

◊p 0,02). Os resultados mostrados nos painéis A, C e D são representativos de 3 experiências. Para os painéis B e E as barras representam a média ± SD de 3 ensaios independentes.

HIF-1α foi constitutivamente vinculada ao elemento hipóxia resposta dos

MDR1

promotor no MDR células + HT29-DX e células HMM, mas não em células HT29 MDR (Figura 3C). Isso explica por que a expressão da proteína de Pgp foi apenas detectável em células MDR + (Figura 3D) e por estas células mostraram significativamente menor do que a retenção Dox MDR células (Figura 3E).

Tratamento

ZA eficazmente revogada HIF-1α liga�o ao ao

MDR1

promotor (Figura 3C) e a expressão de Pgp (Figura 3D), e aumentou significativamente os níveis de Dox intracelulares em células MDR + HT29-DX e HMM que se tornaram comparáveis ​​aos observados em células MDR HT29 ( Figura 3E). retenção intracelular Dox em células MDR + foi significativamente aumentada quando ZA foi administrada antes Dox, mas nem

vice-versa

, nem quando os dois fármacos foram usados ​​em conjunto (Figura S1).

Para fornecer mais evidências que a Pgp induzida ZA regulação negativa em células MDR + era dependente da supressão pHIF-1α através RhoA inibição de ERK1 /2 e cinase, experiências lado a lado foi realizada na presença de inibidores específicos de ERK1 /2 quinases (PD98059) , RhoA quinase (Y27632) e HIF-1 (CA-1). Em células MDR + HMM estes inibidores mostraram os mesmos efeitos de ZA em termos de pHIF-1α níveis (Figura 4A), HIF-1 actividade de transcrição (Figura 4B), a expressão de Pgp (Figura 4C), e a retenção de Dox (Figura 4D).

A. Phospho (Ser) -HIF-1α (pHIF-1α) e expressão total de HIF-1α em células HMM não tratada (CTRL) ou tratados durante 24 h a 10 pmol /L com a /2 PD98059 inibidor de cinase de ERK1 (PD), RhoA inibidor de cinase Y27632 (Y27), inibidor de HIF-1α YC-1 (YC), e 1 mmol /L durante 48 h ZA. dados GAPDH são mostrados para confirmar equivalente por carga de proteína lane. B. actividade de HIF-1 em células HMM não tratada (CTRL) ou tratadas como descrito no Painel A. Todas as diferenças entre

vs células não tratadas são tratados estatisticamente significativos (* p 0,01).