Abstract

Os estudos recentes sublinham a importância do papel dos microRNAs (miRNA) no desenvolvimento do pulmão Câncer. Os principais reguladores de miRNA biogênese são as ribonucleases Drosha, Dicer e ago2. Aqui, o papel de proteínas do núcleo de miARN máquinas biogénese na resposta de linhas humanas não-pequenas do pulmão de células pequenas e de células de carcinoma de tratamento com radiação ionizante foi avaliada. Descobrimos que Drosha Dicer e foram expressos em níveis mais elevados em radiorresistente mas não em linhas de células sensíveis. No entanto, a regulação negativa de qualquer Dicer ou Drosha teve nenhum efeito sobre a sensibilidade das células à irradiação. Eliminação dos componentes do complexo de silenciamento induzido por ARN ago2 e Tudor nuclease estafilocócica também não sensibilizar as células para o mesmo tratamento. Assim, a modulação da miRNA máquinas biogênese não é suficiente para aumentar a radiossensibilidade de tumores pulmonares e outras estratégias são necessárias para combater o câncer de pulmão

Citation:. Surova O, Akbar NS, Zhivotovsky B (2012) knock-down de As proteínas do núcleo de regularização MicroRNA Biogenesis não tem efeito na sensibilidade das células do cancro do pulmão a radiações ionizantes. PLoS ONE 7 (3): e33134. doi: 10.1371 /journal.pone.0033134

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de novembro de 2011; Aceito: 05 de fevereiro de 2012; Publicado: 30 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Surova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Conselho Sueco de Pesquisa, o sueco e as Sociedades Câncer Estocolmo, a Fundação do Câncer Sueco Infância, Sociedade sueca para a Investigação médica, o Ministério do Ensino Superior e da Ciência (11.G34.31.0006) Russo, o FP- CE 6 (Chemores), bem como os programas 7.º PQ (APO-SYS). OS foi apoiado por uma bolsa do Instituto Sueco e Karolinska Institutet e NA por Comissão de Educação Superior do Paquistão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão (LC) é a principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo em ambos os homens e mulheres. Existem dois principais tipos de neoplasia, carcinoma de pequenas células do pulmão (SCLC) e carcinoma de pulmão de não pequenas células (CPNPC), que diferem consideravelmente nas suas características histopatológicas e respostas à terapia. A radiação ionizante, isoladamente ou em combinação com cirurgia ou quimioterapia, é um tratamento eficaz para muitos cancros, incluindo LC. No entanto, tanto radiorresistência do tumor intrínseca e adquirida reduzir grandemente a eficácia da radioterapia para NSCLC e SCLC e conduzem frequentemente a recidiva e metástase. Portanto, é de grande importância para explorar os mecanismos moleculares subjacentes à resistência das células LC à radiação.

Os microRNAs (miRNA), codificação não proteico, RNAs de cadeia simples de 19-25 nucleotídeos, constituem um romance classe de reguladores de genes e têm sido relatados para desempenhar um papel crítico na transformação do cancro [1]. Estudos recentes demonstraram a expressão aberrante de miRNAs na LC [2] – [5]. A produção de miRNAs requer um conjunto de proteínas referidos coletivamente como a maquinaria miRNA. expressão aberrante de componentes da maquinaria de miARN tem sido implicada na tumorigénese, incluindo LC [6], [7]. -Regulação de Dicer no adenocarcinoma de pulmão e o seu possível papel no desenvolvimento de adenocarcinomas periféricos têm sido relatado [7]. Alta expressão de outros silenciamento proteínas complexas (RISC) induzido por ARN, X frágil retardo mental proteína relacionada com síndroma 1 (FXR1), Tudor-SN (TSN) e activador de proteína da proteína quinase induzida por interferão (PACT), foram demonstrados em CPPC [7]. Outro grupo descreveu uma associação entre a expressão Dicer reduzida e mau prognóstico em pacientes LC [8]. Assim, investigações adicionais são necessários para elucidar o papel de máquinas de miARN na patogénese molecular de LC. Recentemente, o efeito terapêutico potencial de depleção de Dicer na quimiossensibilidade e proliferação de células de cancro da mama tem sido relatada. O knock-down de Dicer por siARN levou a paragem em G1 e significativo aumento da sensibilidade ao agente que danificam o ADN, cisplatina, na linha celular de cancro da mama MCF-7 [9]. Dados os papéis biológicos fundamentais e múltiplas de miARNs em diferentes processos celulares, a modulação da expressão de proteínas envolvidas na miARNs biogénese pode ser uma abordagem terapêutica promissora para aplicação clínica. Até à data não existem dados sobre o papel das proteínas produtoras de miRNA em mecanismos de resistência /sensibilidade das células LC ao tratamento. Por isso, nós investigamos se a depleção de proteínas nucleares envolvidas na biogénese miARNs influencia a resistência de LC a radioterapia. Surpreendentemente, knock-down de expressão de Drosha, Dicer, Argonaute2 e Tudor-SN por interferência de RNA não aumentou a sensibilidade das células NSCLC que eram resistentes ao tratamento com radiação ionizante.

Materiais e Métodos

Cultura de células e tratamentos

linhagens de células NSCLC humano U1810, U1299 (ambos da coleção UU), A549, H661, H157, H23 (todos do ATCC); e SCLC linhas de células H69 (ECACC), H82 (ATCC), U1906, U1690, U2020, U1285 (todos a partir da colecção de UU) foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro inactivado por calor a 10% de bovino fetal (FBS), glutamina ( 2 mM), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL) (todos obtidos a partir de Gibco) a 37 ° C, 5% de CO

2 e 95% de humidade. As células foram expostas à irradiação numa dose de 8 Gy usando uma

60Co (Karolinska Biomics Center, Hospital Universitário Karolinska) para os períodos indicados nas legendas das figuras.

Avaliação da apoptose

a apoptose foi determinada pela quantidade de células na fase sub-G1. As células foram tripsinizadas e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de FBS. Um total de 1 × 10

6 células foram usadas para análise. As células foram sedimentadas a 2000 rpm e lavadas uma vez em PBS. O sedimento foi ressuspenso em PBS 250 mL de gelo frio e misturado com 2 ml de etanol gota a gota 70% arrefecido em gelo enquanto vórtex. As amostras foram mantidas a 4 ° C durante 24 h e, depois, sedimentadas a 2000 rpm e lavadas duas vezes com PBS. Após a última lavagem, as células foram ressuspensas em 360 ul de PBS contendo 100 ug /ml de RNase A (Fermentas) e incubou-se a 37 ° C durante 1 h. Quarenta ul de iodeto de propídio solução (estoque a 0,5 mg /mL) foi adicionado às amostras, seguido por incubação durante 30 min à temperatura ambiente com oscilação suave e protecção da luz. As células foram analisadas por citometria de fluxo (FACScan, Becton Dickinson) e os dados foram avaliados utilizando o software celular Quest.

Ensaio de Actividade de Caspase

As células foram lavadas com PBS gelado, ressuspensas em 25 uL PBS, lisadas através de congelação em azoto líquido, incubaram-se com substrato de caspase-3-like e analisados ​​como descrito anteriormente [10]. atividade da caspase foi expressa como a dobra de aumento em relação aos controles apropriados.

Transfection siRNA

siRNAs segmentação humana Dicer1, Drosha, Argonaute2 e não-alvo siRNA como controle negativo foram obtidos a partir Thermo Scientific Dharmacon® e armazenado numa concentração de 20 uM. Vinte e quatro horas antes da transfecção as células foram semeadas em placas de 6 poços em meio de crescimento sem antibióticos. siRNAs foram diluídos em 100 ul de RPMI 1640 (Gibco) e misturou-se com 1 mL DharmaFECT®1 siARN Transfection Reagent (Thermo Scientific Dharmacon®). Após 20 min de incubação, os complexos foram adicionados às células para dar uma concentração final de ARNic em meio de 50 nM. Quarenta e oito horas após a transfecção, o meio foi substituído e as células foram sujeitas a irradiação.

Western Blot Detecção

As células foram lisadas utilizando um tampão de lise completo (Roche) mais cocktail de inibidores de protease (PIC, Complete-M, Roche). A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce). Após a mistura com tampão de Laemmli, as amostras foram submetidas a SDS-PAGE e Western blotting. Para a imunodetecção, foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-Dicer, anti-clivada PARP, anti-caspase-3, anti-caspase-9 (todos obtidos a partir de Cell Signaling Technology), anti-ago2, anti-Drosha (ambos a partir de Millipore), anti-XPO5, anti-PRKRA (PACT) (ambos a partir de Abnova), anti-FXR1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-β-actina (Sigma-Aldrich), e anti-GAPDH (Trevigen). Horseradish anticorpos marcados com peroxidase anti-rato ou anti-coelho secundário (Pierce) e um kit de quimioluminescência aumentada (reagente de detecção de mancha de Western, GE Healthcare UK Limited) foram usadas para a detecção de proteínas reconhecidas. A análise densitométrica para a quantificação do nível relativo de expressão da proteína foi realizada utilizando software ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Real-Time PCR quantitativa

RNA foi isolado a partir de células utilizando uma PureLink ™ ARN Mini Kit (Invitrogen). cDNAs de transcritos de modo inverso a partir das amostras foram utilizados como moldes. Argonaute2 (ctaccttcccctggaggtctg ago2-esquerda e cgacctagcagtcgctctga ago2-direita) e 18S RNA ribossomal (18S-1 cgctactaccgattggatggtt e 18S-2 agtcaagttcgaccgtcttctc) primers (Invitrogen) foram projetados para combinar com a sequência de cDNA-alvo. Vinte ng do modelo de cDNA transcritas inversa foi misturado com SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e amplificado utilizando um Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems) com o seguinte programa: 40 ciclos, consistindo cada ciclo de um passo de desnaturação a 95 ° C durante 15 s e uma etapa de hibridação /extensão a 60 ° C durante 1 min.

Avaliação estatística

os resultados de três experiências independentes foram expressos como a média ± SEM A avaliação estatística foi realizada utilizando um não-teste t pareado.

Resultados

expressão de proteínas envolvidas no miRNA Biogenesis em NSCLC e SCLC

A fim de identificar alvos moleculares para o radiossensibilização de células LC entre proteínas envolvidas no miRNA biogênese foi realizada uma análise dos sete principais componentes de máquinas miRNA expressão da proteína em um painel de NSCLC e SCLC (seis linhas celulares em cada painel). Para cada subtipo LC as linhas celulares foram seleccionadas com base na sua sensibilidade à radiação, tal como medido pela fracção sobrevivente após exposição a 2 Gy (SF2), num ensaio de sobrevivência clonogénica, e agrupados em radiossensíveis (RS) SF2 com 0,3 Gy ou radiorresistente (RR) com SF2 ≥ 0,3 Gy [11] – [14]. Os níveis basais de todas as proteínas (Drosha, Dicer, exportina-5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), ativador da proteína da quinase induzida por interferon proteína (PACT), X frágil retardo mental proteína relacionada com a síndrome de 1 (FXR1) e Argonaute2 (ago2) foram avaliadas por transferência de Western em todas as linhas celulares seleccionadas antes da irradiação (Figura 1A). Ambos os RNase enzimas III (Drosha e Dicer) foram expressos em níveis relativamente elevados em células NSCLC em comparação com SCLC. Um membro dos carioferinas família de proteínas, XPO5, que está envolvida na exportação nuclear de miARN, foi expresso a um nível mais elevado em H661 enquanto que os baixos níveis de expressão foram vistos em H69 e U1690 em comparação com as restantes linhas celulares. o nível de expressão da TSN, pacto, proteínas FXR1 e ago2 não variou profundamente entre as várias linhas de células, com a excepção de H69, que exibiu menor expressão de todos as proteínas estudadas. como nosso painel consistia em ambas as RS e células RR, a linha celular H23 foi seleccionado como o representativos de células radiossensíveis e U1810 e H661 foram utilizados como representantes de células radioresistentes em futuras investigações. A análise densitométrica da expressão da proteína revelou que Dicer, Drosha e XPO5 foram expressos em níveis mais elevados em células RR em comparação com RS, ao passo que não houve correlação clara entre os níveis de expressão de ago2, TSN, PACT e valores FXR1 e SF2 (Figura 1B) .

(a) análise de transferência de Western de o nível de expressão da proteína de Drosha, Dicer, exportina 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), activador de proteína da proteína quinase induzida por interferão (PACT), X frágil retardo mental proteína relacionada com a síndrome de 1 (FXR1) e Argonaute 2 (ago2) em um painel de NSCLC (U1810, U1299, A549, H661, H157, H23) e SCLC (U1285, H82, H69, U1690, U1906, U2020 ) linhas de celular. Análise (B) densitométrica dos níveis relativos de expressão de proteína em H23, linhas de células H1299, U1810 e H661. As linhas celulares distribuídos de acordo com radiossensibilidade, medido na fração sobreviver a 2 Gy (SF2). O carregamento igual foi verificado usando anticorpos anti-p-actina. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

Efeito da radiação ionizante em miRNA Maquinaria em NSCLC

Para investigar ainda mais o papel de componentes de máquinas de miRNA na resposta das células LC à irradiação, duas linhas de células de RR (U1810 e H661) e uma linha de RS (H23) a partir do painel de NSCLC foram submetidos a irradiação gama e a expressão da proteína foi analisada 6, 24 e 48 h após o tratamento. Como esperado, a morte celular por apoptose em massa foi observada em H23 em 6 horas após a radiação ionizante, como avaliado pela clivagem da PARP, enquanto H661 e U1810 responderam ao tratamento em pontos de tempo posteriores, após 24 e 48 h, respectivamente (Figura 2). Não há alterações visíveis na expressão de qualquer uma das proteínas estudadas foram detectados quer no RR ou RS células, tal como medido por transferência de Western em 6, 24 e 48 h após o tratamento IV (Figura 2). Assim, a irradiação gama não afecta a expressão de proteínas do núcleo da máquina miARN no NSCLC, independentemente do RR ou RS fenótipo destas células cancerosas.

A clivagem de PARP e o nível de expressão de Drosha, Dicer, exportina 5 (XPO5), Tudor-SN (TSN), activador de proteína da proteína quinase induzida por interferão (PACT), e proteínas relacionadas com a síndrome atraso mental X frágil 1 (FXR1) em U1810, células H661 e H23 foram detectadas por Western blot em h pós-irradiação 6, 24 e 48 com 8 Gy. O carregamento igual foi verificado usando anticorpos anti-p-actina. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Knock-down, da Core proteínas envolvidas na primeira etapa de miRNA Biogenesis não é suficiente para sensibilizar células NSCLC à irradiação

Uma vez que o nível de a expressão da proteína de pelo menos três componentes de máquinas de miARN, Dicer, Drosha e XPO5, foi positivamente correlacionada com a radiorresistência de células NSCLC, a alto nível da sua expressão pode contribuir para a resposta das células tumorais para o tratamento ‘de uma forma guiada-miARN. Para explorar esta possibilidade, decidimos investigar o efeito de sensibilização potencial da sub-regulação de proteínas Dicer e Drosha na linha de células U1810. A ribonuclease nuclear Drosha eo Dicer ribonuclease citoplasmático são os dois principais reguladores do primeiro passo de produção de miARN e promover a clivagem de transcritos primários longas nos intermediários em gancho de cabelo (pré-miARNs) e subsequente clivagem em miARNs maduros. Deste modo, através da eliminação de qualquer uma destas duas proteínas principais que o esperado para reduzir a produção de miARN e afectar a radiorresistência de células NSCLC.

O knock-down de Dicer em células U1810 foi realizada utilizando a interferência de ARN, após o que as células eram submetido a irradiação gama e analisadas 48 h após o tratamento. O silenciamento completa da expressão da proteína Dicer foi confirmada por transferência de Western antes e após a irradiação (Figura 3A). A sub-regulação de Dicer foi seguido por uma diminuição da produção de vários miARNs (miR1301, miR1249, miR1227, miR532-3p, miR625, miR1827, miR324-5p) tal como avaliado por PCR em tempo real (dados não mostrados). No entanto, as células U1810 com empobrecido Dicer mostram forte resposta à radiação ionizante como fez células do tipo selvagem. Não houve diferenças na clivagem da PARP entre as células knocked-down Dicer (Figura 3A) e controle de. A percentagem de células apoptóticas após irradiação foi a mesma em todos os grupos estudados (Figura 3B). Análise da activação de caspases mostrou que a caspase-3 e -9 foram igualmente tratados após a irradiação e que a actividade da caspase-3-como foi quase idêntico em ambas do tipo selvagem e células Dicer-empobrecido (Figura 3A e C). Um efeito semelhante sobre radiorresistência era aparente quando Drosha foi empobrecido em U1810 células. Não houve mudanças nos clivagem PAPR (Figura 3D) ou o número de células apoptóticas (Figura 3E) foram detectados entre Drosha células batido de deslocamento 48 h após radiaiton ionizante e controlo. Resultados semelhantes foram obtidos após a eliminação de Dicer e Drosha de outras linhas celulares de NSCLC (Figura S1 e S2). Globalmente, estes dados sugerem que knock-down de qualquer Dicer ou Drosha não foi suficiente para sensibilizar células NSCLC à irradiação gama

(A) O nível de expressão Dicer, a clivagem de PARP e processamento de caspase-3 e. – 9 em U1810 células transfectadas (48 h) com controle (si SCR) ou Dicer (siDicer) siRNA avaliada por Western blot de 48 h após a irradiação. O carregamento igual foi verificado utilizando anticorpos anti-GAPDH. Os dados são representativos de três experiências independentes. (B) Detecção de morte celular por apoptose em U1810 avaliada medindo a população sub-G1 após a transfecção (48 h) com controlo ou ARNsi Dicer e tratamento por irradiação (48 h). (C) a actividade da caspase-3-like (dobre aumento em relação ao controlo) em células U1810 após o tratamento com quer isoladamente ou em combinação com a transfecção de controlo ou ARNsi Dicer irradiação (para mais detalhes ver Materiais e Métodos). (D) O nível de expressão Drosha e clivagem de PARP em células U1810 transfectadas (48 horas) com o controlo (Si SCR) ou Drosha (siDrosha) siRNA analisados ​​por Western blot de 48 horas após tratamento com irradiação. O carregamento igual foi verificado utilizando anticorpos anti-GAPDH. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. (B) morte apoptótica de células em U1810 medido pela análise da população sub-G1 após a transfecção (48 h) com controlo ou ARNsi Drosha e tratamento por irradiação (48 h). Os resultados apresentados são a média ± S.E.M. de três experiências independentes.

A regulação dos principais componentes de silenciar Complex (RISC) induzida pelo RNA não sensibilizar células NSCLC à irradiação

Desde o esgotamento das proteínas do núcleo do primeiro passo de miARN biogénese não afectou a radiossensibilidade do NSCLC, é possível que o RNA mediada por interferência knock-down quer de Dicer ou Drosha resulta numa redução significativa, mas não a perda total, madura de miARN devido à longa semi- vida de moléculas maduras. miRNAs são estáveis ​​uma vez que entra no complexo efetoras. Portanto, decidimos bloquear o segundo passo de miARN biogénese por knock-down dos dois componentes principais de RISC, Argonaute2 e Tudor-SN, e assim estabelecer o seu papel na radiorresistência de células LC. A sub-regulação da expressão eficaz de ago2 na linha de células U1810 foi confirmada pela medição da expressão de ARNm, que foi reduzido até 95% após a transfecção com anticorpos anti-ago2 siRNA (Figura 4A). No entanto, a resposta apoptótica (avaliada por clivagem de PARP e processamento de caspase-3 e -9) exibido por células empobrecido-ago2 após a irradiação era tão forte como nas células U1810 de tipo selvagem (Figura 4B). Além disso, não houve alterações significativas na percentagem da população sub-G1 ou a activação de caspase-3 após a radiação ionizante, embora ambos os parâmetros foram ligeiramente diminuída em ago2-regulada de deslocamento células em comparação com as células do tipo selvagem (Figura 4C e D).

(A) O nível de Argonaute2 (ago2) mRNA em U1810 células transfectadas com o controle (Scram) ou ago2 siRNA normalizada contra 18S RNA ribossomal. Os resultados são a média ± S.E.M. de três experiências independentes. (B) A clivagem da PARP e processamento de caspase-3 e -9 U1810 em células transfectadas (48 horas) com o controlo (Si SCR) ou ago2 siRNA, e, em seguida, submetida a irradiação durante 48 h. O carregamento igual foi verificado utilizando anticorpos anti-GAPDH. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. (C) Detecção de morte celular apoptótica em células U1810 após a transfecção (48 h) com controlo ou ARNsi ago2 e subsequente tratamento com irradiação (48 h). (D) a actividade da caspase-3-like (vezes de aumento em relação ao controlo) em células U1810 após o tratamento com quer isoladamente ou em combinação com a transfecção com controlo ou ARNsi ago2 irradiação. Todos os resultados apresentados são a média ± S.E.M. de três experiências independentes.

Finalmente, o mesmo conjunto de experimentos foi realizada, a fim de knock-down a expressão de outro componente RISC, Tudor-SN. Para além da sua função como um componente do complexo multiproteico envolvido em miARN funcionamento, TSN é conhecido por actuar como um activador transcricional e oncogene em muitos cancros. Além disso, é clivada durante a apoptose. Embora significativa diminuição da regulação da expressão TSN utilizando siARN foi conseguida em células U1810, conforme mostrado por análise de transferência de Western, as células knocked-down exibiram clivagem semelhante da PARP como o de tipo selvagem após tratamento de radiação (Figura 5A) ionizante. A porcentagem de células em apoptose não diferiu entre knocked-down grupos TSN após a irradiação (Figura 5B) e controle de. Resultados semelhantes foram obtidos para duas outras linhas celulares no painel de NSCLC (A549 e H661) após regulação negativa da TSN (Figura 5C e D).

O nível de expressão Tudor-SN e a clivagem de PARP em U1810 (A), células H661 (D) A549 (C) e transfectadas (48 horas) com o controlo (Si SCR) ou Tudor-SN (Si TSN) siRNA analisados ​​por Western blot 48 h após a irradiação. O carregamento igual foi verificado utilizando anticorpos anti-GAPDH. (B) A morte celular apoptótica em células U1810 após transfecção com TSN siRNA e irradiação. Todos os dados são representativos de três experiências independentes.

Discussão

A radioterapia é uma importante arma terapêutica na LC. No entanto, a eficácia deste tipo de terapia é limitada pela radiorresistência inicial ou adquirida das células tumorais. NSCLC é caracterizada por uma baixa taxa de resposta do tumor à radiação e uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 7% a 10% [15]. CPPC inicialmente respondem bem à quimioterapia convencional e radioterapia, mas desenvolver quimioterapia adquirido e radiorresistência ao longo dos subsequentes 3 a 12 meses, ea taxa de sobrevida global em 5 anos é de apenas 5% [16]. Os mecanismos que conduzem à radiorresistência destes tumores não são ainda totalmente compreendidas.

miARNs têm sido referidos como sendo alvos potenciais de diagnóstico ou terapêuticas no tratamento do cancro, incluindo tumores do pulmão. Há cada vez mais evidências de associação entre a expressão de miRNA em tumores e quimioterapia e radiossensibilidade, tanto com relação à previsão e modulando sensibilidade [17] – [20]. Um estudo recente em NSCLC identificado um subconjunto de miARNs mostrando alterações consistentes na expressão em resposta a irradiação. Assim, uma resposta global miARN existe em todas as células de tumor, incluindo cancro do pulmão, e de miARN pode ser componentes da resposta celular ao insulto citotóxico [20]. Achados semelhantes relativas às mudanças na expressão global de miRNA foram relatados após o tratamento anticancerígeno com várias drogas quimioterápicas em diferentes linhas celulares de cancro e amostras de pacientes [21]. A expressão dos componentes de processamento de miARN foi mostrado para ser desregulada em diferentes cancros humanos [8], [22], [23] e, por conseguinte, pode contribuir para a resposta de células tumorais ‘para o tratamento de uma forma guiada-miARN ou independentemente do via de interferência de RNA. A sub-regulação de Dicer na linha celular de cancro da mama MCF-7 por siARN foi demonstrado que provoca a paragem em G1 e aumentar a sensibilidade à que danificam o ADN agente, cisplatina, sugerindo que a combinação da estratégia anti-Dicer e quimioterapia tradicional pode melhorar a eficiência do tratamento do câncer [9]. Outro estudo demonstrou que a sub-regulação Dicer pode aumentar a capacidade proliferativa e invasiva de células tumorais in vitro e semelhante promover a proliferação do tumor xenoenxerto subcutâneo in vivo 24. No geral, estes dados sugerem que tanto miARN máquinas desempenha um papel positivo ou negativo no tumor e transformação resposta à terapêutica em diferentes tipos de cancro. No presente estudo, buscamos esclarecer o papel dos componentes biogênese miRNA na modulação da resposta de radiação em NSCLC e linhas de células SCLC. A fim de identificar os alvos moleculares para a radiossensibilização, a análise de sete proteínas do núcleo da máquina miARN, Drosha, Dicer, XPO5, TSN, pacto, FXR1 ago2 e expressão de proteína, foi realizada num painel de linhas celulares de NSCLC e SCLC. Nossas descobertas demonstraram a maior expressão de proteínas e Drosha Dicer em células resistentes à radiação em comparação com linhas sensíveis. No entanto, knock-down destas duas proteínas essenciais não afectou a sensibilidade de células NSCLC ao tratamento com irradiação gama. Isto pode ser parcialmente devido à meia-vida longa de miARN maduro. Vários estudos têm mostrado que para baixo knock-ARN mediada por interferência de Drosha, XPO5-5 ou resultados Dicer em uma redução significativa, mas não a perda total, madura de miARN [25] – [28]. Desde miRNAs parecem ser bastante estável, uma vez que entrar no complexo efetoras, nós exploramos a possibilidade de aumentar a radiossensibilidade de células tumorais de pulmão pelo esgotamento dos componentes a jusante da via biogênese miRNA, ou seja, duas principais proteínas RISC, ago2 e Tudor-SN. No entanto, a regulação negativa destas proteínas não alterou a sensibilidade de células NSCLC ao tratamento. Assim, pode haver biogénese via alternativa (s) que pode ser activado a interrupção de um dos vários passos do processo de biogénese de miARN canónica. Alguns miARNs foram encontrados a ser gerado através de uma via independente de biogénese Dicer: depois de ser processada por Drosha, o pré-miARN pode ser directamente carregado para atrás e clivada pelo centro catalítico atrás para gerar um intermediário 3` final, que é adicionalmente cortado [29]. Há também uma classe de miRNAs não-canônicos que ignoram o microprocessador Drosha, mas ainda exigem Dicer para a sua biogênese [30]. Deve-se notar que a análise da expressão da proteína de todos os componentes centrais da maquinaria de miARN no U1810 células realizada após a sub-regulação de Dicer, Drosha, TSN ou ago2 revelou que nenhum dos knock-baixos teve um efeito significativo sobre a expressão de outras proteínas na via, ou seja, não se observou aumento na expressão de componentes de máquinas de miARN seguinte knock-baixos (Figura S3). Por outro lado, um estudo recente realizado em células endoteliais primárias imortalizadas e mostrou que a supressão da expressão global de miARN conseguido através de sub-regulação de qualquer das proteínas ou ago2 Dicer utilizando siRNA levou a um aumento da morte celular após a irradiação [31]. Isto indica que a contribuição da miARN máquinas para a resposta à radioterapia pode altamente dependem do tipo de célula e ser diferente em células normais e cancerosas.

Outro relatório mostrou que miARN biogénese é globalmente induzida a um dano do ADN em uma ataxia -telangiectasia mutada (ATM) forma dependente da quinase em fibroblastos de rato embrionários (MEFs) após o tratamento com o fármaco neocarcinostatina radiomimético (NCS), que gera quebras de cadeias duplas (DSB). proteína reguladora KH-tipo splicing (KSRP) foi encontrado para ser um jogador-chave que traduz a sinalização dano ao DNA de miRNA biogênese. A cinase ATM liga-se directamente para e fosforila KSRP, levando a interacção aumentada entre KSRP e pri-miARNs e um aumento da actividade de processamento de miARN KSRP em [32]. Se KSRP é activado e contribui para a transformação de miARN em NSCLC sobre a sub-regulação dos componentes centrais da maquinaria de miARN e tratamento com irradiação gama permanece para ser clarificado.

Além disso, sabe-se que a maioria dos miARNs têm dezenas a centenas de alvos, e que mRNAs alvo podem ligar vários miRNAs. Talvez a magnitude da redução na produção da actividade causada pela eliminação de uma única proteína a partir de uma via de miARN miARN não é suficiente para afectar os mecanismos responsáveis ​​pela resistência de células de LC ao tratamento de irradiação. Em outras palavras, é provável que um impacto real na radiorresistência de células NSCLC através da maquinaria de miARN não pode ser conseguida através da eliminação de proteínas individuais a partir da via de biogénese, e, assim, ainda mais a identificação e a segmentação de miARNs particulares envolvidos na resposta das CL as células para a terapia de irradiação é necessária.

em resumo, no presente estudo, a expressão de um conjunto de proteínas envolvidas na biogénese de miARN foi avaliada pela primeira vez num painel de linhas celulares humanas de LC. Embora a expressão de proteínas do núcleo da via de miARN correlacionada com a resistência das células à radioterapia, a knock-down destas proteínas não foi suficiente para desencadear a sensibilização de células de LC para este tipo de tratamento. Isto sugere que radiorresistência tumor de pulmão não pode ser superado pela modulação da máquina biogênese miRNA e que outras estratégias são necessárias para combater o câncer de pulmão.

Informações de Apoio

Figura S1.

A expressão de Dicer e a clivagem de PARP em células A549 e H661 transfectadas com o controlo (Si SCR) ou Dicer (Si Dicer) siRNA analisados ​​por Western blot de 48 horas após tratamento com irradiação (A). O carregamento igual foi verificado utilizando anticorpos anti-GAPDH. (B) A morte celular apoptótica em células A549 e H661 medido por meio de análise da população sub-G1 após a transfecção (48 h) com controlo ou ARNsi Drosha e tratamento por irradiação (48 h)

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0033134.s001

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Figura S2.

O nível de Drosha e PARP clivada em A549 (A) e as células H661 (C) depois de knock-down de Drosha. O carregamento igual foi verificado utilizando anticorpos anti-GAPDH. (B) A percentagem de células apoptóticas em A549 transfectadas com ARNsi Drosha e tratada com irradiação (48 h). . (D) A caspase-3-actividade semelhante (vezes de aumento em relação ao controlo) em células H661 após tratamento com quer isoladamente ou em combinação com a transfecção com controlo ou ARNsi Drosha irradiação

doi: 10.1371 /journal.pone.0033134. S002

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Figura S3.

O nível de Drosha, Dicer, XPO5, TSN, PACT após knock-down de Dicer, Drosha, TSN e ago2 em U1810 células. Carga igual foi verificada utilizando anticorpos anti-GAPDH

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033134.s003

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Reconhecimentos

Os autores gostariam de expressar a gratidão a Hogir Salim, Dali Zong e Birgitta Mörk (Karolinska Biomics Center, Departamento de Oncologia-Pathology, Karolinska Institutet) para assistência técnica.