Abstract

Fundo

Nós recentemente publicado a detecção raro de leucemia murina xenotr�ico vírus-relacionada vírus (XMRV) (1/105) no cancro da próstata (PCA) de tecidos de pacientes na Europa do Norte por PCR. A discussão controversa sobre o vírus ser detectado no tecido APC, amostras de sangue de pacientes que sofrem de síndrome de fadiga crónica (CFS), bem como a partir de um número significativo de controlos saudáveis ​​nos levou a aprofundar nossos estudos sobre a detecção de infecção por XMRV aplicação de diferentes métodos de detecção (PCR, co-cultivo e imuno-histoquímica [IHC]).

Metodologia /principais conclusões

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de 92 PCA e 7 controles saudáveis ​​foram isolados, PHA ativado e co-cultivadas com LNCaP células de até 8 semanas. O sobrenadante destas células foi aplicado a uma linha de células relatora, Derse-IGFP. Além disso, as PBMC e as células LNCaP co-cultivadas foram testadas para a presença de XMRV por PCR, bem como análise de Western Blot. Enquanto todas as amplificações de PCR e análises de Western Blot foram negativos quanto a sinais de infecção XMRV, células Derse-IGFP exibida células positivas para GFP isolado em três casos. Em todos os três casos, a presença de XMRV não pôde ser confirmada por tecnologia de PCR. Além disso, foi realizada XMRV IHC específico em secções de tecido PCA. Secções inteiras de tecido (n = 20), bem como micromatrizes de tecidos (TMA), incluindo 50 a hiperplasia benigna da próstata (HBP), 50 de baixo grau e 50 secções PCA alto grau e TMA, incluindo cancro da mama, cancro do cólon e os tecidos normais foram coradas com dois anti-soros específicos XMRV. a expressão da proteína XMRV não foi detectada em todas as seções de câncer incluídos. Um tecido de BPH exibida a expressão da proteína específica XMRV em células basais isoladas aleatórios.

Conclusão

Não foi possível detectar de forma conclusiva XMRV no sangue de pacientes com PCA ou a partir de controles saudáveis ​​e não há nenhuma evidência conclusiva da expressão da proteína XMRV no PCA, seções cancro da mama e cancro do cólon de tecidos testada por coloração IHC

Citation:. Stieler K, Schindler S, Schlomm T, Hohn O, Bannert N, Simon R, et al. (2011) No Detecção de XMRV em amostras de sangue e cortes de tecido de próstata pacientes com câncer na Europa do Norte. PLoS ONE 6 (10): e25592. doi: 10.1371 /journal.pone.0025592

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de junho de 2011; Aceito: 06 de setembro de 2011; Publicação: 12 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Stieler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Atualmente, a detecção de vírus Xenotropic murino leucemia relacionada retrovírus (XMRV) em espécimes biológicos humanos é controversa discutido variando de XMRV sendo associada a dois principais doenças humanas, síndrome da fadiga crônica (SFC) [1], [2] e cancro da próstata (PCA) [3], [4] a ser um dos homens gerado contaminante laboratório devido à passaging xenotransplante através de camundongos [5] – [18]

em 2006, XMRV foi identificado no tecido da próstata de pacientes com câncer de próstata familiarizado (PCA) portadores de uma mutação homozigótica no. gene RNaseL (R462Q) [19]. A associação entre o XMRV e PCA foi severamente reforçada por estudos que demonstram a expressão da proteína XMRV, bem como a presença de sequências XMRV em até 26% de todos os casos de PCA [3], [4], [20]. a expressão da proteína XMRV foi predominantemente visto no epitélio maligno sugerindo um papel mais direto na tumorigênese. No entanto, existem vários estudos apenas raramente ou completamente não forem detectados XMRV em amostras de cancro da próstata usando PCR ou métodos de IHC [3], [4], [9], [21] – [26]. Nós recentemente detectado XMRV em baixa frequência (1%) em amostras esporádicas PCA do Norte da Europa utilizando métodos de amplificação de PCR e RNA isolado a partir de amostras de tecido fresco congelado [27]. A expressão da proteína XMRV, bem como a presença de sequências XMRV em até 26% de todas as amostras de PCA analisadas foi demonstrada em 2009 por aplicação de imuno-histoquímica (IHQ) de secções integrais de montagem de PCA com um anti-soro específico anti-XMRV [4], [20 ]. No entanto, um relatório recente usando Rauscher MLV anti-soros gag que também reconhece a proteína XMRV mordaça, não confirmou estes resultados [24]. O estudo de Schlaberg et al. levou-nos a revisitar a prevalência de XMRV em amostras de PCA por IHC desde infecções focais vistos por IHC pode ser desperdiçada na análise de PCR. Além disso, podemos avaliar a presença da expressão da proteína XMRV nas secções de outros tumores malignos, bem como o tecido normal por IHQ. Ao usar o anti-soro anti-XMRV recentemente publicado [4], bem como um anti-soro específico XMRV gag não fomos capazes de detectar coloração específica XMRV gag de células no PCA ou outro tecido canceroso. No entanto, uma hiperplasia benigna da próstata (HBP) seção exibida claramente células coradas positivas utilizando anti-soro XMRV K121 gag.

Em 2009 XMRV foi identificado em até 68% de PBMC (células mononucleares do sangue periférico) amostras de pacientes com a síndrome da fadiga crônica e 3-4% da coorte de controle mostrou sinais de infecção XMRV [2]. dados de PCR foram fortalecidos por células dependente, bem como a transmissão livre de células do vírus a partir de amostras de sangue de pacientes com SFC às células indicadoras. No entanto, vários estudos subseqüentes por outros laboratórios não conseguiram confirmar os dados PCR e sem experimentos de transmissão de vírus foram reproduzidos até à data [6], [9], [10], [11], [13], [15], [17 ], [18], [28], [29], [30], [31]. Recentemente, amostras de sangue de pacientes com SFC reportados anteriormente para conter sequências XMRV foram novamente testados, no entanto foram identificados como XMRV negativo por estratégias de amplificação por PCR e métodos serológicos [12], [32].

No início deste ano, embora este estudo estava em progresso, várias publicações dirigida o risco de contaminações por vestígios de ADN de ratinho (secções de parafina, linhas de células ou outras fontes) [7], [13], [15] e o risco de produtos de PCR positivos falsos por alguns kits de amplificação comerciais [17], [33]. Além disso, matiz e colegas argumentam que, devido à falta de variabilidade da sequência de fragmentos de genes XMRV no paciente isolados em relação à variabilidade de sequências identificadas em uma linha de células positiva XMRV 22Rv1, XMRV pode ser um contaminante de laboratório, em vez de um verdadeiro vírus humano exógeno [11 ]. Uma forte indicação de que o XMRV é um vírus em circulação na população humana é a identificação de locais de integração virai no genoma do hospedeiro [34]. No entanto, descobertas mais recentes demonstram que dois locais de integração publicados anteriormente são idênticos aos locais de integração XMRV em uma linha de in vitro de células infectadas DU145 [35]. Além disso, Paprotka e colegas fornecem evidência de que o XMRV derivada de rato endógenas dois pré-vírus que sofreram recombinação retroviral em cultura de células sugerindo assim que todas as sequências XMRV relatados até à data se provavelmente originam a partir deste evento de cultura de células [14]. No estudo apresentado nos dirigimos a detecção de sequências de MLV e XMRV relacionados em células de sangue periférico de pacientes com cancro da próstata e controlos saudáveis ​​motivados pela detecção de XMRV em células de sangue de 3-4% dos controles saudáveis ​​[2] e a nossa hipótese de que o XMRV replicação pode ser activado devido a imunossupressão que acompanha APC e, subsequentemente, detectável no sangue de pacientes. Um total de 100 amostras de sangue foram incluídos em nosso estudo. As PBMCs foram isoladas, estimuladas e em seguida utilizada para isolamento de ADN genómico ou cocultivadas experiências seguintes protocolos publicados [1], [2]. Além disso, os extractos de proteína a partir de PBMC activadas foram gerados e analisados ​​para a expressão da proteína XMRV. Mostra-se que as PBMCs, em geral, pode ser in vitro infectadas com XMRV, resultando em células infectadas 1-2%, o que pode ser facilmente monitorizada por PCR ou a expressão da proteína, assim confirmando os resultados de análises [10], recentemente publicado. Apesar de genomas virais são altamente editada devido à restrição APOBEC, sobrenadante de XMRV infectados PBMC eficiente infecta uma linha celular repórter, Derse-IGFP. Esta linha celular (gerado por Vineet N. KewalRamani, National Câncer Institute, Frederick, EUA) expressa um repórter GFP, que é activado por expressão de transcriptase reversa. Embora a sensibilidade de todas as técnicas utilizadas em nosso estudo é bastante elevado, sem sequências XMRV ou proteína específica XMRV expressão foi detectada em PBMC activadas. Curiosamente, foram detectados no sobrenadante de 3/67 PBMC activados e 2/67 experimentos cocultivo das PBMC com células LNCaP, a atividade RT resultando em células Derse-IGFP GFP positivas, no entanto, não fomos capazes de forma inequívoca prova de que estes PBMC foram infectadas com o XMRV, não se pode excluir outras fontes de actividade de RT.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Estado de Hamburgo Federal (sem . OB-052-04).

população do estudo e coleta de amostras. População do estudo e coleta de amostras

As amostras de sangue de 92 pacientes com câncer de próstata (44-77 idade) foram colhidas um dia antes prostatectomia radical. Os dados clínicos encontram-se resumidos na Tabela 1. Além disso, as amostras de sangue de 7 homens (com idades entre 30-44) sem qualquer evidência de APC foram incluídos no estudo. Todos os pacientes assinaram termo de consentimento para o uso científico de amostras de sangue; EDTA-sangue de pacientes e controlos saudáveis ​​foram processadas por centrifugação em gradiente de densidade usando Ficoll (Biocoll, Biochrom L6715). células mononucleares do sangue primários (PBMC) foram separadas e cultivadas como descrito abaixo.

As linhas celulares

A linha de células de cancro da próstata humano LNCaP (ATCC # CRL-1740), LNCaP DERSE- IGFP (gentilmente fornecida por Vineet N. KewalRamani, National câncer Institute, Frederick, EUA) e a linha celular humana positiva XMRV 22Rv1 cancro da próstata (ATCC # CRL-2505) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de FCS, 5 % de penicilina /estreptomicina e L-glutamina. células LNCaP cronicamente infectadas (XMRV) foram gerados por transfecção de ADN proviral de XMRV VP62, tal como publicado anteriormente [36] e mantida durante várias semanas. As PBMC foram isoladas a partir de 10 ml de sangue EDTA e cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) semelhante às linhas de células de cancro da próstata estabelecida, mas, adicionalmente, suplementada com PHA (5 ug /ml, Thermo Fisher Scientific) e rhIL-2 (180 UI /ml, R D Systems).

experimentos cocultivo

suspensão de células de 1 ml contendo 1 × 10

6-3 × 10

6 PBMC activados por 7 dias foi adicionado a 2 × 10

5 LNCaP mantidas em meio RPMI contendo 2 ml de 8 ug /ml de polibreno em placas de 6 poços. As placas foram centrifugadas durante 30 min a 37 ° C e 800 × g. As PBMC foram removidas 24 horas depois. As células LNCaP foram cultivadas durante 6-8 semanas. As células foram divididas ao atingir 100% de confluência. Os sobrenadantes foram tomados depois de 6 e 8 semanas e aplicado a células Derse-IGFP (ver abaixo).

Para os controlos positivos PBMC humanas foram infectadas com o sobrenadante contendo o XMRV a partir de células LNCaP XMRV. quantidade indicada de vírus contendo o sobrenadante das células produtoras de XMRV (pelo menos 80% de confluência) foi esterilizado por filtração e adicionado a 3 × 10

6 PBMC pré-activadas por dois dias. As placas foram centrifugadas durante 30 min a 37 ° C e 800 × g. XMRV contendo sobrenadante foi removido no dia seguinte por células sedimentação a 200 x g, lavando-os com 10 ml de PBS (Gibco) e disseminar depois de um passo de centrifugação adicional de uma nova placa de 6 cavidades em 2 RPMI ml contendo PHA e rhIL-2. PBMC foram cultivadas durante 7 dias antes de analisar sobrenadante, co-cultivo, de ácidos nucleicos e extração de proteínas.

Infecção usando a replicação competente XMRV

XMRV VP62 proviral DNA foi transfectado em células LNCaP para produzir vírus contendo sobrenadante tal como descrito anteriormente [34], [36].

PCR

O ADN genómico foi extraído a partir de PBMC utilizando mini-kit de Qiagen QIAamp e armazenado a 4 ° C. As concentrações de ácidos nucleicos foram determinadas utilizando um Nanodrop (Peqlab). Diferentes PCR aninhados segmentação sequências gag e env foram realizadas tal como foi recentemente publicado [1], [3], [19], utilizando ADN molde 650 ng por reacção. Gag fora de primer: 419F 5’ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3 ‘, 5′-1154R GCCGCCTCTTCTTCATTGTTCTC-3′; dentro de primer: NP116F 5′-CATGGGACAGACCGTAACTACC-3’and NP117R 5’-GCAGATCGGGACGGAGGTTG-3 ‘. Para determinar a sensibilidade do PCR Gag publicado originalmente por Urisman et ai. os seguintes iniciadores foram aplicadas: gag de 5’-CGCGTCTGATTTGTTTTGTT-3 ‘, 5′-GAG OU CCGCCTCTTCTTCATTGTTC-3′, 5’-GAG SE TCTCGAGATCATGGGACAGA-3 ‘e 5′-GAG IR AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA [19]. A env de PCR foi realizada como recentemente publicado [3], utilizando os pares de iniciadores a seguir F 5’-ACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCG-3 ‘, R5′-AGCTGTTCAGTGATCACGGGATTAG-3′, 5’-SE GAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTC-3 ‘e 5′-IR CAGTGGATCGATACAGTCTTAGTCC-3′ . A integridade das amostras de ADN e a presença de método de inibição da putativos foram controladas por meio da amplificação de GAPDH, F 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘e R 5’ GAAGATGG TGATGGGATTTC-3 ‘.

Western Blot

Os lisados ​​celulares foram gerados utilizando tampão RIPA contendo 1% de Triton X-100 e mistura de inibidor de protease (Roche). bandas de proteínas específicas foram detectadas pelo anticorpo policlonal Env Rauscher 77S85 (dom de C. Stocking, Instituto Heinrich-Pette, Hamburgo, Alemanha), XMRV específica policlonal de coelho Gag K121 anti-soro e p30-Gag reconhecendo sobrenadante de hibridoma a partir de células CRL-1912 (ATCC) . quantidades de proteína iguais por pista foram assegurados com anticorpo actina mAB 1501 (Chemicon) incubação anti-humano. Para a detecção de partículas XMRV em sobrenadantes de culturas celulares, meio de cultura filtrada estéril de células infectadas foi ultracentrifugado 1 h, 110.000 x g a 4 ° C (Beckman SW60Ti). O pellet de sobrenadante 11 ml foi novamente suspenso em 10 ul de PBS e analisadas por immunoblotting.

secções de parafina de linha celular e TMAs

1 × 10

7 células (LNCaP, LNCaP cronicamente infectados com XMRV , 293T, 293T cronicamente infectadas com células XMRV e SC1 rato) foram fixadas durante 20 h em 10% de formalina tamponada com fosfato, embebidos em agar e processado a cera de parafina [37].

a contendo tecido da próstata preexistente TMA ( 50 PCA baixo grau, 50 PCA de alto grau e 50 hiperplasia benigna da próstata (HBP)) foi utilizado para IHC.

Immunhistochemistry

Slides com secções de parafina de pacientes com câncer de próstata foram inicialmente desparafinados com xileno. Para secções de recuperação de antigénio foram aquecidos 4 × 2 minutos em tampão citrato utilizando um microondas (650 W) e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente durante 30 min. O bloqueio foi realizado durante 30 min à temperatura ambiente com 10% de soro de suíno em tampão de diluição do anticorpo (Dako). Depois biotina endógena foi bloqueada utilizando um kit de avidina /biotina (Dako). O anticorpo primário (diluída em tampão de diluição do anticorpo com soro de suíno 2%, o anti-XMRV 1:7500; XMRV anti-gag 1:5000 K121) foi incubada durante 2 h à temperatura ambiente numa câmara húmida. Os controlos foram revestidos quer com o soro pré correspondente (mesma diluição) ou apenas com o tampão de diluição do anticorpo com soro de suíno 2%. A incubação com o anticorpo secundário – biotina /estreptavidina marcada – foi realizada durante 30 min à TA. Para uma detecção de anticorpos ligados posteriormente secções marcadas foram revestidos com uma solução de fosfatase alcalina (Dako, AK 5000) de acordo com as instruções do fabricante. solução de coloração IHC contendo levamisole para inibir a fosfatase alcalina endógena foi adicionada às lâminas durante 15-20 min, enquanto contracoloração foi realizada com soluções hamin Mayers. O soro anti-XMRV foi gentilmente cedido por Ila Singh (University of Utah, EUA).

Resultados de

expressão da proteína XMRV no tecido PCA através de métodos de IHC

Em 2009, a descoberta de 23% das secções de PCA positivas para a expressão da proteína XMRV foi reportado [4]. a expressão da proteína XMRV que na maioria dos casos localizados ao epitélio do tumor fortemente correlacionados com elevados graus de Gleason. Curiosamente, os dados de expressão de proteína não se correlacionam com os resultados de PCR. Uma explicação putativa sendo poucas células infectadas XMRV focais na próstata que são dificilmente detectáveis ​​por PCR usando o DNA de secções de tecido de montagem integrais como modelo. No entanto, estes resultados não foram confirmados por outro estudo [24]. Para contribuir para a explicação das discrepâncias nós analisamos seções PCA todo, bem como TMAs utilizando o soro anti-XMRV recentemente publicado [4] e um soro policlonal de coelho anti-XMRV gag (K121 gag).

Ambos os soros foram testados em Western Blot analisa com soro K121 gag reconhecer especificamente a proteína gag xenotr�ico enquanto exibe nenhuma reactividade cruzada com todas as proteínas celulares. Em contraste, o soro anti-XMRV [4], também reconheceu proteínas celulares em linhas celulares de ratinho e humanos infectados não complementar (Figura S1). Geramos parafina que representam linhas de células humanas 293T, LNCaP, ambas as linhas de células infectadas com o XMRV e uma SC1 linha de células de rato. Ambos os anti-soros reconhecem a proteína XMRV expressando células em secções de parafina mostrando coloração granular do citoplasma (Figura 1). Não se detectou coloração de células não infectadas e sem coloração de células de ratinho SC1. Um total de 100 APC (de baixa qualidade e alto grau PCA) e 50 HBP representada em uma TMA, bem como 10 grandes secções de cancro de próstata (com alta classificação de Gleason) foram analisados ​​com soro K121 mordaça (Tabela 2). Além disso, um contendo TMA da mama, do cólon e cancro da próstata, bem como vários tecidos normais foi testado quanto à expressão da proteína XMRV. Cada coloração IHC foi controlada através da inclusão de controlos positivos (secções de parafina de linhas celulares) e controlos negativos (sem adição de primeiro anticorpo), bem como as diluições mais elevadas do primeiro anticorpo. Nenhuma coloração de secções de câncer foi observada, bem como a maioria dos tecidos de controlo foi negativo para a coloração K121 gag. Apenas uma secção da HBP exibido muito poucas células basais aleatórios que coram positivo com soro K121 anti-gag (Figura 2). Nenhum dos TMA foi testado com o soro anti-XMRV desde fundo elevado devido ao processo de produção de TMA tem sido observada.

As secções de parafina de matriz de linha de célula que contém as linhas de células infectadas XMRV, bem como linhas de células não infectadas eram coradas para a expressão da proteína XMRV utilizando soro anti-XMRV (a) ou anti-gag do soro K121 policlonal de coelho (B). ampliações maiores são apresentados para as células infectadas XMRV, bem como para uma linha de células de rato selvagem, SC1.

1/50 HBP foram observadas células coradas positivos aleatórios, que podem ser células basais com base na sua localização na próstata.

PBMC activados podem ser infectados com o XMRV, no entanto replicação XMRV é restrito em PBMC.

Seguindo a hipótese publicada por Lombardi et al, que XMRV pode ser detectado em PBMC a partir de até 67% dos doentes com SFC, assim como em até 4% dos controles saudáveis ​​[2] que destinada a accionar as CMSPs de pacientes com PCA e pacientes de controlo e o ecrã para a infecção por XMRV aplicação de métodos diferentes. Nós estabelecido pela primeira vez os nossos métodos de detecção de XMRV em PBMC que foram in vitro infectadas com sobrenadante viral contendo VP62 XMRV. ADN proviral foi usada para produzir XMRV sobrenadantes infecciosos em células LNCaP que suportam fortemente a replicação XMRV devido a uma forte activação da LTR, bem como a falta de factores de restrição retroviral expressão APOBEC 3G [36], [38] – [41]. PHA PBMC activadas foram infectadas in vitro com as quantidades indicadas de sobrenadante virai (Figura 3), que foram cultivadas na presença de IL-2 por mais 7 d. Vírus contendo sobrenadante foi então sujeita a ultracentrifugação e pelotas virais (Figura 3A), bem como lisado celular (Figura 3B) das PBMC infectadas foram analisados ​​por Western Blotting assegurar a expressão de proteínas específicas XMRV. Com base em experiências de Western Blot utilizando células LNCaP cronicamente infectadas diluídas com o número indicado de células 293T de células não infectadas (Figura S2), podemos estimar que aproximadamente 1-2% das PBMC são infectadas com XMRV. Só se infectar PBMC com elevados títulos virais nos eficientemente detectada XMRV no sedimento viral após ultracentrifugação e análise de Western Blot (Figura 3A). O ADN genómico isolado a partir destes in vitro PBMC infectados XMRV foi positivo para sequências XMRV por PCR utilizando 650 ng de ADN genómico e dois conjuntos de iniciadores diferentes de segmentação gag e env (Figura 4A e Figura S3). A sensibilidade de todas as reacções de PCR é indicada na Figura complementar S4 com todos PCR detecção de 1-10 células infectadas em um fundo de 10

6 células não infectadas.

PBMC de dois dadores diferentes foram isolados, reunidas, estimulados com PHA e subsequentemente infectadas com as quantidades indicadas de XMRV contendo sobrenadante (pista 1-5). A análise por Western Blot de lisado de células infectadas a partir de PBMC foi realizada 7 d passado infecção (B). O sobrenadante das PBMC infectadas foi enriquecida por partículas de vírus por ultracentrifugação e coradas para a expressão do CA (A). (C) a 500 ul de sobrenadante contendo XMRV originado PBMC mostrado em A e B foi utilizado para infectar células Derse-IGFP que foram analisadas para a expressão da GFP 7 d passado infecção por FACS. Os títulos são indicados como GFP infecciosa unidades /ml. (D) A infecção de células Derse-IGFP é 100fold aumentada por co-cultura de PBMC infectados (mostrado em (A)) com células LNCaP durante 7 d, SN de células LNCaP foi então aplicado às células Derse-IGFP, que foram analisadas por FACS 5 d pi.

(B) células Derse-IGFP foram infectados com 500 sobrenadante ul de 22Rv1, células infectadas simuladas ou células LNCaP co-cultivadas com XMRV infectados PBMC de 14 d. 72 h infecção passada células Derse-IGFP foram monitorados para as células positivas para GFP por microscopia.

cocultivo das XMRV PBMC infectados com células LNCaP aumenta significativamente a sensibilidade de detecção XMRV.

Derse-IGFP As células foram expostas ao sobrenadante de cultura filtrou-se a partir de PBMC infectados XMRV. 500 ul de sobrenadante foi adicionada a 5 x 10

4 células Derse-IGFP que foram marcados para expressão da GFP 7 d p.i. por microscopia e análise de FACS (Figura 3C). Em geral, o sobrenadante virai a partir de PBMC é infecciosa, no entanto apenas muito poucas células positivas para GFP foram detectadas. Curiosamente, se cocultivate as PBMC XMRV infectados com células LNCaP durante 5 d, recolher o sobrenadante e reinfectar células Derse-IGFP com sobrenadante filtrado, sensibilidade de detecção XMRV usando células Derse-IGFP foi 100fold aumentou Figura 3D e Figura 4B.

PBMC de pacientes PCA são negativos para a detecção XMRV por análise de PCR

Usando essa abordagem foram isoladas PBMC de 92 pacientes PCA e 7 voluntários saudáveis ​​por gradiente de Ficoll; As PBMC isoladas foram activadas por PHA e cultivados na presença de IL-2 durante 7 d. PBMCs foram submetidos a ensaios diferentes como descreve na Figura 5A: o isolamento do ADN genómico seguido por XMRV nested PCR específica aplicando duas estratégias publicadas XMRV PCR [1], [3], [19]; a co-cultura de PBMC activadas com células LNCaP durante 8 semanas com infecção subsequente de células Derse-IGFP utilizando sobrenadante de 6 semanas e 8 semanas após a co-cultura. A localização dos diferentes conjuntos de iniciadores usados ​​é mostrado na Figura S3 e sensibilidade dos diferentes PCRs XMRV se reflecte na Figura S4. A integridade do ADN genómico em conjunto com a ausência de inibidores putativos de PCR foi garantida através de amplificação por GAPDH (Figura S4). O cultivo de PBMC, as preparações de ADN e a amplificação por PCR foram realizadas nos laboratórios do Instituto Heinrich-Pette, onde não foram realizados outros estudos XMRV. Além disso, todas as reacções de PCR aninhados para detectar sequências XMRV utilizando dois pares de iniciadores diferentes de segmentação da mordaça, ambos, recentemente publicado, bem como uma env de PCR foram realizadas por dois operadores, utilizando 650 ng de ADN genómico como molde. Todas as amostras de ADN foram encontrados para ser consistentemente negativas (Tabela 3). As reacções de PCR foram rotineiramente controlada de contaminação do rato utilizando iniciadores dirigidos contra retrotransposões, intracisternal Uma partícula (PAI), tal como foi recentemente publicado [15]. Nenhuma das reacções de PCR foi positiva para as sequências de ADN de rato (dados não apresentados).

Métodos (A) utilizado para pesquisar XMRV em PBMCs de pacientes PCA e controlos saudáveis. (B) As células-Derse IGFP 72 h p.i. com SN partir de células LNCaP co-cultivadas durante 8 semanas com o paciente derivado PBMC (painéis superiores). Os painéis inferiores exibir células Derse-IGFP 72 h p.i. com SN de PBMC derivadas de pacientes que foram ativadas com PHA para 7d.

67 amostras de PBMC foram co-cultivados com células LNCaP por até 8 semanas e SN das células LNCaP foi aplicado para o repórter linha de células Derse-IGFP. Esta linha de células transporta um vector de MLV, o que conduz a expressão de um repórter GFP se transcriptase inversa é expresso. 72 h p.i. células Derse-IGFP foram monitorados para a expressão GFP por microscopia. De 67 amostras de sobrenadante a partir de PBMC co-cultivadas com células LNCaP, dois resultou em células positivas para GFP em 2-3 5 × 10

4 células (Figura 5B). Não se observou um aumento de células positivas para GFP ao longo do tempo, indicando que não houve disseminação da infecção virai. Curiosamente o sobrenadante das PBMC activadas destes dois pacientes sem co-cultivo também resultou em células Derse-IGFP positivos 1-2 GFP por poço. Em um caso, foram realizados dois isolamentos PBMC independentes do mesmo paciente (# 99 e # 100), ambos resultaram em células Derse-IGFP positivos 1-2 GFP. No entanto, ambos os isolamentos foram realizadas no mesmo dia pelo mesmo operador. PCR de LNCaP células co-cultivadas com PBMC destes dois pacientes não resultou na detecção de sequências específicas XMRV, bem como não fomos capazes de cultura e expandir células Derse-IGFP GFP positivas para análises subsequentes.

Discussão

neste estudo examinamos a detecção de XMRV em pacientes com câncer de próstata através do estudo de diferentes espécimes biológicos de diagnóstico para a presença de XMRV ou sequências de MLV relacionados. Em particular, foram analisadas amostras de tecido do APC, bem como as secções de tecido a partir de outras doenças malignas e tecidos normais para a expressão da proteína XMRV por IHQ. Além disso, as PBMC de 92 PCA e 7 controlos saudáveis ​​foram rastreadas para a presença de sequências e recuperação de vírus infecciosos XMRV. As PBMCs foram activadas por PHA, co-cultivadas durante até 8 semanas e presença XMRV foi examinada por qualquer nested PCR segmentação duas regiões XMRV diferentes, Western Blot análises usando anticorpos anti-XMRV diferentes ou infecção de células Derse-IGFP aplicáveis ​​sobrenadante de PBMC activadas ou sobrenadante de células LNCaP co-cultivadas com PBMC por até 8 semanas.

não fomos capazes de mostrar de forma conclusiva que as sequências de XMRV pode ser detectado em PBMC activadas de pacientes PCA embora em dois pacientes GFP células Derse-IGFP positivos foram detectados. Em ambos os casos as análises PCR subsequente de PBMC ativadas, bem como células LNCaP co-cultivadas foram negativos para sequências de XMRV, bem como não encontramos a expressão da proteína XMRV nas seções PCA de um desses pacientes.

Nós publicado anteriormente que XMRV sequências são apenas raramente detectada na Alemanha utilizando ADNc gerados a partir de ARN de tecido APC amplificado por PCR [27]. Resultados semelhantes para um estudo em os EUA têm sido publicados recentemente por Switzer et al., [26]. No entanto, existem vários estudos não identificar quaisquer sequências XMRV no tecido PCA, bem como existem estudos com maior prevalência de XMRV em PCA [3], [9], [21] – [24], [31], [42] . Considerando a possibilidade de infecção focal XMRV na próstata que pode ser dispensada por amplificação por PCR devido a apenas uma minoria de células infectadas foi estabelecido coloração IHC utilizando o soro anti-XMRV publicada e um soro anti-gag XMRV específica. Nós não conseguiu detectar a expressão da proteína XMRV no tecido, cancro da mama ou cancro do cólon de tecidos PCA, bem como mais tecido de controlo (incluindo 10 seções cada um: glândula, cólon, endométrio, epidídimo, coração, rim, pulmão, pâncreas, placenta, glândula parótida adrenal , baço, estômago, músculo estriado, timo, amígdalas, e testículos) não mostraram qualquer coloração positiva para soro K121 gag. Curiosamente, usando o soro K121 anti-gag foram detectados 1/50 seções BPH positivos para a expressão da proteína XMRV. A expressão da proteína foi identificada em algumas células isoladas basais no epitélio da próstata. As células basais estão ausentes em PCA, apoiando o fato de que XMRV provavelmente não está diretamente envolvido no desenvolvimento de PCA. O pequeno número de secções de tecido de montagem integrais examinou poderia explicar a discrepância entre os nossos resultados e conclusões anteriores por Schlaberg et al. [4]. Nós só manchado dez secções de tecido de montagem inteiros com ambos os anti-soros, o soro anti-XMRV [4] não foi usado em seções TMA devido ao fundo alta coloração. Aloia et ai. e Sakuma et al. tanto discutir uma reactividade cruzada de soro anti-XMRV com antígenos de proteínas humanas, resultando em coloração positiva IHC em secções de PCA [16], [24]. Nós detectamos alguma reactividade cruzada com o soro anti-XMRV publicado em Western blot de lisados ​​celulares análise de células infectados e não infectados, no entanto, houve nenhum fundo observado em secções de parafina de linhas celulares ou em seções inteiras de tecido PCA utilizando soro nas diluições indicadas . coloração IHC negativo não exclui a possibilidade de algumas células que transportam sequências provirais XMRV que pode perder por amplificação por PCR. Nós não aplicar a tecnologia FISH DNA para detectar a integração proviral XMRV no tecido humano. Avaliação de sinal positivo FISH em 0,1% ou menos das células, especialmente se apenas uma cópia por célula viral deve ser esperado, é altamente propensa a erros.

Recentemente, Lombardi et ai. detecção e transmissão de XMRV infeccioso a partir de PBMC ou plasma de pacientes com CFS relatado por coculturing com células LNCaP [2]. Curiosamente, foram identificados 3-4% do PBMC isoladas de pacientes de controle para ser positivo para XMRV vírus infeccioso resultando na preocupação geral sobre a segurança dos produtos sanguíneos. Vários estudos posteriores motivados por estes resultados não foram capazes de confirmar estes resultados originais. As razões para a discordância não são claras e são atualmente investigados. Embora a maioria dos estudos centraram-se em técnicas de PCR, bem como a detecção de anticorpos específicos XMRV apenas um estudo incluíram a co-cultura de PBMC activadas de pacientes com CFS com células LNCaP [10] e um estudo mais recente testado a transmissão de XMRV a partir de plasma (derivado de CFS pacientes) para células de LNCaP [43]. Ambos os estudos não detectar XMRV em qualquer uma das amostras testadas. Concentrando-se na possibilidade de que o XMRV é um vírus espectador reactivada em pacientes com cancro da próstata em conjunto com a conclusão de que o XMRV pode ser detectada em PBMCs de pacientes [2], procurado para sinais de infecção XMRV em células de sangue de pacientes PCA que aplicam a tecnologia de PCR e co-cultura de PBMC activados com células indicadoras.