Abstract
Fundo
câncer de ovário espontânea em frangos se assemelha a tumores humanos, tanto histologicamente e bioquimicamente. O objetivo era determinar se existem diferenças no conteúdo de linfócitos entre ovários normais e tumores do ovário em galinhas como base para novos estudos para compreender o papel da imunidade na progressão do cancro do ovário humano.
Métodos
Galinhas foram selecionados usando o ultra-som Doppler escala e cor cinza para determinar se eles tinham morfologia normal ou tumor. As células foram isoladas a partir de ovários (n = 6 galinhas) e os números de linfócitos foram determinadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos para CD4 e CD8 aviária T e células B (Bu1a). seções ovarianos de um outro conjunto de galinhas (n = 26) foram avaliados para verificar tipo de tumor e estágio e contagem de células CD4, CD8 e Bu1a células imunocoradas por análises morfométricas.
Resultados
T e B As células foram mais numerosas nos tumores de ovário do que em ovários normais por citometria de fluxo e imuno-histoquímica. Havia menos células CD4 + do que CD8 + e Bu1a + células em ovários normais ou tumores ovarianos. As células CD8 + foram a célula T subtipo dominante tanto estroma ovariano e nos folículos do ovário em comparação com as células CD4 +. células Bu1a + foram consistentemente encontradas no estroma dos ovários normais e tumores de ovário, mas não foram associados com folículos. O número de células do sistema imunológico era mais elevada em tumores serosos fase tardia em comparação com endometrioid e tumor mucinoso.
Conclusões
Os resultados sugerem que semelhante ao câncer de ovário humano existem células comparativamente mais imunes em frango de ovário tumores do que nos ovários normais, e o conteúdo da célula imunitária mais elevada ocorre em tumores serosas. Assim, este estudo estabelece uma base para um estudo mais aprofundado de respostas imunes de tumor num modelo espontâneo de cancro do ovário que irá facilitar estudos sobre o papel da imunidade na progressão do cancro do ovário precoce e utilização da galinha em ensaios pré-clínicos de vacinas.
Citation: Bradaric MJ, Penumatsa K, Barua A, Edassery SL, Yu Y, Abramowicz JS, et al. (2013) As células imunes no normal Ovário e espontâneo ovário tumores na galinha poedeira (
Gallus domesticus
) Modelo de câncer de ovário humano. PLoS ONE 8 (9): e74147. doi: 10.1371 /journal.pone.0074147
editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América
Recebido: 22 Março, 2013; Aceito: 26 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Bradaric et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo NIH R01AI055060 (JL), OC073325 DOD (JL), a Fundação Segal (JL) e da Fundação Prevent Cancer (AB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Fundo
múltiplos elementos estão envolvidos no desenvolvimento e progressão do cancro incluindo genética, epigenética, ambientais e factores imunes [1], [2]. Embora seja evidente que a imunidade desempenha um papel importante no cancro e que controlar as respostas imunitárias a tumores tem um potencial significativo para a prevenção e tratamento do cancro, a resposta imune a tumores não é bem compreendido. Um conteúdo de tumor mais elevada de células T CD3 +, [3] ou CD8 + células T citotóxicas [4] em tumores de fase tardia está associada a um melhor prognóstico para pacientes de cancro do ovário, enquanto um teor relativamente elevado de células T reguladoras está associada com um prognóstico pior [5 ], sugerindo que o número e tipos de células imunes são importantes para os resultados clínicos. Evidências recentes sugerem que as células B CD20 + são encontrados em ambos os tumores do ovário de fase precoce e tardia e que os números mais elevados pode ser relacionada com melhores taxas de sobrevivência de cinco anos [6]. No entanto, há dados conflitantes sobre o papel da imunidade na prevenção ou progressão do tumor e tem-se sugerido que o papel funcional da imunidade alterações durante a progressão tumoral [7].
o cancro do ovário é normalmente diagnosticada em estágios avançados e possui uma alta taxa de recorrência e mortalidade, pois não existem métodos convencionais de detecção precoce. Como o câncer de ovário fase inicial é difícil de detectar, a maioria dos estudos utiliza amostras de fase tardia e, portanto, há relativamente pouca informação sobre a imunidade na iniciação e progressão precoce de câncer de ovário. Os estágios iniciais de câncer de ovário são mais facilmente estudado em modelos animais e esses modelos representam uma abordagem alternativa para elucidar a etiologia do tumor e o papel da imunidade no câncer de ovário. Maior desenvolvimento de modelos pré-clínicos de cancro do ovário é necessária para facilitar o desenvolvimento e teste de vacinas para o tratamento de câncer de ovário.
Há uma série de modelos de roedores de câncer de ovário com base em tumores geneticamente modificados ou quimicamente induzida ou sobre implantação de tumores humanos em SCID (Imunodeficiência Combinada grave) ou RAG (gene ativação Recombinação) camundongos deficientes [8]. No entanto, a maioria dos modelos de roedores não desenvolvem câncer de ovário espontaneamente e aqueles que muitas vezes produzem apenas um histotipo [8], [9], [10], [11], [12]. Embora estes modelos são úteis para a compreensão dos factores genéticos e ambientais que contribuem para cancros e para o desenvolvimento de estratégias de quimio-terapêuticos, eles são menos adequados para a investigação de eventos espontâneos precoces relacionadas com imunologia tumor porque não está claro se eles sofrem o mesmo singular ou eventos espontâneos que levam a tumores ovarianos.
a galinha poedeira (
Gallus domesticus
) preenche esta lacuna, uma vez que espontaneamente desenvolve tumores ovarianos progressivas com metástases fase posterior, e produção de ascite [13]. Nós e outros relataram que a galinha poedeira é um modelo válido para o estudo do cancro do ovário humano [14], [15], [16], [17], [18]. tumores ovarianos espontânea na galinha compartilham muitas características do câncer de ovário humano. A histologia e morfologia de galinha e tumores do ovário humanos são semelhantes; tumores de galinha geralmente têm serosa, endometrioid, de células claras e histologia mucinoso comparável aos subtipos epiteliais frequentes de câncer de ovário humano [14]. Mostrámos anteriormente que os tumores do ovário em galinhas poedeiras também pode ser detectada por ultra-som transvaginal utilizando o tipo de equipamento vulgarmente utilizado em clínicas de [19], [20]. Quando combinado com agentes de contraste [21], fomos capazes de avançar a fase em que a angiogênese do tumor de ovário e pequenos focos tumorais microscópicas foram detectados. métodos, assim, não-invasivos para a seleção de galinhas para estudos e para monitorizar a progressão do tumor estão disponíveis. Além disso, ocorre naturalmente mutações genéticas, tais como p53, o RAS e Her2 /neu são encontrados em tumores de galinha [22], [23], [24]. Da mesma forma, existe uma lista cada vez maior de proteínas expressas em tumores do ovário de galinha, tais como CA125 [25], mesotelina [26], a COX 1 [27], [28], selénio Binding Protein 1 [29], E-caderina [30] e VEGF, que são alteradas de forma semelhante em tumores do ovário humanos [17], [20], [31]. É também surpreendente que a aspirina [32] e progesterona exógena [33] reduzir parcialmente tumores ovarianos semelhantes aos seres humanos. O câncer de ovário na galinha tem muitas das facetas da doença humana e, portanto, é um modelo válido.
O modelo de galinha poedeira é particularmente apropriado para estudos de câncer de ovário e imunidade. A galinha é bem conhecido por contribuições seminais para a nossa compreensão da imunologia, incluindo a primeira evidência de diferentes linhagens de linfócitos T e B [34]. No ovário, há um aumento nas células T do folículo associado, macrófagos e células B durante a maturação do ovário e, em seguida, uma diminuição com o envelhecimento [35], [36], [37], [38]. Além disso, o soro das galinhas com tumores ovarianos contém anticorpos anti-ovarianos e anti-tumorais [39] semelhantes às mulheres [40], [41], [42]. Assim, o modelo galinha poedeira representa um modelo viável para estudar a imunidade e câncer de ovário fase inicial.
No entanto, os tipos e conteúdo de células imunes em galinhas com tumores ovarianos e as alterações comparadas com ovários normais são desconhecidos. Portanto, o objetivo deste estudo transversal foi descrever e quantificar as células T e B associados com tumores de ovário na galinha poedeira, a fim de estabelecer uma base para estudos de mecanismos de imunidade no cancro do ovário humano.
Materiais e Métodos
animal Care e Selecção
galinhas White Leghorn (3 anos de idade, a estirpe W96) foram alojados na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign exploração avícola no Departamento de Ciência animal . Alimentos e água foram fornecidos
ad libitum Comprar e galinhas foram mantidos em um 17:7 horas (luz: escuro) programação. morfologia ovariana e angiogênese foram avaliados utilizando a ultra-sonografia transvaginal, como descrito anteriormente [19] e os dados foram usados para selecionar as galinhas com ovários normais ou tumores ovarianos. Para a citometria de fluxo, células de ovário de toda a foram preparadas sem qualquer outra avaliação histológica. Para os estudos de imuno-histoquímica, galinhas foram igualmente seleccionados. Normal ou tumor histologia e tumor etapa foram verificados e tipo de tumor foi determinada usando hematoxilina e eosina (H E) cortes corados de ovário, como descrito anteriormente [14]. Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional animais no Rush University Medical Center (número 08-011) e da Universidade de Illinois (número 05147).
Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo foi utilizado para linfócitos fenótipo em ovários de galinha (n = 6) e do baço (n = 2). As células T foram detectadas com as células B de CD4-FITC e CD8-PE (Southern Biotech, Birmingham, AL) e foram detectados com anticorpos anti-Bu1a (Abcam, Cambridge, MA) conjugado com aloficocianina (APC) (sistema de rotulagem Zenon, Invitrogen, Carlsbad CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os linfócitos do ovário foram detectados utilizando-passo único de citometria de fluxo [43]. Os controlos positivos consistiram de linfócitos de baços e controlos negativos incluíram substituição de anticorpos do mesmo isotipo para os anticorpos primários (dados não mostrados). O número total de células imunitárias, em seguida, foi calculada a partir da citometria de fluxo de dados e as contagens de células totais foram obtidos a partir do extracto de tecido.
ovários inteiros foram cortados em pedaços de 2-3 cm e as células foram libertadas por digestão enzimática usando colagenase (2000 UI /1 g de tecido; Worthington, Lakewood, NJ), DNase I (200 mg; StemCell Technologies, Vancouver, BC), e meio DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (40 ° C, 2 horas com agitação). Os tubos foram centrifugados (100 x g, 5 minutos). O sedimento celular foi suspenso em fosfato frio solução salina tamponada (PBS) contendo EDTA 1 mM (1 mL, 2 minutos), centrifugadas (100 x g, 5 minutos) e o sedimento ressuspenso em Solução Salina Equilibrada de 10 mL de Hank (HBSS) contendo 2 soro fetal de bovino% (FBS). As células foram contadas com um contador Coulter para definir 5-11 microns. As células (6 × 10
6) foram marcadas e fixadas em paraformaldeído a 2% e 5 × 10
5 células /amostra foram analisadas utilizando um FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Os dados foram analisados com CellQuest 1 software (BD Biosciences, San Jose, CA).
Preparação de Tecidos para Histologia e imunohistoquímica
Os ovários foram fixados em formol a 10% PBS-tamponada e embebidos em parafina. H seções E manchadas de ovário foram analisadas por um patologista credenciado no Rush University para o tipo de tumor e estágio com base em semelhanças com morfologia humana como descrito anteriormente [14]
Uma parte de cada ovário foi também incorporado. em composto OCT (Tissue Tek, Sakura, Torrence, CA), congelados rapidamente em metanol, arrefecida com gelo seco e armazenadas a -80 ° C. Vinte e quatro horas antes do seccionamento num crióstato Leicha, os tecidos foram apresentadas a -20 ° C e aderida a uma fase de metal com a incorporação de outubro composto. Os tecidos foram seccionados (10 uM), fixadas em acetona fria (4 ° C, 20 minutos), à temperatura ambiente (30 minutos) e armazenado a -80 ° C até à sua utilização seco ao ar.
A imuno-histoquímica
As células imunes foram detectados com anticorpos contra marcadores de galinha células T CD4, células T CD8 (Southern Biotech, Birmingham, AL) e células B (Bu1a /chB6) (Abcam, Cambridge, MA). As secções foram imunocoradas usando um kit com diaminobenzidina (DAB) como substrato (Vector Labs, Burlingame, CA). Os cortes foram lavados (15 minutos), contrastadas com hematoxilina (Fisher Scientific, Rockford, IL), desidratadas, aplicadas a slides e secou-se (37 ° C, 16 horas). A microscopia foi realizada em um microscópio Nikon Microphot FXA.
Análise morfométrica das células imunes
seções ovarianos foram coradas com anticorpos contra CD4, CD8, e Bu1a e foram examinadas usando um microscópio de luz (Olympus BX -41; Olympus America Inc., Center Valley, PA). As células foram contadas utilizando imunopositivas MicroSuite Cinco software (Olympus America Inc.). Resumidamente, um mínimo de três secções de cada ovário de vinte e seis galinhas foi contado por marcador de células imunitárias (CD4, CD8 e Bu1a) para um total de 243 lâminas (3 × 27 desliza ovários × 3 marcadores).
células imunitárias totais foram contados em cada secção. Para cada secção, de 5 a 20 campos aleatórios foram contadas com uma ampliação de 20x (ou 84000? M
2), dependendo do tamanho do exemplar. As contagens de células foram calculadas para cada secção para normalizar os dados uma vez que um número diferente de campos foram contadas em diferentes secções de tamanho. Três seções foram calculados para cada galinha para cada marcador. Os valores para cada grupo (, precoce e tumores tardios normais) foram então calculados e expressos como o número médio de células em 8,4 × 10
4? M
2 de tecido de ovário. designações de grupo (câncer em estágio normal, precoce e tardia) foram baseadas na avaliação histológica de H . E cortes corados seguinte estadiamento de câncer de ovário galinha [14] previamente definido
Além disso, o número de células nos folículos de as mesmas secções foram contadas e expressas como o número de células do sistema imunológico por 2 × 10
5 m
2 de área folicular. As células imunes em (morte) folículos atréticos [44] foram evitados uma vez que eles são conhecidos por conterem um influxo de linfócitos presumivelmente em resposta a apoptose [45], [46].
Análises Estatísticas
Os testes estatísticos foram realizados usando SPSS (Chicago, IL). O teste de Mann Whitney foi utilizado para determinar se diferenças médias foram significativas com p 0,5 considerada significativa
foram selecionados
Resultados
Seleção Hen e ovário Morfologia
Galinhas em grupos. com e sem tumores ovarianos com base na ultra-sonografia com Doppler colorido e morfologia do ovário. Como descrito anteriormente, ovários normais contêm múltiplos folículos em desenvolvimento (Figura 1A e 1D) e vasos sanguíneos discretos (Figura 1A) no estroma circundante folículos do ovário. No câncer de ovário fase inicial, o ovário contém menos folículos em desenvolvimento, e mais vasos sanguíneos do que nos ovários normais (Figura 1B e 1e). No câncer de ovário fase tardia, uma massa sólida com ascite é evidente e não há folículos em desenvolvimento (Figura 1C e 1F).
Um ovário normal (A e D) com vencimento folículos ovarianos (F1, F2) e vasos sanguíneos do estroma (setas) com o normal mostrando morfologia maturação (F1, F2) folículos ovarianos. Um exemplo de um ovário anormal (B e E) que contém mais vasos sanguíneos (setas) do que no ovário normal, não há detectáveis grandes folículos maduros e uma pequena massa de tecido sólido (círculo) no ovário. Um exemplo de cancro da fase tardia do ovário (C) caracteriza-se por uma grande massa sólida com o aumento do fluxo sanguíneo (setas) e ascite profusa (*). A morfologia geral (F) confirmou a presença de múltiplas massas sólidas e metástases de tumores para outros órgãos. Abreviaturas: CT = tonsila cecal; F1-F2 = grandes folículos pré-ovulatórios; GI = tracto gastrointestinal; OV = ovário; S = estroma ovariano; SM = massa de tecido sólido no ovário; SP = baço; UOD = oviduto superior; UT = útero.
Localização dos linfócitos em Normal Ovário, fase inicial e fase tardia ovário tumores
células T CD4 + foram observadas nas camadas da teca de folículos nos ovários normais (Figura 2 ), mas não nas células da granulosa ou oócitos compartimentos de folículos. As células T CD4 + ocorreu ao longo do ovário normal, que ocorre esporadicamente no estroma e adjacente aos folículos, dentro de folículos atréticos (não mostrado) e perto de vasos sanguíneos. Em ovários contendo tumorais, células T CD4 + ocorreu no estroma tanto de fase precoce (Figura 3) e tumores do ovário fase tardia (Figura 4) e foram menos frequentes do que quer CD8 + ou células Bu1a +. Em contraste com as células T CD8 + e células Bu1a + B, células T CD4 + foram perto, mas não dentro, lesões tumorais iniciais (Figura 3). As células T CD8 + foram similarmente localizada em folículos normais e no estroma perto folículos (Figura 2). As células T CD8 + foram encontradas em tumores em fase inicial e tardia (Figuras 3 e 4). Embora as células B (Bu1a +) e T foram igualmente distribuídos no estroma do ovário, Bu1a + coloração foi raramente encontrada nos folículos (Figura 2).
Bu1a +, CD4 + e CD8 + (setas) detectados por imuno-histoquímica em ovários normais o estroma do ovário (S), adjacente aos folículos (F), na camada da teca de folículos (seta dupla), e eram abundantes na camada de células sob o epitélio de superfície do ovário (sE). ampliação original, 10x; barra de escala = 100 mm. áreas selecionadas (caixas pontilhadas) são mostrados em uma aposta em maior ampliação para Bu1a e CD8 coloração; inserir barras de escala = 10 uM.
Bu1a +, CD4 + e CD8 + são mostrados em regiões semelhantes de secções em série que contêm focos tumorais. Mais células T CD8 + e células B estão presentes nos focos do tumor que as células T CD4 +. (A) de tumor em estágio inicial mostrando células CD4 + em um tumor com pouco diferenciado (PD) estrutura e CD8 + e células B em uma área adjacente bem diferenciado (WD). (B) Uma pequena lesão (círculo tracejado) contendo células T CD8 + e células Bu1a +, mas não as células CD4 +. (C) Uma área com células neoplásicas contendo CD8 + e células Bu1a +, mas não as células CD4 +. ampliação original, 10x; barra de escala = 100 mm. Manchado linfócitos CD8 + em uma área seleccionada (quadro a tracejado) é mostrado em um margem interna em maior ampliação; barra de escala = 10 mm.
regiões similares de três tipos de tumores são mostrados em cortes seriados coradas para Bu1a, CD4 e CD8.
Top Row:
Um exemplo de seções de um tumor de ovário seroso mostrando poucas células CD4 + dentro do tumor em comparação com Bu1a + e CD8 +.
da linha do meio:
Um exemplo de um tumor do ovário mucinoso mostrando depósitos de Bu1a +, CD4 + e CD8 + entre glândulas e em todo o tumor.
Linha inferior:
Um exemplo de um tumor ovariano endometrioid mostrando Bu1a +, CD4 + e CD8 +. ampliação original, 10x; barra de escala = 100 mm. Manchado CD8 + e linfócitos CD4 + em áreas selecionadas (caixas pontilhadas) são mostradas em inserções em maior ampliação; barra de escala = 10 mm.
Quantitative avaliação do número de células imunes em Normal Ovário, fase inicial e fase tardia ovário tumores
Em experiências iniciais, o número total de T e as células B isoladas de todo o ovário foi determinada por citometria de fluxo. Um fluxo representativo citometria gráfico de dispersão mostra a distribuição de tamanho das células de um ovário normal sem um tumor (Figura 5A) com um portão na região de linfócitos (R1). Os gráficos de pontos correspondentes representativos para cada marcador fluorescente é também mostrada (Figura 5B). Embora não pareceu ser menos células T CD4 + em tumores ovarianos em comparação com ovários normais (Figura 5C), houve também uma variação significativa do teor de células CD4 + entre galinhas, o que é provavelmente devido a variações no teor de folículo e fase do tumor, como visto na célula contagens obtidas usando morfometria. Uma limitação de citometria de fluxo é que todo o ovário é usado para preparar linfócitos e assim a localização das células imunes em relação a tumores ou folículos não pode ser avaliada. Do mesmo modo, não foi possível determinar o tipo de tumor, morfologia dos ovários ou a fase do tumor por histologia. O número total de células T e B foi determinada por avaliação morfométrica mais secções de imunomarcação de ovário normal e tumores do ovário. Esta abordagem também tornou possível para determinar o estágio do tumor de ovário e para avaliar possíveis diferenças na localização de linfócitos
(A):. Forward Representante vs. gráfico de dispersão lateral para as células de um ovário inteiro mostrando o portão (R1) usado para linfócitos. (B) As células foram em primeiro lugar fechado usando a porta em (A) e depois coradas quer com Bu1a-APC, CD4-FITC ou CD8-PE. A percentagem de células marcadas dentro da porta é mostrado no quadrante inferior direito para cada mancha. (C) O número total de Bu1a-APC, CD4-FITC e CD8-PE células de ovário normal e tumoral marcado galinha (n = 3 /grupo) são mostrados com a mediana indicado pela linha horizontal.
Dentro de folículos (Figura 6), as células T CD8 + diminuiu (p = 0,052) enquanto que as células T CD4 + aumentou (p = 0,009) do normal para tumores precoces e normal para tumores de fase tardia. As células B não foram tipicamente associada com folículos e não foram contados. O número de folículos diminuída ou estavam ausentes nos ovários com tumores em comparação com ovários normais (Figura 1).
(A), células B (Bu1a +) foram raramente encontrados em folículos e, portanto, não foram contados. O número de células T CD4 + aumentou ligeiramente (P = 0,052) e do número de células T CD8 + diminuiu (p = 0,009) em tumores de ovário de fase tardia em comparação com ovários normais. Em cada fase, havia mais CD8 +, em comparação com células T CD4 + (ovário normal, p = 0,003; fase precoce do tumor, p = 0,008; tumor de fase tardia, p = 0,007). Folículos foram definidos como mostrado em (B) e células dentro da área designada foram contadas e a média determinada por 2 × 10
5 m
2 Área do folículo. Três seções de cada ovário para cada galinha foram contadas com uma ampliação de 20x; barra de escala = 50 mm. As barras de erro representam a média ± SEM.
O estroma conteúdo da célula imune (ou seja, não-folicular) aumentaram globalmente com o estágio do tumor (Figura 7) e foi caracterizado por um maior número de células T CD8 + do que CD4 + As células T em cada fase (CD8 vs. células CD4 para ovário normal, p = 0,003; precoce tumor fase, p = 0,008 e tumorais fase tardia, p = 0,007). Semelhante a citometria de fluxo, as células Bu1a + e células T CD8 + eram mais numerosas do que as células T CD4 + no ovário normal e primeiros tumores do ovário e fase tardia (Figura 7A, B e C). O número de células T CD4 + foi significativamente menor nos tumores da fase inicial em comparação com ovário normal (p = 0,03) e não houve diferença entre Bu1a + e CD8 +. As células CD4 + foram significativamente aumentada (P = 0,05), enquanto o aumento nos valores médios para Bu1a + e CD8 + não atingiu significância em tumores de fase tardia em relação ao normal. No geral, as células imunológicas total aumentou de normal a fase inicial de tumores fase tardia (Figura 7D).
Como mostrado nos painéis AC para normal (N), precoce (E) e fase tardia (L) câncer de ovário, Bu1a células + e células T CD8 + eram mais numerosos em geral do que as células T CD4 +, em especial em tumores de fase tardia. No painel D, foram adicionados a B e células T contagens. Houve um aumento global de células imunes no total (não-foliculares) de ovário normal para tumores fase tardia. As células foram contadas em vários campos em três secções de cada ovário para cada galinha com ampliação de 20x. O número médio de B (Bu1a +) e células T CD4 + e CD8 + T foi estimada a partir de 11 galinhas com ovários normais (número de campos contados era Bu1a = 524, CD4 = 425 e CD8 = 360), 8 galinhas com câncer de ovário fase inicial ( número de campos contados era Bu1a = 228, CD4 = 190 e CD8 = 225) e 7 galinhas com câncer de ovário fase tardia (número de campos contados era Bu1a = 180, CD4 = 190 e CD8 = 200). Como as áreas avaliadas variadas em tamanho, todas as contagens foram normalizados para 8 × 10
4 mm
2.
O número de células imunológicas diferentes de acordo com o tipo de tumor (Figura 8). Só fase tardia (III /IV) tumores foram avaliados desde a determinação da histologia do tumor foi mais clara nestas fases. Havia mais células B em tumores serosos do que no mucinoso (p = 2,6 × 10
–
14) ou endometrioid (p = 7,6 × 10
–
9) tumores. tumores serosos tinham significativamente menos células T CD4 + em comparação com mucinoso (p = 3,8 × 10
–
5) ou endometrioid (p = 2,9 × 10
–
9) tumores. O número de células T CD8 + foi similar entre os tipos de tumores (p 0,2).
Uma vez que a classificação histológica dos tumores é mais clara em tumores de ovário fase tardia, a análise morfométrica foi confinado aos tumores fase tardia. tumores de células claras ocorreu em números relativamente baixas e não foram incluídos na análise. O número de Bu1a +, CD4 + e CD8 + foi contado como descrito nos Métodos para a serosa (66 campos nos ovários 3 de galinha); mucinosos (53 campos em 2 ovários galinha) e endometrioid (37 campos contados em 2 ovários galinha) tumores histologia. Não foram significativamente mais B (Bu1a +) células em tumores serosos do que no mucinoso (p = 2,6 × 10
–
14) ou endometrioid (p = 7,6 × 10
–
9) tumores. Em contraste, os tumores serosos tinham significativamente menos células T CD4 + em comparação com mucinoso (p = 3,8 × 10
–
5) ou endometrioid (p = 2,9 × 10
–
9). O número de CD + 8 células T não diferiram significativamente pela histologia do tumor (p 0,2).
Discussão
Este estudo é o primeiro a investigar as células imunes associadas a tumores ovarianos no modelo de galinha de postura de câncer de ovário espontânea. O conteúdo da célula imune total ovários com tumores foi mais elevada comparada com a dos ovários normais. O resultado foi semelhante usando dois métodos padrão; citometria de fluxo e análises morfométricas de secções de tecido imunohistoquímica marcados. Por citometria de fluxo, não havia relativamente grandes variações no número de células para cada tipo de célula, em particular para as galinhas com tumores. Estas variações encontradas por citometria de fluxo pode ser em parte devida à inclusão variável de células dos vasos sanguíneos e o teor variável de folículos activos como o ovário progride de um ovário normal para ovários com um tumor de fase avançada. Portanto, mais ênfase foi colocada sobre a determinação de números de células do sistema imunológico por morfometria imunohistoquímica desde a localização de linfócitos em relação ao tumor ou folículos puderam ser avaliados e desde tumores poderia ser classificado pela histologia e estágio.
A descoberta de células imunitárias no ovário normal neste estudo é consistente com estudos anteriores em galinhas [38], outros modelos animais [47] e nos seres humanos [45], [48]. Em um estudo detalhado do ovário de ratos normais, os linfócitos foram abundantes e também aumentou transitoriamente coincidente com a ovulação [47]. Quando os ratos foram esplenectomizados, linfócitos ovarianos foram reduzida, mas não eliminada, sugerindo que no ovário normal, não são “residentes” linfócitos, ou que não todos os linfócitos do baço de tráfego. Neste estudo da galinha, há também parece ser linfócitos “residentes” no ovário normal, que são adjacentes à camada celular externa dos folículos, bem como no estroma do ovário e da superfície do epitélio. Isto levanta uma questão de saber se as células imunes encontradas em tumores de ovário são originários de baço ou gânglios linfáticos ou se as células imunes residentes no ovário contribuir para a conversão maligna.
No ovário galinha normal, as células B foram encontrados com relativamente frequência elevada nas regiões do estroma e medulares, semelhante à de células CD4 + e CD8 +. No entanto, as células B foram raramente observados dentro dos folículos, em contraste com CD4 + e CD8 +. A abundância relativamente elevada de células T nos folículos sugere que eles têm um papel na função normal do ovário. Embora o marcador Bu1a é específico para as células B de galinha, que também é expressa nos macrófagos de aves e, em muito menor extensão em outros tipos de células não-B [49]. Assim, são necessários mais estudos com marcadores secundárias para diferenciar as células B e as células não-B na galinha. No entanto, este estudo mostrou que as células B representam uma proporção significativa dos linfócitos nos tumores ovarianos.
Com base em inúmeros relatórios de outros grupos em modelos animais e humanos, células do sistema imunológico eram esperados em tumores ovarianos [50], [ ,,,0],51], [52]. Demonstrou-se que a sobrevivência do paciente está correlacionada com o número de linfócitos infiltrados no tumor [5] em material cirúrgico que é normalmente obtidos a partir de fase tardia da doença. É difícil determinar o papel destas células nas fases iniciais uma vez que o cancro do ovário é raramente detectada precocemente em seres humanos. Da mesma forma, quando o câncer de ovário é induzida em modelos animais, não está claro se os eventos de iniciação são modelos de desenvolvimento do tumor espontâneo. Não existem estudos de células imunes em galinha ovário tumores e alguns estudos que comparam estas células em células de ovário normal e tumores do ovário para avaliar possíveis mudanças durante o desenvolvimento do tumor de ovário espontânea. Neste estudo verificou-se que o número total de células imunitárias no ovário tende a ser mais elevada na presença de tumores espontâneos, o que é consistente com o conceito aceite que as células imunes tráfego para e invadir tumores [5], [53], [ ,,,0],54]. Além disso, o conteúdo da célula imunitária é mais elevada em tumores de fase tardia, em particular em tumores serosos fase tardia. Uma vez que esta tendência é semelhante à que em seres humanos [50], [52], [55], [56], [57], os resultados apoiam a utilização do modelo de galinha para investigar as respostas imunitárias a tumores do ovário e para pré-clínica ensaios de vacinas.
nos seres humanos, o conteúdo de linfócitos determinado por imuno-histoquímica em tumores de ovário não é consistente em diferentes estudos, particularmente com respeito a células B [58]. Em estágio final humanos biópsias de tumores de ovário continha principalmente células CD8 + /CD45RO + T e macrófagos CD68 +, enquanto que as células NK e B ocorreu em números mais baixos [50]. Em contraste, as células B CD20 + foram encontrados em 42% dos tumores do ovário num outro estudo [6]. Em estudos de sobrevivência, um maior número de células B CD19 + foi associada a um prognóstico pobre [59] enquanto que os números mais elevados de células B CD20 + foram associados com a sobrevivência livre de doença aumentou [6]. Diferenças nesses estudos pode ser devida à utilização de diferentes marcadores, mas elas também podem reflectir diferenças no conteúdo relativo de diferentes tipos de tumores histo-nesses estudos [6]. células B e células T CD8 + foram observadas em tumores de ovário de galinha com frequência relativamente elevada, enquanto que as células CD4 + foram detectadas a uma frequência relativamente mais baixa.
Células imunes ocorreu em todas as três tumorais histo-tipos examinados ( serosa, mucinoso, e endometrioid), mas havia mais células imunes em tumores serosos fase tardia.