Abstract

Fundo

MUC1 é um tipo I glicoproteína transmembrana aberrante sobre-expressos em várias células de câncer, incluindo câncer de pâncreas. A extremidade citosólico da proteína MUC1 (MUC-1-c) é extensivamente envolvido num número de vias de sinalização. MUC1-C é relatado para inibir a apoptose em várias células de cancro, mas o mecanismo de inibição é pouco claro.

Método

Expressão da proteína MUC1-C foi estudado na linha celular de cancro pancreático MiaPaCa -2 no nível do ARN utilizando qRTPCR e ao nível da proteína por transferência de Western. MUC1-C expressão foi inibida quer por siARN ou por um inibidor peptídico específico, IR-201. Efeito da inibição de MUC1-C na proliferação e viabilidade e lisossomal permeabilização foram estudados. Associação de MUC1-C com HSP70 foi detectada por co-imunoprecipitação da proteína MUC1-C e HSP70. Localização de MUC1-c em organelas celulares foi monitorado por imunofluorescência e com mancha imunológica pelo anticorpo MUC1-c após fracionamento subcelular.

Resultados

A inibição da proteína MUC1-c por um inibidor (GO- 201) ou siARN resultou em viabilidade reduzida e reduziu a proliferação de células de cancro do pâncreas. Além disso, IR-201, o péptido inibidor da proteína MUC1-C, foi eficaz na redução da carga de tumor no modelo de rato pancreático cancro. MUC1-C também foi encontrado para ser associado com HSP70 no citosol, apesar de uma quantidade significativa de MUC1 foi também observada para estar presente nos lisossomas. A inibição da expressão ou actividade de MUC1 mostrou uma actividade aumentada catepsina B no citosol, indicando lisossomal permeabilização. Assim, este estudo indica que a MUC1-C interagiu com HSP70 no citosol de células de cancro do pâncreas e localizada para os lisossomas nestas células. Além disso, os nossos resultados mostraram que a MUC1-C protege as células cancerígenas pancreáticas de morte celular através da estabilização de lisossomas e impeçam a libertação de catepsina B no citosol

citação:. Banerjee S, N Mujumdar, Dudeja V, Mackenzie t, Krosch TK, Sangwan V, et al. (2012) MUC1c Regula a sobrevivência das células no câncer de pâncreas, impedindo Lisossomal permeabilização. PLoS ONE 7 (8): e43020. doi: 10.1371 /journal.pone.0043020

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Abril de 2012; Aceito: 16 de julho de 2012; Publicado: 13 Agosto 2012 |

Direitos de autor: © Banerjee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R21 5R21CA131663-02, R01 5R01CA124723-05 e Catherine e Robert Goodale base para AKS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte por câncer em homens e mulheres nos Estados Unidos. A maioria dos cânceres de pâncreas são adenocarcinoma ductal. A taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes com doença localizada após a ressecção cirúrgica é de 20% e para aqueles com doença metastática, a taxa de sobrevivência é extremamente baixo. Embora recursos significativos foram empenhada em melhorar a sobrevida de pacientes com câncer pancreático nas últimas décadas, não houve nenhuma melhoria significativa na esses números [1]. A taxa de sobrevivência baixa é atribuído à tarde detecção de cancro do pâncreas e a resistência extrema das células tumorais para quaisquer estratégias quimioterapêuticas. Por esta razão, a elucidação do mecanismo de resistência das células de cancro do pâncreas é um foco de investigação prima, uma vez que pode levar ao desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas.

As mucinas são glicoproteínas transmembranares, presente na superfície de vários epitelial da mucosa e células hematopoiéticas, e são relatados para ser sobre-expresso num certo número de adenocarcinomas [2]. MUC-1 é um dos mucinas que está associado com prognóstico pobre, a transformação maligna de células tumorais, e resistência a agentes anti-cancro genotóxicos [3], [4]. MUC-1 está também associada a invasão [5] – [7], [8], que controlam diversas vias de sinalização celular [9] e a progressão do tumor [10]. Falta de MUC1 tem sido correlacionada com a proliferação diminuída, invasão, e as taxas de mitose ambos

in vivo

e

in vitro

em câncer pancreático [11].

MUC1 é sintetizada como um único péptido que sofre clivagem em duas subunidades, subsequentemente, a formação de um heterodimero não covalente estável que consiste de um domínio extracelular e uma cauda citoplasmática [12], [13]. O domínio extracelular da proteína MUC1 é composto de repetições em tandem número variável (VNTR) modificados por extensos O-glicanos, e actua como uma barreira física contra o ambiente extracelular. A cauda citoplasmática da proteína MUC1 (MUC1-C) consiste de um domínio extracelular de ácido 58 amino, um domínio transmembranar de 28 aminoácidos e um domínio citoplasmático de 72 aminoácidos. Este domínio citoplasmático (designadas MUC1-C) interage com β-catenina, o principal efector da via de sinalização Wnt canónica [14], [15], e induz o crescimento independente da ancoragem e tumorigenicidade [16], [17]. Interacção com β-catenina promove a localização de MUC1 para o núcleo, onde MUC1-C interage com vários factores de transcrição e activa um certo número de factores de crescimento e sobrevivência vias [18] – [24], reprimindo assim várias vias de morte celular [25] – [ ,,,0],29].

a sobre-expressão da proteína MUC1, como encontrado em tumores humanos, está associado com a localização da proteína MUC1-C para mitocôndria [3]. O significado funcional de mitocondrial MUC1-C localização é suportada pela demonstração de que a MUC1 atenua ADN libertação induzida por dano de factores apoptogénicas mitocondriais e a resposta apoptótica [3]. Desde MUC1 não tem o assinatura localização mitocondrial clássico, o direccionamento mitocondrial de MUC1-C é mediada pela sua interacção com acompanhantes citosólicos tal como HSP70 e HSP90 [30]. À medida que o recém-sintetizado e -cleaved MUC1-c é no citosol com um domínio transmembranar hidrofóbico expostas [31], [30], estas chaperonas são capazes de se ligar a ele e entregá-lo para a mitocôndria [32]. Associação de MUC1-C com proteínas de choque térmico, após activação com heregulina e o seu posterior direccionamento para a membrana mitocondrial externa tem sido relatada [33]. Como um componente da membrana mitocondrial externa, MUC1-C atenua a perda do potencial de membrana em resposta ao stress genotóxico [34], [3], e confere resistência à morte na resposta celular a danos no ADN, espécies reactivas de oxigénio, hipoxia, ou a activação do receptor de morte superfamília [34].

Embora as vias a jusante da morte de células como consequência da inibição de MUC1 foram estudados num número de cancros, o mecanismo de início de despolarização mitocondrial (inibição seguinte MUC1 ), levando à ativação de vias apoptóticas não está claro em câncer pancreático. despolarização da membrana mitocondrial pode ser o resultado de uma série de eventos. Os danos do ADN nuclear ou retículo endoplasmático ambos induzem a morte celular apoptótica que é dependente da despolarização mitocondrial e activação de caspases [35]. despolarização semelhante e início de vias de morte celular também pode ser desencadeada a partir dos lisossomos. danos lisossomal em resposta a agentes genotóxicos é relatado para iniciar a morte celular por libertação das enzimas hidrolíticas deste organelo no citoplasma [36], [37]. Lisossomas contêm muitos tipos diferentes de enzimas hidrolíticas, incluindo proteases, lipases, nucleases, glicosidases, fosfatases e fosfolipases, sulfatases que normalmente exercem a sua actividade enzimática máxima a pH baixo. proteases lisossómicas que têm sido implicados na morte celular As catepsinas são aqueles que permanecem activos a um pH neutro, tais como a catepsina B, catepsina D e a catepsina L. Estas proteases activar efectores de apoptose, tais como as mitocôndrias e /ou caspases, desencadeando a apoptose [38] ., [39]

Um dos tipos de proteínas que promovem a sobrevivência das células pancreáticas, é a família de proteínas de choque térmico, HSP70, em particular [37], [40] – [42]. Tem sido relatado que a regulação negativa da HSP70 resulta em morte de células de câncer de pâncreas por induzir a permeabilização lisossômico, [37], mas o mecanismo exato de proteção não foi estudado.

No presente estudo, mostramos que associa HSP70 com a extremidade C-terminal da proteína MUC1 (MUC-1-c) e transporta-a para o lisossoma, impedindo assim lisossomal permeabilização e promoção da sobrevivência celular nestas células de tumor. Mostramos ainda que o péptido inibidor da proteína MUC1 (IR-201) inibe a actividade da proteína MUC1-C e resulta em proliferação celular reduzida e a viabilidade de células tumorais tanto

In vivo

e

in vitro.

Resultados

as células do cancro do pâncreas Mostrar aumento da expressão de MUC1 comparação com normal pâncreas

a expressão de MUC1 foi estudada em várias linhas celulares de cancro do pâncreas, tanto a nível RNA e proteínas . A expressão de ARNm de MUC-1 verificou-se ser significativamente mais elevada em todas as linhas de células de cancro do pâncreas do que nas células pancreáticas humanas não tumorigénicas ductal (HPDEC) (Fig. 1A). Semelhante a expressão elevada de proteína MUC1-C foi observada em todas as linhas de células de tumor quando comparados com os HPDECs não tumorigénicas. A correlação foi encontrada a existir entre agressividade da linha celular e expressão de MUC1 em câncer pancreático (Fig. 1B). Observou-se a expressão mais elevada da proteína MUC1 em linhas celulares mais invasivo e metastático S2-013 e S2-vp10 ou AsPC1 (derivado de ascites) do que em linhas celulares obtidas a partir de tumores primários (MiaPaCa-2, BxPC3) e Hs776T.

os níveis de expressão de ARNm de MUC-1 em várias linhas de células do cancro do pâncreas em relação ao HPDEC não-tumorigénico (a). Os dados são expressos como a média +/- SEM de 3 experiências independentes. *

P Art 0,05 (

t

test), em comparação com os controles. Os níveis de expressão de proteína de MUC1-c na linha de células de câncer pancreático diferente e não-tumorigénico HPDEC (B).

A inibição da proteína MUC1 leva à redução proliferação e morte celular

Para estudar se MUC-1 era uma proteína essencial controlar a sobrevivência das células no cancro do pâncreas, a sua expressão foi inibida utilizando ARNsi contra MUC1 em MiaPaCa-2 (Fig. 2A-C) e AsPC1 células (Fig. 2G-I). Em paralelo também utilizado GO-201, um fragmento de péptido que inibe a actividade da proteína MUC1-C, conduzindo assim a desregulação da actividade de sinalização a jusante e desencadear a morte celular em linhas celulares de cancro pancreático MiaPaCa-2 (Fig. 2D-F) e AsPC1 ( A Fig. 2J-G). Tanto a inibição da expressão de MUC-1 por siARN (Fig. 2 A, L), bem como inibição da actividade da proteína MUC1-C por IR-201 conduziu a proliferação reduzida e aumento da morte celular em células de cancro pancreático. células MiaPaCa-2 foram observados para responder mais à inibição da proteína MUC1, quer por siARN ou por IR-201 (Fig. 2A-F) em comparação com células AsPC1 (Fig. 2G-G). Como esperado, IR-201, o inibidor de péptido para MUC1-C, não alterou o nível de proteína (Fig. 2D, J) expressão. A morte celular foi visto como sendo (Figura S1).

expressão MUC1 foi inibida por siRNA em MiaPaCa-2 (A) Lanes mediada por caspase controle 1-3 mostram MiaPaCa-2, MiaPaCa-2 transfectadas com não- siRNA específico e MUC1 siARN respectivamente. Tanto a proliferação (B) e viabilidade (C) foram reduzidas com a diminuição da expressão de MUC-1 em células de MiaPaCa-2. No tratamento com o inibidor de actividade de MUC1-GO C-201, que inibe a actividade de sinalização de proteína presente, não foram detectadas alterações nos níveis de expressão de MUC-1 em células de MiaPaCa-2 (D). A pista 1 era células não tratadas MiaPaCa-2 e pista 2 era MiaPaCa-2 tratados com IR-201. Proliferação (E) e viabilidade (F) foram observadas para ser diminuída. Da mesma forma, em uma outra linha de células, AsPC-1, transfeco com siRNA mostraram uma diminuição dos níveis de proteína (G) onde Pista 1 é controlar AsPC-1, Pista 2: siARN não específica transfectadas AsPC-1 e a pista 3 é MUC1 siRNA-transfectadas AsPC1 . Tanto a proliferação (H) e viabilidade (I) foram reduzidos. Por tratamento com o inibidor de GO-201, não houve nenhuma alteração nos níveis de proteína (J): Pista 1 foi células não tratadas AsPC-1 e pista 2 era AsPC-1 tratado com IR-201. Proliferação (K) e viabilidade (G) foram vistos a ser reduzida. Os dados são expressos como a média +/- SEM de 3 experiências independentes. *

P

. 0,05 (

t

test), em comparação com controles

MUC1 Associates com HSP70 no citosol e localiza nos lisossomos

proteína de choque térmico 70 (HSP70) é altamente sobre-expressos em câncer de pâncreas e sua regulação negativa por inibidores e siRNA foi visto para induzir a morte de células de câncer pancreático [37]. No entanto, o papel exacto desempenhado por HSP70 na sobrevivência de células de cancro do pâncreas é desconhecido. Ao mesmo tempo, a MUC1 é conhecido por ser sobre-expresso em cancro do pâncreas e desempenham um papel na sobrevivência celular numa série de linhas celulares de cancro, mas o mecanismo exacto tem sido elusiva [11], [43], [44]. Desde HSP70 é um acompanhante, que tem a capacidade de se ligar e sequestrar o citosólica MUC1-C orientando-o, assim, a diferentes organelos celulares, onde MUC1-C podia regulam as várias vias anti-apoptóticas para proteger as células de cancro do pâncreas da morte celular por apoptose. Foi demonstrado anteriormente que a MUC1 se liga a HSP70 e HSP90 e é orientada para a membrana mitocondrial externa [33]. Para ver se MUC1-c está associada com HSP70 em células de cancro do pâncreas, testou-se a co-precipitação da proteína MUC1 e HSP70 em células de cancro pancreático. MUC1-C e foram encontrados HSP70 a co-imunoprecipitado, onfirming que HSP70 e MUC1 realmente interagir de células de cancro do pâncreas (Fig. 3A).

A imunoprecipitação com proteína MUC1 e HSP70 mostrou que as duas proteínas a ser associado (A) . As pistas 1, 2 e 3 mostram os níveis de proteínas totais, HSP70 e MUC1 na flowthrough e as duas proteínas imunoprecipitadas por anticorpos de HSP70 respectivamente. Lanes 4 e 5 mostram flowthrough e imunoprecipitados pelo anticorpo MUC1. MUC1-c foi encontrado para ser localizada para os lisossomos em células MiaPaCa-2, embora quantidades quase iguais de MUC1-c foram também citosólica (B). LAMP2, uma proteína lisossómica residente, e actina, uma proteína citosólica predominantemente, foram utilizados como marcadores de fraccionamento. A pista 1 é a fracção citosólica. A Pista 2 é uma fracção em bruto lisossomal, que é enriquecido em Pista 3. HSP70, embora relacionado com MUC-1, foi observada a ser predominantemente presente no citosol. Imunofluorescência confirmada co-localização de MUC1-C e LAMP2 nos lisossomas (C).

MUC1 é extensivamente presente na superfície celular das células pancreáticas. No entanto, o ácido amino terminal 72 do terminal C da proteína sofre auto-clivagem e localiza a diferentes organelos celulares em resposta a um mecanismo de sinalização diferencial. Para ver se MUC1-C foi de facto transportada por HSP70 para vários compartimentos celulares, foi realizada imunof luorescência com marcadores específicos de organelos juntamente com fraccionamento subcelular seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-MUC1 a olhar para a sua localização. A integridade das diferentes fracções e a pureza das preparações organelares foram confirmadas utilizando marcadores diferentes (LAMP2 para lisossomas e actina para citosol). Embora a HSP70 foi visto para co-precipitar com MUC1-C (Fig. 3A), observou-se a ser localizada no citosol e não nos lisossomas, enquanto MUC1-C foi encontrado para ser localizado em ambos citosol e lisossomas (Fig. 3B). Localização da proteína MUC1 em lisossomas foi ainda confirmada por células de cancro do pâncreas co-coloração com o marcador lisossomal LAMP2 (Fig. 3C). Imunofluorescência mostrou que MUC1 e lamp2 co-localizar com Correlação de Pearson de 0,75 (Fig. 3C). Isto indicou que a MUC1-C associado com HSP70 no citosol e localizada nos lisossomas. Alguns MUC1-C também foi observado para localizar na mitocôndria, confirmando deste modo o estudo anterior por Ren et al que a MUC1-c é alvejado a mitocôndria por HSP70 [3] (Figura S2).

A inibição da MUC1- c ou HSP70 resulta em lisossomais permeabilização levando à morte celular

lisossomais permeabilização é frequentemente pensado para preceder a morte celular em resposta a um estímulo por libertar uma série de enzimas hidrolíticas em citoplasma, desse modo reduzindo o pH do citosol e causando acidose [45]. Liberação de enzimas lisossomais, tais como catepsina B e catepsina D, por sua vez induzem despolarização mitocondrial resultando na liberação de citocromo C e ativação de vias de apoptose [45]. Uma vez que uma fração significativa de MUC1 foi localizada nos lisossomos, buscamos um efeito sobre a permeabilização lisossômico medindo perda de Catepsina B-lamp2 co-localização nos lisossomos com a inibição da proteína MUC1. Confirmou-se ainda mais este fenómeno por medição da actividade da catepsina B citosólico em células após a inibição da proteína MUC1 por siRNA. Os nossos estudos de imunofluorescência mostrou uma perda distinta em co-localização de CathepsinB e co-coloração LAMP2 em células de MUC1-silenciados (Fig. 4a). Os nossos estudos bioquímicos demonstraram que a inibição da expressão de MUC-1 apresentaram um aumento na actividade citosólica catepsina B o que indica que a integridade da membrana lisossomal foi comprometido (Fig. 4B). Observou-se uma amplitude quase igual de actividade citosólica Catepsina B quando HSP70 foi inibida utilizando siRNA (Figura S3). Este foi semelhante a um estudo anterior [37] em nosso laboratório relatando que downregulation de HSP70 em câncer pancreático resultou na morte celular por permeabilização lisossômico. Isto indicou que a inibição de qualquer um ou de HSP70 MUC1 resultou em permeabilização lisossomal. Para determinar se este permeabilização foi directamente relacionada com a morte celular, foi utilizado um inibidor de célula-permeável catepsina B (CA-074-Me) e medida a viabilidade das células na presença de um inibidor de MUC1 (Fig. 5C). Enquanto a viabilidade das células foi reduzido para cerca de 40% de células não tratadas na presença de VAI-201, as células tratadas com o CA-074Me juntamente com IR-201 foram observadas para recuperar e mostrou uma viabilidade de quase 98% de células não tratadas ( A Fig. 4C). Observou-se que as células tratadas com apenas IR-201 mostraram uma redução do crescimento e proliferação depois de 3 dias de tratamento, enquanto aqueles que foram tratados com o inibidor da catepsina B apresentou proliferação e crescimento semelhantes aos dos controlos. Também se observou restabelecimento similares de viabilidade de células MiaPaCa-2 quando a expressão MUC-1 foi inibida por siARN (Figura S4). Isto mostrou que o efeito de IR-201 sobre a libertação de catepsina B podia ser revertida pelo uso de um inibidor da catepsina B (Fig. 4D). Isto também foi confirmado bioquimicamente, em que MUC1 siRNA e GO201 ambos mostraram aumento da atividade catepsina B citosólica mas o tratamento com CA-074Me mostrou uma reversão desta atividade. Isto indicou que a inibição da proteína MUC1, de facto levou a permeabilização lisossomal, que por sua vez disparado o aparecimento de percursos de morte celular nessas células.

Inibição de MUC1 por siRNA resultou em permeabilização lisossomal como manifestado por libertação catepsina B no citosol ( UMA). foi observada perda de co-localização de catepsina B e lamp2 em células silenciou-MUC1 comparação com controlo não silenciar. ensaio bioquímico para a atividade catepsina B no citosol mostraram aumento da atividade em ambas as células silenciadas e as células tratadas com GO-201 (B) MUC1. O processo de morte celular induzida pela GO-201 foi preso na utilização de um inibidor de catepsina B CA-O74Me (C). Os dados são expressos como a média +/- SEM de 3 experiências independentes. *

P

. 0,05 (

t

test), em comparação com controles

modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas com células AsPC-1 mostrou enorme pancreático tumores em ratinhos não tratados (a), enquanto que GO-201 teve muito pouco nenhum tumor no seu pâncreas. Redução do peso do tumor (C) e o volume (D) foi observada após tratamento com IR-201. * Representa p 0,05, em comparação com os controlos. cortes de tecidos representativos de ratos com tumor pancreático (modelo ortotópico com células AsPC1) no grupo de controlo coradas com Ki-67 mostrou coloração extensa indicando células em proliferação activa tumorais (E), em comparação com menos manchas na GO-201 lâminas que mostra a perda na proliferação (F). O número total de células coradas com Ki-67 foi contado em pelo menos 10 campos em ambas as amostras e o número médio de células em ambos os conjuntos de proliferação foram representados graficamente (G) *

P

0,05 (

t

test), em comparação com os controles.

a inibição da proteína MUC1 Expressão em um

in vivo

rato Modelo de câncer pancreático Reduz Tumor Progression

GO -201, um inibidor peptídico relatado como inibindo a actividade da proteína MUC1-C, foi testado quanto à regressão do tumor em vários modelos de cancro, tais como cancro da próstata, cancro da mama e LMC [46] – [48]. No entanto, sua eficácia não foi testada em modelos de câncer de pâncreas. Utilizou-se um modelo ortotópico de pâncreas de rato cancro com a linha celular agressiva AsPC1 para testar a eficácia de IR-201. Vinte camundongos nu /nu atímicos receberam injeções intra-pancreáticas de 2 × 10

5 células. O tratamento com intraperitoneal IR-201 (30 mg /kg de peso corporal) foi iniciado em 10 ratinhos randomizados, com início no dia 4 após a injecção de células tumorais. Os restantes 10 ratinhos foram injectados com solução salina. O experimento foi encerrado no dia 30 após a injeção de células. Os ratinhos foram sacrificados e o peso do tumor em ambos os grupos foi calculada. No dia 30, todos os animais apresentavam tumores solução salina (n = 10) (Fig. 5A), enquanto que no grupo tratado com n = 10 ratinhos, apenas 3 dos 10 tinham tumores (Fig. 5B). O peso do tumor no grupo não tratado variou 0,6-1,6 g enquanto que os grupos tratados tinham tumores pesando 0,1 g, 0,3 g (Fig. 5C). O volume médio do tumor dos ratinhos no grupo de solução salina foi de 0,9 cm

3 ao passo que aqueles tratados com IR-201 tinha um volume médio do tumor de 0,1 cm

3 (Fig. 5D). O grupo da solução salina também mostrou extensa disseminação metastática de tumores para um número de órgãos (Tabela 1). Os tecidos dos tumores foram coradas com Ki-67 para comparar as taxas de proliferação nos dois grupos. O grupo não tratado coradas intensamente com Ki-67, que mostra células em proliferação activa (fig. 5E). Em comparação, o GO-201 células tratadas manchado muito fracamente com Ki-67 (Fig. 5F). Isto sugere que a inibição funcional do MUC1-c pela GO-201 resultou em significativa redução da carga tumoral em camundongos.

Discussão

de choque térmico (HSP) 70 proteínas funcionam como ATP chaperones dependentes que regulam a dobra de proteínas sintetizadas recém-, o conjunto de complexos multi-proteína e o transporte de proteínas através das membranas celulares [49]. HSP70 é frequentemente sobre-expressa em tumores malignos, e esta sobre-expressão está associado com um resultado terapêutico pobre em um número de cancros humanos, incluindo cancro da mama e cancro pancreático [50], [37], [40], [41]. HSP70 tem um efeito citoprotector marcado e inibe a sinalização apoptótica através da inibição da permeabilização mitocondrial, reduzindo a activação da caspase ou por factores de indução de apoptose neutralizantes [51]. HSP70 também se localiza membranas lisossomais [52], [53] e pode proteger as membranas lisossómicas contra LMP induzida por diferentes estímulos, tais como etopósido, TNF-α e stress oxidativo [54]. Temos demonstrado anteriormente que a HSP70 é abundante em células de cancro do pâncreas e que a sua regulação negativa por qualquer siRNA

in vitro

ou pelo uso de um inibidor da

in vivo

induz a ativação caspase e morte celular por apoptose [ ,,,0],37], [42], [55]. Isto sugere que a HSP70 é importante para a sobrevivência das células de cancro do pâncreas. Muitos prováveis ​​mecanismos têm sido propostos para a função pró-sobrevivência de HSP70.

In vitro

estudos têm sugerido que a HSP70 pode interferir directamente com a máquina de sinalização a jusante das mitocôndrias apoptose através da prevenção apoptossomo formação e activação de caspases [56]. Estudos recentes utilizando modelos de morte celular têm apontado que a inibição HSP70 mediada por apoptose dependente da caspase ocorre a montante da permeabilização mitocondrial membrana externa (MOMP) ea liberação de citocromo c [57], [58]. Estudos anteriores de nosso grupo também sugerem que a inibição da expressão de HSP70 por diferentes inibidores de HSP70 ou siRNA leva à activação de caspases e apoptose, sugerindo que a apoptose dependente de HSP70 inibe-caspase em células de cancro do pâncreas, influenciando reservas de cálcio citosólicos e causando lisossomal permeabilização. No entanto, o mecanismo molecular deste fenómeno tem permanecido elusiva [37].

MUC1-C tem sido mostrado para ser uma oncoproteína responsável pela transformação e tumorigenicidade em um número de células cancerosas. MUC1-c também desempenha um papel intensivo em sinalização celular na sequência de uma série de eventos de fosforilação. Vários relatórios também mostram uma acumulação de MUC1-C no citosol das células cancerosas. Demonstrou-se anteriormente que os MUC1-c associados com proteínas de choque de calor e é orientada para a membrana mitocondrial externa [33], [59]. Assim, uma estreita associação da HSP70 e MUC1 existe nas células tumorais.

Em uma tentativa de compreender o mecanismo molecular da célula de sobrevivência e o papel da HSP70 e MUC1 em células de câncer de pâncreas, nós olhamos para a associação de HSP70 e MUC1. Uma vez que a função de HSP70 predominante em qualquer célula é a sua actividade de chaperona, a hipótese de que a HSP70 actua como um transportador de MUC1-c para diferentes compartimentos celulares, tais como lisossomas e mitocôndrias, resultando na protecção destes compartimentos e prevenção da morte da célula. O nosso estudo mostrou que a proteína HSP70 estava associada com MUC-1 e que co-precipitou com MUC1-C (Fig. 3A). Também mostrou que embora MUC1-C foi predominantemente localizadas no citoplasma, uma quantidade significativa, também estava presente nas mitocôndrias e lisossomas (Figura 3 B, C;. Figura S2). A inibição da expressão de MUC1-C por siRNA ou uma inibição da actividade usando o peptídeo inibidor GO-201 resultou numa diminuição da proliferação e viabilidade de células de cancro do pâncreas (Fig. 2) e a actividade da caspase induzida nessas células, o que indica uma activação de vias apoptóticas (Figura S1). Esta inibição também causou lisossomal permeabilização de células de cancro do pâncreas que conduzem à libertação de catepsina B e uma actividade de catepsina B citosólica alta (Fig. 4B, C). expressão de catepsina B em células transfectadas com ARNsi não específica mostram coloração distinta em compartimentos lisossomais (Figura 4 A). Este padrão de coloração distinta é visto para ser difundida uma vez que as células são transfectadas com ARNsi Muc1. Isto é devido à libertação de proteína catepsina B no compartimento citosólico como ensaiado bioquimicamente (Figura 4B). Semelhante lisossomal permeabilização foi também observada quando a expressão de HSP70 foi inibida por siARN (Figura S3). O efeito de inibição da expressão ou actividade de MUC1 foi visto para ser revertidos quando as células foram co-incubadas com o inibidor da catepsina B Ca-074Me. Isto indicou que a libertação de catepsina B a partir de lisossomas de células de cancro do pâncreas resultou no desencadeamento das vias de morte celular. Relatórios anteriores do nosso grupo mostram que a inibição do HSP70 por um inibidor, seja triptolide ou quercetina, também resultou em permeabilização lisossômico semelhante e morte celular por apoptose [37]. No mesmo estudo, verificou-se também que um inibidor da catepsina B foi capaz de inverter os efeitos da inibição de HSP70 em células de cancro do pâncreas, o que indica que é a permeabilização do lisossoma um dos passos anteriores de morte apoptótica nestas células.

Classicamente, a permeabilização da membrana lisossomal (LMP) foi pensado para ser envolvido em mecanismos de morte celular, embora os eventos sequenciais exatas de LMP à morte celular não foram mapeados. Dependendo do estímulo letal, o grau de LMP, a quantidade e tipo de catepsinas libertados no citoplasma, bem como a abundância de inibidores da catepsina, LMP pode provocar uma variedade de morfologias associada a morte variando de apoptose clássica à necrose. Assim, LMP associada com Catepsina translocação pode activar directamente calpa�as e caspases, mas LMP também podem desencadear a via clássica da caspase-MOMP, bem como MOMP- e apoptose independente de caspases. Quais vias letais são estimulados por LMP depende do tipo celular, o estado de imortalização e o fundo genético das células.

No presente estudo, nós propomos um modelo de sobrevivência celular em que a HSP70 actua como um transportador de MUC1-C associando com ele fisicamente e transportá-lo para os lisossomas (mitocôndria) e em células de cancro do pâncreas. A presença de MUC1-c nos lisossomas impede LMP e mantém os lisossomas intactos. No entanto, quando HSP70 ou MUC1 é inibida quer por siARN ou por um inibidor peptídico da proteína MUC1 (que impede a actividade da proteína MUC1 e, assim, a sua associação com qualquer outra molécula), a protecção de lisossomas é perdida, e existe uma extensa LMP, levando a uma libertação de catepsina B e no desencadeamento da morte celular. Se a indução de LMP e libertação de catepsina B ativa vias apoptóticas adicionais envolvendo a mitocôndria precisa ser investigada.

Do ponto de vista clínico, uma abordagem mais específica na exploração de sobrevivência celular MUC1-c-mediada é desenvolver terapêutica agentes que interagem directamente com MUC1-C e bloqueiam a sua função. MUC1-C forma oligómeros através do motivo de aminoácidos CQC no seu domínio citoplasmático, e a actividade é necessária para o transporte nuclear de MUC1-C [60], [61]. O inibidor de péptido GO-201, que contém o motivo de CQC, foi desenvolvido e testado em um número de células cancerosas para bloquear a oligomerização da proteína MUC1 e, assim, inibir a sua actividade e função de [18] sinalização, [46] – [48]. No presente estudo, foi utilizado GO-201 em um modelo do rato do cancro pancreático ortotópico para testar a sua eficácia sobre o tumor pancreático. A linha celular de cancro pancreático agressivo AsPC1 foi usado para gerar tumores pancreáticos ortotópicos. IR-201 (30 mg /kg) foi injectado intraperitonealmente todos os dias durante 26 dias e o experimentado foi terminada no dia 30. A inibição da função de MUC1 por GO-201 foi visto para prevenir o crescimento tumoral e progressão no grupo de tratamento de forma significativa, em comparação com o grupo não tratado. Em estudos anteriores IR-201 foi mostrado como sendo um inibidor específico de MUC1 que não tem efeito sobre qualquer proteína que não o MUC1 [47]. Nossos estudos anteriores haviam mostrado que usando inibidores de HSP70, tumores pancreáticos podem ser regredido

in vivo

[60]. Na continuação dessas investigações, este estudo também mostrou que a inibição da proteína MUC1

in vivo

poderia diminuir a carga tumoral em ratos, confirmando assim que a associação MUC1-HSP70 é um factor essencial para a sobrevivência das células de câncer de pâncreas. Além disso, a inibição desta associação por inibição de qualquer expressão HSP70 ou atividade MUC1 poderia ser de valor terapêutico significativo no câncer de pâncreas.

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