Abstract

Fundo

A capacidade de detectar seletivamente e direcionar células cancerosas que tenham sido submetidos a um epithelial- mesenquimal (EMT), pode levar a métodos melhorados para o tratamento de câncer, como câncer de pâncreas. A remodelação de glicosilação celular anteriormente tem sido associada com a diferenciação das células e pode representar uma valiosa classe de alvos moleculares para EMT.

Metodologia /Principais Achados

Como um primeiro passo para investigar a natureza da glicosilação alterações na EMT, caracterizamos a expressão de genes de glicano-relacionados de três

in-vitro

sistemas modelo que cada um representava um aspecto complementar da EMT câncer pancreático. Estes modelos incluíam: 1) EMT induzida por TGF, o que proporcionou um olhar para a transição ativa entre estados; 2) um painel de 22 linhas celulares de cancro do pâncreas, o que representou estados diferenciação terminal de ambos os epitelial-mesenquimal como ou semelhantes; e 3) activamente-migração e as células estacionárias, o que proporcionou um olhar para o mecanismo de migração. Foram analisados ​​dados de expressão de uma lista de 587 genes envolvidos na glicosilação (biossíntese, transporte de açúcar, glicanos de ligação, etc.) ou EMT. Glycogenes foram alterados com uma prevalência mais elevada do que todos os outros genes, nos dois primeiros modelos (p 0,05 e 0,005, respectivamente), mas não no modelo de migração. Vários temas funcionais foram compartilhados entre o modelo-EMT induzida e painel de linha de células, incluindo as alterações a componentes da matriz e proteoglicanos, a sulfatação de glicosaminoglicanos; membros da família do receptor de manose; iniciação de O-glicosilação; e certas formas de sialilação. alterações no nível de proteína foram confirmados por Western blot para o MRC2 manose receptor eo GALNT3 enzima O-glicosilação, e de superfície celular foram confirmados mudanças sulfatação usando coloração Alcian Blue.

Conclusões /Significado

alterações à glycogenes são um componente importante de EMT cancro e são caracterizadas por alterações nos componentes da matriz, a sulfatação de glicosaminoglicanos, receptores de manose, o-glicosilação, e estruturas específicas sialilados. Estes resultados fornecem pistas para a segmentação formas resistentes agressivos e drogas de células de câncer de pâncreas

Citation:. Maupin KA, Sinha A, Eugster E, Miller J, Ross J, Paulino V, et al. (2010) Glycogene Expressão alterações associadas com cancro do pâncreas epitelial-mesenquimal Transição em Complementares sistemas modelo. PLoS ONE 5 (9): e13002. doi: 10.1371 /journal.pone.0013002

Edição: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil

Recebido: 26 Abril de 2010; Aceito: 30 de agosto de 2010; Publicação: 27 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Maupin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer (www.cancer.gov) (R03CA139225 para BH, Institutos Nacionais de Saúde [NIH] R01 CA132571 a VK, e NIH R01 CA130940 NT), a American Cancer Society (www.cancer.org) ( CSM-116801 para VK), o Instituto Nacional de Distúrbios neurológicos e Derrame (www.ninds.nih.gov) (NIH R01 NS042262 a MB) e do Instituto Andel Research Van (www.vai.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas tem uma das taxas de sobrevivência mais pobres de qualquer grande câncer [1]. A letalidade extremo de cancro pancreático está relacionada com a sua tendência para difundir nas fases iniciais antes do diagnóstico [2], [3] e a sua resistência aos agentes quimioterapêuticos [2], [4]. A aquisição de características migratórias e resistentes a fármacos em células cancerígenas pancreáticas pode ocorrer de uma forma passo-a-passo, acompanhada pelo aumento alterações para a genética e morfologias das células cancerosas. Fase inicial e em estados pré-malignas são pensados ​​para consistem em células displásicas dentro de ductos pancreáticos [5], e a progressão para ductal adenocarcinoma é caracterizada pela proliferação de células epiteliais cancerosas montados em estruturas ductal tubo-como cercadas por estroma fibrótico. A disseminação metastática do câncer de pâncreas requer células de romper com as estruturas ductal epiteliais e assumir características de células migratórias, mesenquimais. Esta transição implica enormes remodelação da célula e é provavelmente dirigido por aberrações genéticas, sinais extracelulares, e a activação dos programas de diferenciação nas células cancerosas. Caracterizando as alterações moleculares associados com a chave fenotípica em células de câncer de pâncreas a partir do epitélio-como traços mesenquimais-like irá fornecer insights sobre avenidas para detectar e orientar essa conversão.

Esta grande mudança fenotípica em células de câncer de pâncreas pode ser impulsionado por a transição epitelial-mesenquimal (EMT). EMT é um programa biológico que coordena a conversão da diferenciação das células a partir das características epiteliais de forte adesão célula-célula, polaridade, morfologia e lisa para as características mesenquimais de contactos célula-célula mínima, perda da polaridade, e aumento projecções celulares [2] , [6], [7], [8], [9]. A EMT é normalmente ativado no desenvolvimento e na cicatrização de feridas durante a remodelação do tecido, mas é pensado para ser anormalmente ativada por determinados tipos de células cancerosas para conferem os traços associados a cancros altamente letais. Várias linhas de evidência apoiar a importância da EMT na promoção da agressividade do câncer de pâncreas. A perda histológica geral de diferenciação celular é um preditor de alta precisão de mau prognóstico no câncer de pâncreas [10], [11], e os marcadores de EMT específicas de redução da E-caderina e aumento da vimentina correlacionam com a sobrevivência pobre [12], [13] e invasão [14]. modelos do rato do cancro do pâncreas recapitular essa relação [15]. De acordo com estas constatações, a indução de um factor de transcrição denominado caracol, que controla a repressão da E-caderina, resulta no aumento da metástase e quimiorresistência de células de cancro pancreático [16]. Além disso, as células cancerosas mesenquimais semelhante pode ser mais resistente a drogas do que as suas contrapartes epiteliais semelhantes, tal como sugerido pela correlação entre gencitabina resistência e mesenquimais traços [17] e a perda de sensibilidade do EGFR-inibidor em células de cancro do pâncreas que têm traços epiteliais-como perdidos [8]. intensas investigações descobriram muitas das mecanismos de regulação e moleculares características desta conversão [2], [6], [7], [8], [9], mas os fatores in vivo no trabalho em EMT câncer e que são relevantes a progressão do cancro pancreático não são claras.

a glicosilação de uma célula de câncer pode ser significativamente remodelado durante a EMT, embora a natureza desta associação não foi bem caracterizada. A glicosilação é um processo dinâmico que envolve uma interacção concertada entre várias glicosiltransferases e enzimas associadas no retículo endoplasmático e aparelho de Golgi [18]. estruturas de glicano estão envolvidos na proteína dobramento apropriado [19], [20], [21], o tráfico intracelular [18], [20], [22], crescimento e diferenciação celular, [20], [23], a adesão e migração [18], [24], e a imunidade baseada em células [20], [25], entre outras funções. Alterações em glicanos foram detectados e implicada em várias condições patológicas [23], [26]. Além disso, as estruturas de hidrato de carbono sobre superfície celular e as proteínas secretadas são bons indicadores de tipo de células e estado, uma vez que sejam alteradas em associação com o desenvolvimento [27], [28], a diferenciação de células e activação [29], [30], e transformação [31]. Portanto, a hipótese de que EMT câncer de pâncreas é caracterizada por alterações específicas de glicosilação que desempenham papéis funcionais na diferenciação de células cancerosas ou migração.

Como passo inicial em testar esta hipótese, examinamos a expressão de genes relacionados com a glicosilação em três sistemas modelo de EMT ou migração. Monitorando a expressão do gene é experimentalmente mais dócil do que abrangente caracterizar estruturas de glicano associados a cada modelo de sistema, e, portanto, escolheu este caminho para uma investigação inicial. Embora não seja possível deduzir estruturas de glicano simplesmente da expressão gênica de glycogenes, alterações de expressão em glycogenes fornecer insights sobre as principais alterações estruturais, bem como leva em pontos-alvo para intervenção terapêutica. Alterações de expressão em glycogenes anteriormente foram examinadas usando microarrays focadas ou matrizes de PCR concebidos para medir especificamente as transcrições relevantes, [33], [34] [32]. Aqui demonstramos a utilização de todo o genoma expressão de perfil para capturar a mesma informação ao analisar selectivamente os dados a partir de uma lista de genes-alvo de 587 genes de glicano-associados (incluindo genes relevantes para EMT). Uma vantagem desta abordagem é a capacidade de utilizar plataformas perfil de expressão padrão, bem como dados históricos que não foi gerado especificamente para examinar glycogenes. Foram utilizados sistemas de cultura de células de EMT em que poderiam ser controladas por estimulação com TGFp (modelo 1) ou em que o estado de diferenciação terminal de uma variedade de linhas celulares poderiam ser classificados como epitelial-mesenquimal como ou semelhante (modelo dois). Além disso, nós examinamos os padrões de expressão de genes em células que foram ou migrando de forma ativa ou estacionários (modelo 3). Cada sistema modelo representa um aspecto diferente do comportamento das células relativas a EMT: transição ativa entre os estados, estados diferenciação terminal, ou a atividade de migração. Relatamos aqui as principais alterações a-glicanos associado a expressão de genes que estão associados a cada um dos sistemas de modelo e que são comuns entre os sistemas modelo.

Resultados

expressão Glycogene na EMT induzida por TGF

O primeiro sistema modelo em que nós examinamos as mudanças de expressão glycogene foi indução TGF de EMT nas linhas de células Panc-1 e A549. A linha de células A549 não foi derivado de câncer pancreático, mas foi incluído para fornecer informações sobre a generalidade das associações com EMT. Além disso, ao olhar para genes que mudam em ambas as linhas celulares, que reduziu a lista de genes candidatos. TGFp tratamento resultou na dissolução de adesão célula-célula e aumenta em projecções fusiformes em ambas as linhas de células (Figura S1). medições de expressão todo o genoma foram obtidos para as células tratadas e não tratadas usando gene chips Affymetrix. Para uma análise focada em genes de interesse, usamos nossa lista de 587 genes relacionados com a glicosilação e vias associadas a EMT (ver Tabela S1).

Em primeiro lugar, procurou determinar se os genes relacionados com a glicosilação mostrou uma taxa mais elevada de expressão mudanças do que todos os outros genes (Tabela 1), o que pode indicar um papel proeminente para alterações de glicosilação em EMT. Entre todos os genes, 1,524 alvos exclusivos Affymetrix mudou a expressão tanto em Panc-1 e A549 após o tratamento com TGF-p. Desde que os nossos genes relacionados glicano representaram 1,5% do total de alvos únicos Affymetrix U133 mais 2,0, a representação aleatória de glycogenes prevê uma representação correspondente a 1,5% do glycogenes (ou 23 genes) entre aqueles que mudou de expressão. No entanto, 40 dos 1.524 genes (2,6%) foram glycogenes da nossa lista de alvos. Esta diferença foi significativa pela análise do qui-quadrado (X

2 = 13,05, p 0,05). Este resultado sugeriu um enriquecimento de regulação da transcrição de genes relacionados-glicano em EMT induzida por TGF-p.

Um exame dos genes que foram alterados mais do que 1,5 vezes em ambas as linhas celulares (Tabelas 2 e 3 ) revelou alguns temas funcionais. A maior mudança foi no SPOCK1 proteoglicanos, que contém cadeias laterais de glicosaminoglicanos de sulfato de condroitina-heparina e [35]. Relacionado com esta proteína, os genes que modificam a sulfatação de glicosaminoglicanos foram sobre-regulada, incluindo SULF2, CHST3, e CHST11, e HAS2 foi regulado para cima, que está envolvida na síntese do hialuronano glicosaminoglicano. Um receptor de lectina do tipo envolvido na motilidade celular e remodelação da matriz extracelular, MRC2, foi regulado positivamente. Alterações no início de O-glicosilação foram indicados por mudanças GALNT2 e GALNT10, e as mudanças de adesão da matriz foram representados pela regulação positiva de vários integrinas eo LAMC2 proteína de matriz (gama 2 laminina). Outros genes elevados representam EMT e TGF funções de sinalização. Os seis genes com expressão reduzida mostrou nenhum enriquecimento particular na especificidade, com ST8SIA4 ser o único glycosyltransferase reduzida.

Glycogene Expressão em uma linha de células do cancro do pâncreas Painel

O segundo sistema de modelo foi um painel de 22 linhas celulares de cancro pancreático. Observou-se uma diversidade de morfologias celulares e comportamentos de adesão entre as linhas de células (Figura 1). Certas linhas celulares têm características fortes epiteliais (morfologias arredondadas e numerosos contactos célula-célula), enquanto outros são claramente mesenquimais-like (projeções fusiformes e poucas adesões célula-célula). Por isso buscou-se identificar as características de expressão de genes que diferenciam esses dois comportamentos. Esta comparação não trata diretamente EMT, mas sim dá insights sobre os estados de diferenciação terminal associado com o mesenquimais e fenótipos epiteliais.

linhas de células mesenquimais-like são apresentados nas duas primeiras linhas e linhas de células epiteliais-like que estejam nas duas linhas inferiores. Note-se a dispersão aumentada da célula e do fuso como projecções observadas nas células mesenquimais do tipo, em comparação com a adesão célula-célula mais apertado e mais esférica forma característica das células epiteliais. As imagens foram recolhidas por microscopia de contraste de fase em 10 × ampliação.

Inicialmente classificadas as linhas de células como quer epitelial-mesenquimal como ou semelhante com base na morfologia e agrupamento (Figura 1). As linhas celulares, tais como CAPAN-2, HPAF-II e BxPC-3 têm colónias densas, arredondadas e foram classificados como sem ambiguidade epitelial semelhante. Na outra extremidade do espectro de MiaPaCa-2 e MPanc-96 mostrou claramente as características mesenquimais de interacções célula-célula de baixo do fuso e as projecções como celulares. Outras linhas de células foram mais difíceis de classificar por estas características, que mostram características mistos ou parciais de cada tipo. Por isso, olhou para a expressão de genes relacionados com o EMT como um meio de classificação (Figura S2). Entre esses genes (veja a Figura S2 para a lista completa), o fator de transcrição ZEB1 correspondeu mais claramente a morfologia e fortemente correlacionada com a regulação para baixo do marcador epitelial, E-caderina (CDH-1) [6], [7], [8 ], [9], em que as células mesenquimais semelhante. Uma dicotomia marcante de células que foram negativos ou positivos para ZEB1 era evidente, dividindo as linhas celulares em seis que estavam mesenquimais-like e 16 que foram epiteliais semelhantes. Com base nessa classificação, a expressão da caderina-E (CDH-1) foi significativamente até regulamentada (p≤0.01) ea expressão de vimentina (VIM) foi significativamente baixo regulada (p≤0.01) nas células epiteliais. O padrão de expressão destes dois genes da proteína foi confirmada por Western blot (Figura 2). Por isso usamos essa classificação em análises subsequentes.

Os lisados ​​foram recolhidos a partir das linhas de células seleccionadas, fraccionadas por SDS-PAGE, e sondado por Western Blot. As bandas destacadas estão nos pesos moleculares esperados de 110 KD para E-caderina, 57 kD para vimentina e 42 kD para a actina.

Nós examinamos se os genes de glicano-relacionados foram diferentes entre os grupos de uma taxa mais elevada do que todos os outros genes (Tabela 1). Estritamente por acaso, uma vez que nossos genes relacionados glicano representaram 1,5% do total das únicas 2,0 alvos Affymetrix U133 Plus, esperávamos uma representação correspondente a 1,5% do glycogenes entre a lista do total de genes de mudança. No entanto, dos 3.675 sondas que mostraram alterados significativamente os níveis de expressão (p ≤ 0,05) entre as células mesenquimais-like e as células epiteliais-like, 87 (2,37%) foram glycogenes da nossa lista de alvos. Uma análise do qui-quadrado mostrou estes resultados a ser altamente significativa (X

2 = 18,9, p≤0.005). Esta tendência manteve-se em níveis mais elevados de importância como 1212 alvos exclusivos Affymetrix mostraram significativamente diferentes níveis de expressão (p≤0.01). Essas metas, 30 (2,48%) estavam na nossa lista como glycogenes, também uma diferença significativa pelo teste do qui-quadrado (X

2 = 8,12; p≤0.005). Esta análise sugeriu um enriquecimento de regulação da transcrição de genes de glicano-relacionados na diferenciação de células mesenquimais entre e fenótipos epiteliais.

As alterações de expressão gênica para este sistema modelo estão resumidos nas Tabelas 4 e 5. Semelhante ao anterior, um proteoglicano foi o mais significativamente sobre-expresso nas células mesenquimais, como, neste caso VCAN (versicam), e os genes que regulam a sulfatação de glicosaminoglicanos foram sobre-regulada, incluindo SULF2, CHST7, SGSH, e NDST2. a modificação da matriz também foi representada por regulação positiva de VIM (vimentina) e LAMA4 (alpha 4 laminina). Ao contrário do modelo de EMT induzida, genes envolvidos na ramificação ou estender cadeias de glicano foram regulados positivamente nas células mesenquimais-like, incluindo MGAT5B, ST3GAL2, ST6GALNAC4, POMGNT1 e B3GNT1. As células mesenquimais-like também mostrou uma impressionante infra-regulação em alguns genes, mais notavelmente GALNT3, que inicia O-glicosilação. GALNT3 foi regulada para baixo em todas as seis células mesenquimais-like, com uma redução média de ~1000 vezes. Dois lectinas do tipo C também foram regulados negativamente, LY75 e CLEC3A. Os padrões de expressão destes genes distinguir claramente as linhas de células mesenquimais do tipo do epitelial semelhante (Figura 3)

genes foram incluídos que tinham significativamente diferente (p 0,01). Os níveis de expressão entre a mesenquimal-like ( rótulos de coluna cor vermelha) e os rótulos de coluna (epiteliais-como de cor preta) linhas celulares. Os valores de expressão foram log transformados (base 10) e mediana centrada por linha. O valor de cada quadrado é indicado pela barra de cores.

expressão Glycogene na migração e as células de câncer de pâncreas estacionárias

O terceiro sistema modelo foi uma comparação de migração de células para células activamente estacionárias [36]. células Panc-1 e MiaPaCa-2 foram semeadas como definido circunferência 1 mm e as células foram deixadas migrar durante 48 h. Foram observadas duas populações morfológicas distintas. As células na periferia do agrupamento de células migraram para fora da região de elevada densidade celular (RIM) e assumiu um fenótipo mesenquimal clássica com fuso como projecções e a perda de célula para a adesão celular. As células que permaneceram no centro densamente povoada (core) apresentaram maior adesão intercelular e foram mais arredondado na aparência. As células foram colhidas em “RIM” e grupos “core”, recolhendo selectivamente a partir de cada um destes dois grupos.

2,778 alvos exclusivos expressão alterada pelo menos +/- 0,25 vezes tanto na migração de MiaPaCa-2 e Panc-1 quando comparado com os seus homólogos estacionários (Tabela 1). Desde que os nossos genes relacionados com o glicano representou 3,0% do total original Agilent Whole Human Genome Microarray Kit (4 × 44K sondas), acaso previu uma representação correspondente 3,0% do glycogenes entre a lista de genes que mudou. Esse nível de representação foi efetivamente observada, como 84 dos 2778 genes (3,0%) com níveis alterados de expressão foram glycogenes da nossa lista de alvos. Uma análise de qui-quadrado revelou que a diferença entre a mudança observada na glycogenes não foi significativa em comparação com o valor esperado. Estes resultados não sugerem um enriquecimento da regulação de genes de glicano-relacionados em caracterizar diferenças entre migração ativa e células estacionárias.

genes Menos mostraram expressão diferencial entre os grupos que nos modelos anteriores (Tabelas 6 e 7). Oito genes alvo expressão aumentada em mais de 1,5 vezes na migração de ambos MiaPaCa-2 e Panc-1. Sem genes aumentou em mais do que duas vezes em ambos os tipos de células. Não temas claros em função glycogene eram discerníveis entre os genes com expressão aumentada. Nove genes alvo diminuição dos níveis de expressão de mais de 1,5 vezes em ambos Migração MiaPaCa-2 e Panc-1. Dois estão relacionados com a remoção de manose na biossíntese de N-glicanos, MAN1A2 e manba. A mucina MUC12 foi o único gene com a diminuição da expressão maior do que duas vezes em ambos os tipos de células.

genes compartilhados e temas funcionais

A seguir investigados se determinado a expressão do gene alterações eram comuns entre dois ou mais dos sistemas-modelo. Tal análise é útil para fornecer mais orientação sobre quais genes são importantes em vários aspectos da EMT ou são funcionalmente importante nos processos relacionados com a EMT. A sobreposição entre os sistemas modelo foi ligeira. Na comparação EMT induzida por TGF e do painel de linha celular, apenas três genes eram comuns: ZEB1 e SULF2 foram regulados positivamente em ambos os modelos, e CDH1 foi diminuída em ambos. Usando dados apenas a partir da linha celular de Panc-1 no TGFp-induzida e migrar modelos celulares, ST6GALNAC4 aumentada e Pigm diminuiu em todos os sistemas modelo. Estes resultados mostram que, enquanto glycogenes são alterados em cada modelo e são particularmente enriquecido em induzida por EMT e o painel de linha de células, os genes específicos envolvidos em cada são divergentes entre os sistemas.

Apesar de muitos dos genes alterados eram diferente entre o modelo-EMT induzida e painel de linha celular, vários temas funcionais estavam presentes em ambos. O tema partilhada mais predominante foi a modulação da (GAG) componente de glicosaminoglicano da matriz extracelular. SPOCK1 e VCAN (versicam) são ambas proteínas da matriz portadores de cadeias de GAG, e ambos os sistemas mostraram-regulação de genes que agregam e tirar sulfato dessas cadeias, incluindo SULF2, CHST3, CHST11, HAS2, CHST7, SGSH e NDST2. Um ensaio de azul Alcian foi realizado para caracterizar ainda mais os níveis globais de sulfatação entre o epitélio e linhas de células mesenquimais semelhantes, bem como após a indução de EMT em Panc-1 pelo TGFp (Figura 4). Um aumento significativo na sulfatação geral foi observada para as linhas de células mesenquimais-like (p = 1,29 × 10

-5). Induzindo EMT em Panc-1 por TGF continuou a tendência de aumentar significativamente os níveis globais de sulfatação (p = 0,027). Estes resultados confirmam as alterações celulares sulfatação para os dois sistemas de modelo em que foram sugeridos pela expressão do gene.

(A) RT-PCR foi realizada em lisados ​​de linhas celulares indicadas, e as intensidades das bandas ao esperado tamanho para cada gene foram quantificados. um teste t de estudante (resultados indicados pelo valor de p) foi realizado comparando as intensidades de banda entre as linhas mesenquimais como células-(em negrito) e as linhas de células epiteliais. Além disso, uma correlação foi calculada (resultados dados pelo valor r) entre os resultados de RT-PCR e os dados de microarray. desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi utilizada como um controlo de carga de ADNc. (B) A comparação dos níveis de proteína GALNT3 por Western blot, em linhas celulares de cancro pancreático seleccionados. Os lisados ​​foram recolhidos a partir das linhas de células seleccionadas, fraccionadas por SDS-PAGE, e sondaram-se por Western Blot. células mesenquimais-like são rotulados em negrito. As bandas realçados são os pesos moleculares esperados de 73 kD para 42 kD GALNT3 e para a actina. níveis (C) MRC2 proteína medido por transferência de Western em células tratadas e não tratadas TGFp. As linhas celulares foram expostas quer a 5 ng /mL de TGF-p ou não tratado sob privação de soro durante 72 horas antes da lise celular. As bandas destacadas estão nos pesos esperados moleculares de ~167 KD para MRC2 e 42 kD para actina.

Outro tema em comum entre o modelo-EMT induzida e painel de linha celular foi alterações para lectin- como receptores da família do receptor de manose. Os quatro membros desta família, MRC1, MRC2, LY75, e CD302, são receptores de endocitose transmembranares com múltiplos domínios de ligação de hidratos de carbono. MRC2 foi regulada e CD302 foi regulada para baixo no modelo de EMT induzida e LY75 foi regulada para baixo no painel de linha celular. Os dois modelos de EMT também alterações ao membro da família transferase de N-acetil-galactosamina (GalNAc), que catalisam a adição inicial de GalNAc para uma serina ou treonina no resíduo de tipo mucina de glicosilação ligada a O partilhada. GALNT2 e GALNT10 foram regulados positivamente em EMT induzida, e o discriminador GALNT3 foi mais forte de células epiteliais e mesenquimais como do tipo de painel de linha de células, com expressão cair abaixo dos níveis mensuráveis ​​nas células mesenquimais (Figura 4).

Validação de gene Expression Diferenças

A expressão diferencial de genes em linhas celulares semelhantes a epiteliais mesenquimais e semelhante foi confirmada por certos genes utilizando RT-PCR e Western Blot (Figura 5). As correlações entre os resultados de microarray RT-PCR e foram geralmente consistentes, com as correlações mais fortes vistos para GALNT3, 0,912; ZEB1, 0,774; GMPPA, 0,735; e MAN2B2, 0,713; e correlações mais fracas para ST3GAL6, 0,509; e PMM1, 0,415. alterações no nível de proteína foram confirmados por Western Blot para GALNT3 e MRC2. detecção GALNT3 foi positiva para as linhas de células epiteliais BxPC-3, HPAF II, e SU86.86 enquanto permanece sem ser detectada nas linhas celulares mesenquimais semelhante MiaPaCa-2, MPanc-96, e Panc-1. MRC2 foi detectado apenas em A549, Panc-1, e MiaPaCa-2 e apresentaram níveis aumentados depois do tratamento com TGFp nestas três linhas de células. Não havia nenhum nível detectável de MRC2 para BxPC-3 ou Hs766T na presença ou na ausência de TGF-p.

Um ensaio de Alcian Blue foi realizada em lisados ​​de linhas celulares indicadas, e a sulfatação total para cada linha celular foi quantificados através da medição da absorvância do corante a 600 nm. um teste t de estudante (resultados dada pelo valor de p) foi realizado comparando as absorvâncias entre as linhas de células mesenquimais-like (em negrito) e linhas de células epiteliais, bem como entre Panc-1 após 72 horas de tratamento TGFp e não tratada Panc- 1. A heparina foi utilizada como um controlo de GAG ​​sulfatado. (A) A fotografia da retenção resultante de Alcian Blue corante após a precipitação de glicanos sulfatados e posterior re-suspensão. A segunda coluna representa as linhas de células mesenquimais do tipo e reteve mais de manchas, indicando a presença de níveis mais elevados de glicanos sulfatados nos lisados ​​celulares. gráficos (B) de barras que mostra as diferenças da absorvância a 600 nm para as linhas celulares. As linhas de células mesenquimais-like (em negrito) tinham níveis significativamente mais elevados de absorção do que as linhas de células epiteliais remanescentes (p = 1,29 × 10

-5). gráficos (C) de barras que mostra as diferenças da absorvância a 600 nm para Panc-1 após 72 horas de exposição a 5 ng /mL de TGF-p ou não tratado sob privação de soro. Panc-1 após o tratamento TGF tinham níveis significativamente mais elevados de absorção do que o não tratada Panc-1 (p = 0,027).

Discussão

A capacidade de detectar ou EMT controle no câncer de pâncreas poderia conduzir a melhores estratégias de tratamento. A caracterização de alterações moleculares associados com EMT é um primeiro passo para desvendar alguns dos mecanismos de accionamento deste processo. Definindo as mudanças de glicano associados com EMT pode ser especialmente importante para a compreensão deste processo, dada a conhecida envolvimento de glicanos em outros processos de diferenciação celular. expressão todo o genoma Profiling combinado com uma lista gene alvo de 587 genes relacionados com a glicosilação foi um meio prático de investigar glicosilação neste sistema biológico. Além disso, o uso de três sistemas in-vitro modelo provou ser útil para examinar aspectos complementares da epiteliais e mesenquimais estados, ou seja, a transição ativa entre estados, os estados de diferenciação terminal, eo ato de migração.

A importância das alterações de glicano em EMT foi apoiado pela frequência de alterações para genes associados a glicosilação (Tabela 1). genes associados-glicano foram alteradas com mais frequência do que foi previsto em dois dos sistemas modelo, TGFp-induzida EMT e os painéis de linhas de células, mas não no modelo de migração celular. A constatação de que a remodelação de glicano é um aspecto importante do processo de diferenciação celular seria consistente com trabalhos anteriores demonstrando a importância das alterações de glicano na biologia das células estaminais e a activação imunitária [27], [31], [37]. A falta de grandes mudanças glycogene na migração celular entre pode indicar que as células que migram não foram realmente diferenciar, mas sim apenas alterando a expressão para a mecânica da migração. Portanto as alterações de glicano pode ser mais importante como indicadores de tipo de células e estado em vez de como contribuintes funcionais para a migração. No entanto, deve notar-se que a alteração da actividade de glicosiltransferase, em modelos de linhas celulares demonstraram efeitos diferenciais sobre a capacidade migratória

In vitro

[38], [39], [40]. No caso de Panc-1 e MiaPaCa-2, que já pode possuir o glicano-maquinaria necessária para uma capacidade melhorada de migração; transformação adicional pode não ser necessário. Esta área da investigação também foi limitado a duas linhas celulares de cancro do pâncreas em muito específico

in vitro

condições. Futuras análises usando mais linhas celulares e diferentes métodos de separação migratório a partir de células estacionárias pode render novas descobertas.

Os temas funcionais compartilhadas pelo modelo EMT induzida e painel de linha celular de dar alguns insights sobre os papéis de glicosilação em EMT . As alterações de proteoglicanos e enzimas sulfatação sugerem a importância do controle de sulfatação de GAG ​​em EMT. Este resultado é consistente com pesquisas anteriores mostrando alterações aos componentes da matriz, como versicam [41] e as alterações ao GAG sulfatação [42], em associação com o câncer, particularmente em formas agressivas de câncer. As funções de promoção de cancro de versicam pode actuar através de regulação da actividade do factor de crescimento e através da interacção com células do sistema imunológico e estromais [43], funções que podem ser modificadas por alterações de sulfatação. SPOCK1 pode funcionar através de mecanismos semelhantes, mas é menos bem estudada. SULF2, que estava fortemente sobre-regulada em ambos os sistemas e actua para remover sulfatos de certas cadeias de GAG, também tem sido associada com a carcinogénese pulmonar [44] e a tumorigenicidade de células de cancro pancreático [45]. As funções de promoção de cancro de SULF2 parecem funcionar através da activação de sinalização de Wnt ou libertar factores de crescimento a partir da matriz extracelular, o que também pode ter um efeito pró-angiogénico. A associação destas funções com EMT cancro sugere que as células de cancro submetidos a EMT usar um recondicionamento do espaço extracelular para se tornar altamente invasivo.