Sumário
A observação de que a galectina-7 (Gal-7) é expresso especificamente nas células mioepiteliais mamária (basal) células levou-nos a investigar se esta proteína é expressa em células basais de outros tecidos. Dado que a mama e cancro da próstata tem notáveis semelhanças biológicos subjacentes e dado o papel importante de células basais no câncer de próstata, que examinou os padrões de expressão e papel dos gal-7 no câncer de próstata humano. Usando tissue microarray, descobrimos que, embora gal-7 é facilmente expressa em células basais em tecido da próstata normal, ele é regulada negativamente em células de câncer de próstata (PCA).
De Novo
expressão da Gal-7 em células de cancro da próstata aumenta a sua sensibilidade a apoptose em resposta a etoposida e cisplatina. A avaliação de um domínio de hidrato de carbono-reconhecimento (CRD) -defective forma mutante da Gal-7 (R7S) mostraram que a capacidade desta proteína de modular a apoptose foi independente da sua actividade CRD. Esta actividade também era independente da sua capacidade de translocar para os compartimentos mitocondriais e nucleares. No entanto, a actividade CRD era necessária para inibir os comportamentos invasivos de células de cancro da próstata.
In vivo
, gal-7 sobre-expressão em células CaP levaram a uma redução modesta mas significativa no tamanho do tumor, enquanto a sua forma mutante aumentado significativamente o crescimento do tumor CRD-defeituoso relação aos controles. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que, embora
de novo
expressão da Gal-7 pode ser um meio interessante de aumentar os fenótipos de células tumorigénicas APC, alterações na actividade desta proteína CRD dirigir um interruptor fenotípica no seu papel em células APC. Esta actividade independente de CRD representa uma mudança de paradigma em nossa compreensão das funções da galectina. O modelo R74S vai ser útil para distinguir funções CRD-dependentes e CRD-independentes de gal-7 na progressão do cancro
Citation:. Labrie M, Vlădoiu M, Leclerc BG, Grosset AA, Gaboury L, Stagg J, et ai. (2015) uma mutação no Reconhecimento de Domínio Carboidratos Drives um Switch fenotípica no papel de galectina-7 em câncer de próstata. PLoS ONE 10 (7): e0131307. doi: 10.1371 /journal.pone.0131307
editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA
Recebido: 09 de janeiro de 2015; Aceito: 01 de junho de 2015; Publicação: 13 de julho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Labrie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi financiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (Grant No. MOP-89697) para YSP (http: //www.cihr-irsc. gc.ca/). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Por favor note que Yves St-Pierre é um membro do Conselho Editorial PLOS. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
A galectina-7 (gal-7) é um gene induzida por p53, que é principalmente expressa em células epiteliais estratificadas [1, 2]. A sua expressão, também pode ser induzida por outros factores de transcrição, incluindo as formas mutantes de p53 e CCAAT /enhancer beta de ligação a proteínas (C /EBP p) [3, 4]. Sua expressão também é regulado por mecanismos epigenéticos, incluindo metilação do DNA [5, 6]. O seu papel na apoptose dos queratinócitos induzida por UVB [7] e na re-epitelização de feridas da córnea [8] apoiar a ideia de que gal-7 é importante para manter a homeostase em células epiteliais. Unsuprisingly, um número de estudos demonstraram que a desregulação da Gal-7 de expressão tem um forte efeito sobre a progressão de vários tipos de cancros de origem epitelial. Em tecidos mamários, por exemplo, Gal-7 é expresso especificamente nas células mioepiteliais (basal), e a sua sobre-expressão em tecidos de cancro da mama correlaciona com a resistência a apoptose e a disseminação das metástases para o osso e pulmão [9]. Superexpressão de gal-7 também está associada a menor sobrevida em pacientes com câncer epitelial de ovário [6, 10] e com a malignidade em pacientes com carcinoma de células escamosas da língua [11]. Estas associações entre níveis anormalmente elevados de gal-7 e mau prognóstico também estão presentes em carcinomas de células escamosas do esôfago e hipofaringe [12, 13]. No entanto, como um certo número de estudos demonstraram, Gal-7, semelhante a outros galectinas, desempenha um duplo papel no cancro e pode ter um papel protector, em certos casos, principalmente ao aumentar a sensibilidade das células cancerosas a estímulos pró-apoptóticos e reduzindo o crescimento celular e na angiogénese. Estas actividades têm sido relativamente bem documentado em gástricas, uroteliais, e cancros do cólon, bem como em carcinoma escamoso cervical [6, 14, 15]. Na verdade, as observações que geneticamente células cervicais, gástricos e do cólon que sobre-expressam gal-7 não conseguem induzir tumores gástricos em ratinhos xenoenxertados sugerem que as drogas epigenética ou 7 Gal-específica terapia de gene pode ser utilizado para suprimir o desenvolvimento de tipos específicos de cancer [6, 14, 15]. Dada a crescente popularidade dos tratamentos epigenéticas para o câncer, é, portanto, imperativo para determinar se gal-7 tem uma função pró ou anti-tumor em qualquer tipo de câncer, principalmente os de origem epitelial.
A vários papéis da Gal-7 em cancros de origem epitelial é actualmente pouco claro e pode estar associada com uma variedade de factores. Deve-se considerar em primeiro lugar a importância da compartimentalização subcelular da Gal-7, o qual foi encontrado no citosólica, mitocondrial, e compartimentos nucleares [15-17]. Gal-3, por exemplo, é capaz de induzir a resistência à apoptose, e esta actividade depende da sua translocação desde o citosol para a mitocôndria [18]. Se tais compartimentalização intracelular, também é importante para a Gal-7 para regular a apoptose é desconhecido. Alternativamente, o duplo papel de Gal-7 pode depender dos seus parceiros de ligação, pois é bem conhecida por se ligar proteínas glicosiladas através do seu domínio de hidrato de carbono-reconhecimento (CRD). Existem indicações crescentes, no entanto, que as galectinas também interagir com proteínas não glicosiladas de um modo independente de CRD [19]. Esta observação tem sido bem documentado para galectinas intracelulares. A característica mais importante das galectinas intracelulares podem ser a sua capacidade para se ligarem directamente aos membros da família Bcl-2 por meio de uma interacção independente de CRD. Esta actividade tem sido mostrado para muitas galectinas, incluindo Gal-7 [16]. A interacção da galectina /Bcl-2 desloca o equilíbrio da actividade entre membros pró-apoptóticos e anti da família Bcl-2 para regular a apoptose [16, 20, 21]. Outras funções CRD-independentes de galectinas incluem processamento de RNA no núcleo [22] e a regulação do ciclo celular progressão [23]. Todas estas funções independentes de CRD dependem de interacções proteína-proteína. Na verdade, certas galectinas, tais como Gal-10, porto marcadamente baixas afinidades para galactósidos e são acreditados para actuar principalmente por meio de outros factores [24]. Estas funções independentes de CRD representam uma mudança de paradigma na nossa compreensão da função de galectina e no desenvolvimento de inibidores específicos da galectina.
A observação de que gal-7 é expresso especificamente nas células epiteliais, particularmente em mioepitelial mamária (basal células) (mas não em células luminais), levou-nos a investigar se este é expresso em células basais de outros tecidos. Dado que a mama e cancro da próstata tem notáveis semelhanças biológicos subjacentes [25] e tendo em conta o importante papel das células basais no câncer de próstata [26], estudamos o padrão de expressão eo papel da gal-7 no câncer de próstata humano.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e animais
PC3 [27] e DU-145 [28] linhas celulares foram uma generosa oferta do Dr. Benoit Ochietti (Universidade McGill, Montreal, QC) e as células LNCaP [29] foram gentilmente cedidas pelo Dr. Thomas Sandersons (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC. A linha de células HaCaT [30] foi fornecida pelo Dr. Thierry Magnaldo (Genética e Fisiopatologia des Cancros Épidermiques, Faculte de Medicina, Nice, França). Todas as linhas celulares utilizadas neste estudo foram originalmente obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). as linhas de células DU-145 e HaCaT foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco . O PC3 e linhas celulares LNCaP foram mantidas numa mistura nutriente F-12K e meio RPMI 1640, respectivamente. Os meios de cultura foram suplementados com 10% (v /soro fetal de bovino v], 2 mmol /l de L-glutamina, 10 mmol de tampão /L de HEPES, e 1 mmol /l de piruvato de sódio. Todos os produtos de cultura de células foram comprados na Life Technologies (Burlington , ON, Canadá). NOD /SCID foram obtidos do Jackson Laboratory. os animais foram alojados em condições estéreis com
ad libitum
acesso a comida e água. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Institutional animal Care e Uso Comissão do Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal
imunohistoquímica
microarrays de tecido foram utilizados para analisar 32 amostras de tecido de adenocarcinoma de próstata, hiperplasia 20, 5 ectasia sacular e 3 câncer tecidos Adjacente normais da próstata (US Biomax, Rockville, MD, EUA e LifeSpan Biosciences, Seattle, WA, EUA). imunocoloração reações de gal-7 foram realizadas utilizando um imunohistoquímica Descoberta XT automatizado (Ventana Medical Systems). seções desparafinados foram incubadas em solução de células condicionado, pH 8,0 (Ventana Medical Systems), para a recuperação de antigénio e, em seguida, coradas durante 60 min com uma Gal-7 anticorpo policlonal anti-humana (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) diluída a 1: 150. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina. As secções foram digitalizados com alta resolução usando um scanner Nanozoomer Patologia digital (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).
Imunofluorescência
As células foram fixadas em 3% (w /v) de paraformaldeído durante 15 min , permeabilizadas em 0,1% (v \\ v) de PBS /Triton X-100 durante 5 min e bloqueadas durante a noite a 4 ° C em 1% (w /v). PBS /BSA (PBA). Um anticorpo de cabra anti-humano Gal-7 (diluído 1: 750) e anticorpo primário de coelho anti-cabra Alexa Fluor 488 (diluído a 1: 500) anticorpo secundário foram usadas (Life Technologies). actina filamentosa foi corado com Alexa Fluor 594 conjugado com faloidina (diluição 1: 500; Life Technologies). Todos os anti-soros foram diluídos em 1% (w /v) de PBA, e todos os passos de lavagem foram realizadas com PBS. Os núcleos foram coradas com ouro Prolongar Antifade Reagente com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Life Technologies). As células foram visualizados sob um microscópio confocal Carl Zeiss LSM780, e imagens digitalizadas foram gerados usando software de Carl Zeiss Zen (Zeiss, Jena, Alemanha).
Isolamento de ARN e RT-PCR
O ARN celular total foi isolado a partir de células utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Da primeira cadeia de ADNc foi preparada a partir de 2 ug de ARN celular, num volume total de reacção de 20 uL, utilizando a transcriptase inversa Omniscript (QIAGEN, Mississauga, ON, Canadá). Após a transcrição reversa, humana
gal-7
(ID gene 3963, iniciador com sentido: 5′-TCC CAA TGC CAG CAG GTT CCA TGT-3 ‘e iniciador anti-sentido: 5’-GAA CCG GTC GTC TGA CGC GAT GAT-3 ‘) e
GAPDH
(ID gene 2597, iniciador com sentido: 5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′ e iniciador anti-sentido: 5′-CAG AAG TGG TGG TAC CTC TTC CGA -3 ‘) foram amplificados ADNc sob as seguintes condições: 94 ° C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 40 seg, 60 ° C durante 40 segundos, e 72 ° C durante 40 segundos e, em seguida, uma extensão final passo a 72 ° C durante 10 min. A PCR foi realizada em um termociclador (MJ Research, Watertown, MA). Os produtos amplificados foram analisados em 1% (w /v) de geles de agarose por electroforese em gel seguido por coloração com SYBR Seguro (Life Technologies).
Geração de transfectantes estáveis que expressam gal-7
Para obter estável DU-145 transfectantes que expressam gal-7
em peso ou Gal-7
R74S, os ADNc que codificam para o tipo selvagem ou mutada do gene (R74S) humana Gal-7 foram clonados no vector de expressão eucariótica sRa (gentilmente fornecida pelo Dr. François Denis) como anteriormente descrito [17] As células de controlo foram gerados utilizando um vector vazio sRa. As transfecções foram realizadas com Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). Após 48 h de cultura, as células transfectadas foram deixadas crescer em meio completo contendo 2 ug /ml de puromicina. As colónias individuais foram expandidos e a expressão Gal-7 foi monitorizada por análise de Western blot. Um mínimo de dois clones de cada tipo foi utilizado para confirmar os resultados.
análise de Western blot
Para extractos de células inteiras, as células foram homogeneizados e novamente suspensas em ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) tampão ( Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá), contendo um cocktail de inibidores de protease (Roche, Mississauga, ON, Canadá). As mitocôndrias e núcleos foram isolados usando um kit de isolamento mitocondrial (Thermos Scientific) e o kit de extracção nuclear (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá), respectivamente, de acordo com as instruções dos fabricantes. Quantidades iguais de-célula inteira, citoplasmática, mitocondrial ou extractos nucleares foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canadá). As membranas foram primeiro bloqueadas com 5% (w /v) de leite em PBS /0,5% Tween 20 (v /v) durante 60 min à temperatura ambiente e subsequentemente destruídos durante a noite numa solução contendo 3% de PBA, 0,5% de Tween 20 e o seguinte anticorpos: um anti-ratinho de cabra Gal-7 anticorpo policlonal (diluído 1: 1000, R D Systems), um anti-poli (ribose de ADP) polimerase (PARP) -1 anticorpo (p25) de coelho policlonal (1: 5000 ; Epitomics, Burlingame, CA, EUA), um ratinho anti-β-actina (1: 20000, Sigma-Aldrich), um anticorpo de coelho anti-COX IV (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), uma de coelho anti-tubulina (1: 1000; Cell Signaling Technology) ou um ratinho anti-lamina a /C (1: 1000; Cell Signaling Technology) anticorpo. anticorpos secundários incluíram burro rábano conjugado com peroxidase anti-coelho (GE Healthcare, Baie-D’Urfe, QC, Canadá), de burro anti-cabra (R D Systems) ou ovelha anti-rato (GE Healthcare) IgG. A detecção foi realizada através do método de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare).
Microscopia electrónica
As células foram fixadas numa solução de 0,1% (v /v) de glutaraldeído e 4% (w /v) de solução de paraformaldeído e incluídos em resina de Spurr. Secções ultrafinas foram colocadas em grelhas de níquel e incubadas em metaperiodato de sódio. As amostras foram, em seguida, bloqueadas em 1% de PBA durante 5 minutos e incubadas durante 60 min com um Gal-7 anticorpo de cabra anti-humano policlonal (1: 150) seguido de incubação com um anticorpo secundário de coelho anti-cabra de 10 nm de ouro-conjugado ( 1:20, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA). As amostras foram contrastadas com acetato de uranilo e citrato de chumbo antes de visualização sob um microscópio electrónico de transmissão Hitachi H-7100.
[
3H] -timidina incorporação
A proliferação de células foi determinada medindo a incorporação de [
3H] -timidina. As células foram semeadas em triplicado a uma densidade de 2 x 10
3 células /cavidade em uma placa de 96 poços e subsequentemente incubadas com ou sem 5 uM de cisplatina durante 96 h. Após 80 h de incubação, 1 uCi de [
3H] -timidina foi adicionada a cada poço. No final do período de incubação, as células foram recolhidas com um colector de células semi-automático (Skatron Instruments, Lier, Noruega) e transferido para um Impresso Filtermat A (Wallak, Turky, Finlândia). A radioactividade incorporada foi determinada utilizando um RackBeta (LKB, Turky, Finlândia) contador de cintilação.
ensaio de invasão
invasão celular induzida pelo soro foi examinada utilizando um poço-24 câmara de invasão de Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá) com uma membrana mm de poros 8. Um total de 5 x 10 4
células foram incubadas no interior da câmara superior em meio isento de soro. A câmara inferior continha meio suplementado com soro fetal bovino a 10%. Após 24 h de incubação, a superfície superior do inserto foi esfregado suavemente com um cotonete de algodão para remover as células não migram. As células que tinham migrado para a superfície inferior da membrana foram coradas com azul de toluidina e contados separadamente por microscopia. Foram obtidos
ferida risco de cura ensaio
As monocamadas confluentes semeando 1 x 10
5 as células em uma placa de 24 poços no dia anterior à experiência. Um zero foi feito com a ponta da pipeta na monocamada de células, seguido de uma lavagem com PBS para remover os restos celulares. Imediatamente após 24 h e depois do passo de lavagem com PBS, os campos microscópicos foram fotografadas, e a largura zero foi medida usando o software Image J.. Para imagem de células vivas, um dia antes da experiência, de 4 x 10
5 as células foram semeadas numa placa de 6 poços de cultura de vidro de fundo (MatTek Corporation, Ashland, MA, EUA). Após a zero foi feito, a placa foi transferida para uma incubadora PM S1, e a migração foi visualizada sob um microscópio confocal Carl Zeiss LSM780 (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canadá). As imagens foram capturadas a cada 10 min durante 2 horas. Para cada tipo de célula, os movimentos de 30 células separadas foram medidos. movimento celular foi analisada com a seguinte imagem J plugins:. rastreamento manual e ferramenta de quimiotaxia
A proliferação celular ensaio
Como um controlo para a proliferação celular durante o teste de ensaio de invasão e ferida zero cura, um total de 2,5 x 10
4 células foram semeadas numa placa de 12 poços (Fisher Scientific). Nos tempos indicados, as células foram lavadas com PBS, tripsinizadas, coradas com azul de tripano e contadas utilizando um hemocitómetro.
Produção de proteínas recombinantes
ADNc Gal-7 foi clonado em pET-22b (+), utilizando as enzimas de restrição Ndel e HindIII. A proteína foi produzido em
E
.
coli BL21 (DE3) a 37 ° C. Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (
IPTG) (1 mM) foi adicionada à cultura de bactérias a uma DO
600 nm de 0,6-0,7, e as bactérias foram ainda incubadas durante 4 h. Os sedimentos bacterianos foram ressuspensos em tampão de lise (0,7 mg /lisozima ml, Tris 10 mM, pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM e um cocktail de inibidor de protease), incubadas durante 1 h a 37 ° C e centrifugou-se durante 30 min a 15.000 rpm (4 ° C). O sobrenadante foi em seguida filtrada e aplicada a uma coluna de lactose-agarose e a proteína foi eluída em fracções de 1 ml com uma solução de lactose 150 mm. As fracções purificadas foram analisadas por SDS-PAGE. Gal-7 foi dializada contra fosfato de potássio 20 mM a um pH de 7,2 para todas as experiências subsequentes.
array Glycan
Uma matriz de glicanos de mamíferos (V5.2) foi realizada pelo Consórcio para Glycomics Funcionais ( CFG). Resumidamente, recombinante gal-7
em peso e gal-7
proteínas R74S foram conjugados com FITC e testado na versão 5.2 da matriz impressa. Esta matriz consistia de 609 glicanos em repetições de 6. As listas dos glicanos e os seus ligantes utilizados nas diferentes versões da matriz pode ser encontrada em https://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh.shtml . FITC-conjugado Gal-7 foi incubada com os açúcares, e unidades de fluorescência relativas (RFUs) foram medidos. Para eliminar alguns dos falsos sucessos que continham um único ponto muito alta ou baixa, os mais altos e os mais baixos pontos de cada conjunto de seis réplicas foram removidas. Por conseguinte, as médias de 4 incluem valores em vez de 6.
Ensaio de ligação
Resumidamente, um isotiocianato de fluoresceína (FITC) /solução de DMSO foi adicionada a 7-Gal recombinante num 0,1-H de NaHCO
3 (9,2 de pH) da solução e, em seguida, incubadas durante 2 h à temperatura ambiente sobre um rolo. FITC-conjugado Gal-7 foi então purificado utilizando uma coluna PD-10, Sepharose (GE Healthcare) e eluiu-se com PBS contendo 0,01% (v /v] de azida de sódio. Para medir FITC-Gal-7 se ligar a superfície da célula, 2,5 x 10
5 as células foram incubadas durante 30 min com as concentrações indicadas de Gal-7 e, em seguida, lavada duas vezes com PBS e ressuspensas em 500 ul de PBS. para ensaios de competição, 0,1 M β-lactose foi adicionada às células, que foram depois incubadas com gal-7. As amostras foram analisadas por FACSCalibur (BD Biosciences) e fluindo Software conjugado com FITC.
in vivo
experimentos
Uma mistura de 3 clones independentes (2 X 10
6 células) para cada transfectante foi injectada subcutaneamente em ratinhos NOD 6 semanas de idade /SCID. as medições do tumor foram obtidas duas vezes por semana. no dia 61, os ratinhos foram sacrificados e os tumores primários foram colhidos e encaixe -frozen em nitrogênio líquido.
a análise estatística
a significância estatística dos experimentos foi avaliada por meio de testes t de Student não pareado. os resultados foram considerados estatisticamente significativos em P ≤ 0,05.
resultados de
Gal-7 expressão em tecidos da próstata humanos e linhas celulares de cancro
Gal-7 expressão em tecidos da próstata humanos não foi previamente relatado. Usando imunohistoquímica (IHC), primeiro investigou o padrão de gal-7 expressão em tecidos da próstata normais. Os nossos resultados mostraram expressão nuclear e citoplasmática forte nas camadas celulares basais de glândulas prostáticas normais, sem coloração observada nas células epiteliais luminais (Fig 1A). Em seguida, foi investigada a presença do Gal-7 em vários tipos de doenças malignas da próstata (incluindo 32 adenocarcinomas da próstata) utilizando microarrays de tecido e comerciais encontrada a expressão da proteína gal-7 negligenciável nos tecidos de tumor (Figura 1B e 1C). A baixa expressão nos tecidos ACP foi consistente com os padrões de expressão encontrados durante nossas investigações de gal-7 expressão no mRNA e os níveis de proteína nos modelos de linhas celulares mais comuns de câncer de próstata. Immunoblotting experimentos demonstraram que nenhuma destas linhas celulares expressavam níveis facilmente detectáveis de Gal-7; No entanto, o ARNm foi expressa a um nível baixo mas detectável em células PC3 (Figura 1). Tomados em conjunto, estes resultados mostraram que embora Gal-7 é facilmente expressos em células basais no tecido da próstata normal, é completamente ausente em células de cancro da próstata.
imuno-histoquímica (IHC) coloração da Gal-7 em 3-iM secções espessas de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (a) e tecidos da próstata saudável (B) associados com desordens patológicas da próstata. (C) semi-quantitativo de RT-PCR e (D) Análise por Western blot da Gal-7 expressão em DU-145, PC3 e linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP. A linha celular de queratinócitos HaCaT foi usada como um controlo positivo. GAPDH e β-tubulina foram utilizados como controlos de carga. LC: células luminais, BC: células basais, e ECM:. Matriz extracelular
Produção e caracterização de tipo selvagem e CRD-defeituoso gal-7 proteína
Para investigar as funções da Gal-7 em células de cancro da próstata e para determinar a importância da sua CRD, foi gerada uma série de transfectantes estáveis que expressam o tipo selvagem Gal-7 e uma forma mutada (R74S) da proteína (Figura 2A). Esta mutação é conhecido por inibir a capacidade da Gal-7 se ligar a lactose e a reduzir a sua translocação desde o citosol para a mitocôndria e /ou o núcleo [17]. Nosso usando uma solução de análise prévia espectroscopia de RMN mostrou que a mutação induzida R74S apenas mudanças limitadas e locais gal-7 dobrável. Para continuar a determinar a extensão em que o CRD da Gal-7 é interrompido pela mutação R74S, comparou-se as suas propriedades de ligação aos do tipo-selvagem de Gal-7, utilizando uma matriz de glicanos CFG (versão 5.2) [31]. A lista inteira de glicanos testados e os resultados dos ensaios de ligação podem ser encontrados on-line (https://functionalglycomics.org/). Os resultados confirmaram que a mutação R74S suprimida actividade CRD independente dos motivos de glicano avaliadas (Figura 2B, Quadro S1). Esta supressão da actividade CRD foi confirmada por análise de citometria de fluxo da ligação de FITC-recombinante marcada com Gal-7
em peso e Gal-7
R74S nas superfícies de DU 145 células de cancro de próstata (fig 2C e 2D) . Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que R74S abole a atividade CRD de gal-7 humana.
(A) vista 3D do gal-7
em peso e gal-7
R74S CRDs na presença de lactose. (B) Uma matriz de glicanos foi utilizado para verificar a ligação de Gl-7
em peso e Gal-7
R74S para uma grande variedade de açúcares. O gráfico mostra a ligação de gal-7
em peso e gal-7
R74S aos açúcares. Apenas RFUs maior do que 10.000 são apresentados. Os nomes de açúcar estão listados na Tabela S1. As barras de erro representam SDS (n = 6). A análise de citometria de fluxo mostrando a ligação de Gl-7
em peso e Gal-7
R74S-se às superfícies de células DU-145 (c) na ausência ou (D) presença de β-lactose 0,1 M. Os ensaios de ligação foram realizados utilizando as concentrações indicadas de marcado com FITC Gal-7 recombinante. MFI: intensidade de fluorescência média. Os resultados representam três experiências independentes.
Caracterização da localização intracelular do tipo selvagem gal-7 e gal-7
R74S
Para investigar o papel da gal-7 e sua CRD no cancro da próstata, DU-145 transfectantes que expressam tanto gal-7
R74S foram gerados em peso ou gal-7. transfectantes de controlo gerados (usando vectores de expressão de vazios) não expressaram níveis detectáveis de Gal-7 (figura 3A e 3B). Imunotransferência de fracções enriquecidas mitocondrial e nuclear mostrou expressão detectável da Gal-7
em peso no citosol, mitocôndrias e núcleos de células DU-145 (Fig 3C e 3D). Em contraste, não houve expressão detectável da Gal-7 na mitocôndria de transfectantes expressando Gal-7
R74S. Ambas as proteínas foram encontrados no meio extracelular das células (Figura 3E). Electron análise de microscopia de células DU-145 confirmaram a expressão da Gal-7
em peso, no citossol, o núcleo, e de membrana mitocondrial externa, enquanto que a expressão da Gal-7
R74S foi restringida para o citosol (S1 Fig ). Curiosamente, o elétron análise microscópica revelou a presença de gal-7
em peso e gal-7
saliências R74S-ricos na membrana citoplasmática (S1 Fig) consistente com relatórios anteriores, sugerindo que os associados Gal-7 com a actina citoesqueleto para regular a motilidade celular [10, 32, 33].
(a) análise de mancha de Western mostrando a expressão da Gal-7 em vários estáveis DU-145 clones transfectados com os vectores de expressão que codificam para o tipo selvagem e mutado gal -7. Os controlos incluíram células transfectadas com os vectores vazios SRa. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) imagem confocal mostrando a distribuição intracelular da Gal-7 em DU-145 transfectantes. (C-D) Análise de Western blot que mostra a expressão de Gal-7 em citosólica, fracções nucleares e mitocondriais preparadas a partir de células DU-145. β-tubulina, IV e COX lamina A /C foram utilizados como citosólica, mitocondrial e marcadores nucleares, respectivamente. (E) a análise de Western blot que mostra a secreção de gal-7 na mídia extracelular de células DU-145 expressando gal-7
em peso ou gal-7
R74S. expressão de p-tubulina foi monitorizada para excluir a possibilidade de lise celular. extractos de proteína intracelular de controlo de células DU-145 e os sobrenadantes de células HaCaT foram utilizados como controlos positivos para a expressão β-tubulina e a secreção de Gal-7, respectivamente. Todos os resultados representam três experiências independentes, incluindo um mínimo de dois DU-145 clones independentes.
Gal-7 promove a apoptose em células de cancro da próstata
Vários estudos têm relatado que a expressão ectópica de Gal-7 torna as células cervicais, gástricos e do cólon mais sensíveis a apoptose induzida por fármacos pró-apoptótico [15]. Para determinar se esta conclusão também é verdade em células de cancro da próstata, DU-145 transfectantes foram tratados com doses crescentes de fármacos pró-apoptóticos e analisados para a clivagem de PARP-1, que é um marcador de apoptose utilizada [34]. Os nossos resultados mostraram que a expressão ectópica da Gal-7 aumentaram a clivagem de PARP-1 induzida por etoposido em comparação com as células de controlo (Fig 4A). Resultados semelhantes foram obtidos quando a fragmentação dos núcleos em células apoptóticas foi visualizado com coloração DAPI (Fig 4B). A capacidade da Gal-7 para aumentar a sensibilidade de células DU-145 a apoptose também foi observada utilizando a cisplatina como um fármaco pró-apoptótica (Fig 4C). Curiosamente, Gal-7
R74S foi tão eficaz como Gal-7
em peso para aumentar a sensibilidade de DU-145, para ambos os fármacos pró-apoptóticos. Em ambos os casos, a localização intracelular da Gal-7 permaneceu inalterado durante a indução da apoptose (Fig S2). Usando uma 3H (
] ensaio de incorporação de timidina, que também medida a proliferação dos transfectantes na ausência ou na presença de cisplatina. Descobrimos que tanto Gal-7
em peso e Gal-7
R74S-expressando DU-145 células proliferaram com as mesmas taxas, em comparação com células de controlo, em condições normais, mas proliferaram de forma mais lenta na presença de cisplatina (Figura 4D), o que é consistente com a capacidade da Gal-7 para promover a apoptose induzida por drogas. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a Gal-7 sensibiliza células DU-145 de agentes pró-apoptóticos independentes da sua actividade e a sua CRD compartimentalização intracelular.
(a) células foram incubadas durante 16 horas com as concentrações indicadas de etoposido e testado para apoptose por medição PARP-1 de clivagem por western blot. (B) a apoptose foi confirmada pela contagem do número de células com núcleos fragmentados visualizado por coloração com DAPI. (C) Análise de PARP-1 clivagem em células Du-145 tratados durante 16 h com a concentração indicada de cisplatina. (D) a proliferação celular de DU-145 células tratadas com ou sem 5 uM cisplatina medido por (
3H] -timidina. Todos os resultados representam três experiências independentes, incluindo um mínimo de dois DU-145 clones independentes. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 e *** P ≤ 0,001.
Gal-7, mas não R74S reduz comportamentos invasivos de DU-145 células
A seguir, investigou se gal-7 pode modular o comportamento invasivo das células DU-145 usando um padrão
in vitro
ensaio de invasão Matrigel. Descobrimos que a expressão ectópica da Gal-7
wt reduziu significativamente os comportamentos invasivos de células DU-145 em comparação com células de controlo sem Gal-7 (Figura 5A). Uma diferença semelhante não foi observado para células DU-145 que expressam gal-7
R74S. Porque comportamentos invasivos de células pode ser afetada pela motilidade celular, usamos imagens de células vivas para medir movimentos celulares durante um ensaio de cicatrização de feridas zero (Fig 5B). Os nossos resultados mostraram que as células DU-145 expressando velocidade célula Gal-7
wt significativamente reduzida em comparação com células de controlo que faltam Gal-7 ou células que expressam gal-7
R74S (Figura 5C). Estes gal-7
wt-expressando células também tinha acumulado inferior e distâncias euclidianas da migração (Fig 5D e 5E). A direcionalidade das células DU-145 não foi afetada pela expressão das gal-7
em peso ou gal-7
proteínas R74S (Fig 5F). O uso de um ensaio de ferida cura zero padrão confirmaram ainda que Gal-7
em peso reduziu a motilidade celular das células DU-145. Mais uma vez, não foi observado um efeito semelhante para o galão-7
R74S mutante (S3 Fig).