Abstract

Os homens que vivem em Fiji e que bebem kava têm baixa incidência de câncer de próstata (PCA). No entanto, a incidência de CaP entre os homens de Fiji que migraram para a Austrália, aumentaram 5,1 vezes. Estudámos, portanto, os efeitos potenciais de extratos kava raiz e seus componentes ativos (kavalactones e flavokawains) sobre o crescimento APC e expressão do receptor de andrógeno (AR). linhas celulares de PCA (LNCaP, LAPC-4, 22Rv1, C4-2B, DU145 e PC-3) com diferente expressão do AR, e uma linha de células transformada de miofibroblastos próstata (WPMY-1), foram tratados com um extrato kava comercial, cavalactonas ( kawain, 5’6′-dehydrokawain

PSA

e

TMPRSS2

) foi examinada, yangonin, methysticin) e flavokawain B. A expressão de AR e de seus genes-alvo (. Dois novos derivados de paciente modelos de xenoenxerto de CaP de espécimes de CaP de alto grau foram estabelecidas através da implantação de os espécimes em ratinhos nus e passando peças tumorais através de injecção subcutânea em ratinhos nus, e depois tratou-se com extracto de kava e flavokawain B para examinar os seus efeitos sobre o crescimento do tumor, expressão AR e os níveis de PSA no soro. O extrato de kava e flavokawain B efetivamente regulada a expressão tanto da AR de corpo inteiro e variantes AR emenda. O extrato de kava e kavalactones acelerada degradação de proteínas AR, enquanto flavokawain B inibiu

AR

mRNA transcrição via diminuindo expressão SP1 e a ligação do SP1 para o promotor AR. O extrato de kava raiz e flavokawain B reduzir o crescimento do tumor, expressão AR em tecidos e níveis de PSA no soro de tumor nos modelos de xenotransplante de CaP derivado do paciente. Estes resultados sugerem um potencial utilidade de um produto kava seguro ou de seus componentes ativos para prevenção e tratamento de CaP avançado, visando AR

Citation:. Li X, Liu Z, Xu X, Blair CA, Sun Z, Xie J, et ai. (2012) Kava Componentes para baixo-regulam a expressão de AR e AR variantes de processamento e reduzir o crescimento em Paciente-Derived Prostate Cancer xenoenxertos em ratinhos. PLoS ONE 7 (2): e31213. doi: 10.1371 /journal.pone.0031213

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de novembro de 2011; Aceito: 04 de janeiro de 2012; Publicação: 09 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede CA129793 e CA122558 (https://www.cancer.gov/)and American Institute for Cancer Research conceder 41493 (https://www.aicr.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Ásia /Pacífico homens que consomem uma baixo teor de gordura e dieta baseada em vegetais têm as menores taxas de CaP clínica no mundo [1], [2]. No entanto, quando os homens asiáticos migram para os EUA, as taxas de CaP clínica aumentar [3]. Estas observações implicam ambos os fatores ambientais e hábitos alimentares (como o consumo de baixo teor de gordura e dieta baseada em vegetais) no desenvolvimento de CaP. Portanto, uma das estratégias de prevenção e tratamento do CaP tem-se centrado sobre o uso de componentes de alimentos bioativos naturais e sintéticas.

Kava (

Piper methysticum Forst

) é uma planta perene indígena para o Pacífico Islands. raiz Kava e rizoma são usados ​​para preparar uma bebida não fermentada e cerimonial com efeitos relaxantes nas ilhas do Pacífico há milhares de anos [4]. Anormalmente baixa incidência de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão e de próstata, são relatados nas nações insulares do Pacífico, apesar de uma grande proporção de fumantes nessas populações [2], [5]. Além disso, Steiner [6] relatou que a incidência de câncer de idade padronizada para os três maiores países de beber kava (Vanuatu, Fiji e Samoa Ocidental) foi um quarto ou um terço do que países não-potável-kava, como Nova Zelândia e Estados Unidos (Havaí e Los Angeles), e polinésios não potável-kava (Maoris). Excepcionalmente, nestes três países de beber kava kava mais homens beber e fumar do que as mulheres, ainda há uma menor incidência de câncer para os homens que para as mulheres [6]. Além disso, o cancro do Conselho do Câncer, em Nova Gales do Sul (NSW) Migrantes 1991-2001 relatório constatou [7] que a incidência de CaP em homens de Fiji que migraram para e eram residentes em NSW, Austrália, aumentaram 5,1 vezes em comparação com aqueles que vivem em Fiji . Este relatório nos levou a investigar os potenciais benefícios de extratos de kava e seus componentes ativos para a prevenção do CaP.

Nós relatamos pela primeira vez que um extrato kava comercial e seus componentes ativos (kavalactones e flavokawain B) para baixo regular a expressão de AR. Depleção da proteína AR ocorreu através de dois mecanismos diferentes: 1) degradação de proteínas aumentada AR, e 2) reduziu proteína Especificidade 1 (SP1) mediada por transcrição AR. Kava

Métodos

declaração Ética extrair e flavokawain tratamento B de camundongos com xenoenxertos derivadas de pacientes reduziu o crescimento do tumor e expressão de AR e seus genes alvo em tecidos tumorais, e os níveis séricos de PSA rebaixados.

uso de camundongos e seus cuidados para este estudo foi especificamente aprovadas pela University of California, Irvine Institutional animal Care e Use Committee (IACUC; número do protocolo 2007-2741).

as linhas celulares, compostos e reagentes

O LNCaP, LAPC4, 22Rv1, PC3, DU145, e linhas celulares WPMY-1 foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA), e a linha celular foi C4-2B de Urocor Inc. (Oklahoma City, OK). Estas células foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS). Todas as linhas celulares utilizadas neste estudo estavam dentro de 20 passagens após a recepção. As linhas de células foram testadas e autenticado pela ATCC ou Urocor Inc. Todas as linhas de células também foram testadas para espécies conhecidas de contaminação por micoplasma, usando um kit de Lonza Inc. (Walkersville, MD). kawain Pura, 5 ‘, 6’-dehydrokawain, yangonin, methysticin, e flavokawain B (99%) foram isolados a partir de extractos de kava por LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Kava extracto de raiz a uma concentração de 150 mg /ml cavalactonas em etanol a 50% foi obtido a partir de Gaia Ervas (Brevard, NC). Os anticorpos contra a tubulina e AR eram de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). anticorpos de PSA e Sp1 foram adquiridos a Thermo Scientific (Fremont, CA). 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) era da Sigma. RNAzol B foi adquirido a partir de Tel-Test (Friendswood, TX.). O kit de transcrição reversa do sistema e era da Promega (Mandison, WI). Um kit de RT-PCR quantitativo foi de Bio-Rad (Hercules, CA).

Medição da kavalactones e flavokawains no kava raiz extrato

O extrato de kava foi diluído 400 vezes por acetonitrilo e depois filtrou-se com filtros de 0,45 um resistentes a solventes e armazenado a -80 ° C até análise posterior. A cromatografia foi realizada num Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) sistema (Waters Corp., Milford, MA, EUA) com um auto-amostrador a 8 ° C. A separação dos compostos foi levada a cabo a 50 ° C usando uma coluna Waters Acquity UPLC ®BEH C18 1,7 pM (2,1 x 50 mm) com um gradiente de eluição: (A) água: acetonitrilo: ácido acético (97.8:2:0.2 v /v /v), e (B) acetonitrilo:. 99.8:0.2 ácido acético (v /v) como a fase móvel

o programa de eluição foi como se segue: 10% de B (inicial), 90% de B (1,0 min), 90% de B (2,0 min), 10% de B (2,05 min), e 10% (3 min). A taxa de fluxo foi de 0,3 mL /min e o volume de injecção foi de 10 ul. A UPLC foi acoplado a Micromass Quattro Micro líquida espectrometria de massa-cromatografia (LC /MS /MS) triplo espectrómetro de massa de quadrupolo (gama de massa: 2~2000 m /z) com interface de ionização por electrospray (ESI) em modo positivo. O instrumento foi operado em modo de ião positivo com uma voltagem ESI de 3,8 kV, e um fluxo de gás dessolvatação de 700 L /h. Árgon foi utilizado como a induzida por colisão de gás de dissociação a uma pressão de 7,1

E-3 mbar com uma transição de monitorização de reacção seleccionadas para flavokawain A de m /z 315 m /z 181, flavokawain B de 284 181, kawain de 231 115, 5 ‘, 6’-dehydrokawain de 229 131, mythysticin de 275 159, Yangonin de 259 . 161

ensaio MTT

As células foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10

4 por poço em placas de cultura de 24 poços durante 24 horas, e depois tratou-se como indicado nas figuras. Após o tratamento durante 72 horas, 1 mg /ml de MTT foram adicionados a cada poço, durante 2 horas, e a absorvância foi determinada a 570 nm. As curvas de dose-resposta para a inibição do crescimento foram gerados como uma percentagem de controlos tratados com veículo.

análise Western blot

lisados ​​de proteína clarificada (20-100 ug) foram desnaturados e resolvidos por 8-16 % de SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose, e sondados com os anticorpos indicados e visualizados por um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada.

RT-PCR quantitativo

-reacções de amplificação de PCR quantitativa em tempo real para

AR

, antigénio específico da próstata (

PSA) e transmembranar da protease, serina 2 (

TMPRSS2

) os níveis de ARNm foram realizadas utilizando o sistema de MyiQ (Bio-Rad) como descrito anteriormente [8], [9]. As sequências dos iniciadores para

AR

,

PSA

e

TMPRSS2

estão disponíveis mediante solicitação. Os dados foram analisados ​​usando o método comparativo Ct, onde TC é o número do ciclo em que a fluorescência primeira excede o limiar. Os valores do Ct de cada amostra foram obtidas subtraindo os valores para a beta-actina Ct do valor Ct do gene alvo. A variação dos valores de

beta actina

Ct é 0,5 entre as amostras diferentes. Uma diferença de um ciclo de valor de Ct representa uma diferença de 2 vezes no nível de ARNm. Especificidade dos produtos de PCR resultantes foi confirmada por curvas de fusão e gel de agarose.

transfecção, atividade promotora e luciferase Ensaio

Os plasmídeos PSA-Luc e Plars-Luc são um presente amável do Dr. Wang (New York University Cancer Institute) Longgui. Human SP1-HA marcado plasmídeo foi gentilmente cedido por Macus Tien Kuo (The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). C4-2B e células LNCaP foram co-transfectadas com PSA-Luc ou Plars-Luc e o plasmídeo de luciferase de Renilla pGL 4,71 (Promega) ou com SP1-HA plasmídeo por Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Após 48 horas, foi adicionado flavokawain B como indicado com repetições triplas. Em seguida, as células foram colhidas e a actividade da luciferase foi medida com o sistema Dual-Glo Luiferase ensaio (Promega). Renilla luminescência foi usada como um controlo interno para os números de células e a eficiência de transfecção. A proporção relativa de luminescência do promotor do gene de interesse para Renilla luminescência foi mostrado nas figuras como a actividade do promotor. Para o SP1 transfecção, as células foram colhidas para um ensaio immunoblotting.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) [10] células

LNCaP e C4-2B foram reticulados por formaldeído. O complexo de proteína /DNA foi cortado para 500-1500 pb fragmentos por ultra-sons. Quantidades iguais de proteína (4 mg) foram incubadas com anticorpo SP1, ou com um anticorpo de ratinho anti-GFP. esferas de Proteína G-Sepharose (Sigma) foi utilizado para puxar para baixo o complexo, seguida por lavagem com tampão de lavagem de alta sal, LiCl, tampões e TE). Os imunoprecipitados de DNA-proteína foram eluídas a partir das pérolas e o ADN foi extraído e purificado. Expandir-High Fidelity PCR System (Roche) foi usada para amplificar a sequência de 248 a 487 nucleótidos da região 5′-UTR do AR, contendo dois locais de ligação SP1. As sequências dos iniciadores estão disponíveis mediante solicitação.

Tratamento de modelos de xenotransplante tumoral CaP derivadas de pacientes

tecidos prostatectomia foram obtidos através de um protocolo IRB-aprovado na UCI Medical Center. Pequenos fragmentos de tumor provou-histologicamente foram implantados em ratinhos de 8 semanas de idade macho imunodeficiência combinada grave (SCID), utilizando uma técnica xeongraft subrenal [11]. Tumores designados como GM0308 e RC0309 aos 3 e 13 passagens de murino, respectivamente, foram re-implantado em bolsos subcutâneas de SCID. Uma semana mais tarde, quando os tumores cresceram até cerca de 100 milímetros

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento. Para o tratamento extracto kava, os ratinhos foram alimentados com uma dieta padrão suplementado ou com controlo de veículo ou 6 g /kg de extracto de kava na dieta. Para o tratamento flavokawain B, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente a cada dia com controlo de veículo (10% DMSO, 20% de etanol e 70% de Cremophor) ou 200 mg flavokawain B /kg de peso corporal do rato. O tratamento foi continuado desde o dia 0 ao dia 17 para o extracto kava e 27 dias para o crescimento do tumor foi flavokawain B. monitorizados por ambos PSA do soro e medição de compasso de calibre do tamanho do tumor semanalmente. peso corporal e alimentar entradas foram registrados durante os experimentos. No final das experiências, os tecidos tumorais foram pesados ​​e cortadas ao meio para isolamento de ARNm e a coloração imuno-histoquímica, respectivamente. O volume do tumor foi calculado pela fórmula: 0,5236 × G

1 × (L

2)

2, em que L

1 é o eixo mais longo e L

2 é o eixo curto da o tumor. concentração de PSA no soro foi determinada por PSA Enzyme-linked kit ensaio imunoenzimático (Bio-Quant, San Diego, CA) seguindo as instruções do kit.

Imunohistoquímica

Antigen foi recuperada usando 0,05 M de glicina-HCL tampão, pH 3,5, contendo EDTA a 0,01% (v /W), a 95 ° C durante 20 min e corados com AR anti-humano (1:100). A coloração foi visualizada com diaminobenzadina usando o kit Celular e Tecidual coloração (R ​​ D Systems).

A análise estatística

Comparações de quantitativos ensaios de RT-PCR e promotor entre tratamento e controle foram conduzidos experimentos utilizando

t

teste de Student. Para experiências de crescimento do tumor, de medidas repetidas ANOVA foi utilizada para examinar as diferenças nos tamanhos dos tumores entre os tratamentos, pontos de tempo e interações tratamento a tempo. pós-testes adicionais foram realizados para examinar as diferenças nos tamanhos do tumor entre o controlo, o extracto kava, e tratamento flavokawain B em cada ponto de tempo utilizando o método conservador de Bonferroni. Todos os testes estatísticos foram dois lados.

Resultados

O extrato de kava e seus componentes ativos (kavalactones e flavokawain B) diferencialmente inibir o crescimento de AR expressando células

kavalactones e chalconas (ie flavokawains) são duas importantes classes de compostos bioactivos identificados a partir de extratos de kava. Usando UPLC, medimos o conteúdo de kavalactones e flavokawains. O extracto kava comercial dissolvido em etanol e utilizado aqui continha 2,7% kawain, 1,75% 5, 6-dehydrokawain, 3,08% Yangonin, 1,4% methysticin, 0,33% flavokawain B, e 0,21% flavokawain A (Figura 1). Para examinar o potencial de os componentes do extracto kava para inibir o crescimento de APC, as linhas celulares de APC e uma linha de miofibroblastos próstata transformadas foram tratadas com o extracto kava, cavalactonas flavokawain e B. As linhas celulares variam na sua expressão de proteínas AR, bem como os seus dependência de andrógenos. Figura 2 e Tabela 1 mostram que o extrato de raiz de kava semelhante inibida linhas celulares de andrógenos sensíveis e insensíveis APC. O extracto de raiz de kava foi mais potente do que cavalactonas mas menos potente do que flavokawain B na inibição do crescimento. Entre os cavalactonas, 5, 6-dehydrokawain é o agente mais potente na inibição do crescimento de linhas celulares de PCA (Figura 2 e Tabela 1). Tanto o extracto de raiz kava e 5, 6-dehydrokawain igualmente na inibição do crescimento de células LNCaP e C4-2B seu derivado, enquanto flavokawain B foi cerca de 4,5 vezes mais eficaz na redução do crescimento de células C4-2B do que o crescimento das células LNCaP . Dado que o extracto kava tem muito menos flavokawain B e mais 5, 6-dehydrokawain, este resultado sugere que o 5, 6-dehydrokawain ou a sua combinação com outros componentes activos podem desempenhar um papel dominante para o efeito inibidor do extracto de kava sobre o crescimento de linhas de células APC.

as células em placas de cultura de 24 poços foram tratadas com DMSO a 0,1%, extracto de raiz de kava, kawain, 5 ‘, 6’-dehydrokawain, yangonin, methysticin, ou B flavokawain (FKB) nas doses indicadas. Após 72 horas de tratamento, as densidades celulares foram medidos pelo ensaio de MTT. Cada ponto representa a média dos valores de quatro placas independentes; Barras, DP. Cada amostra foi contada em duplicado. IC

50 s foram estimadas pelas curvas de dose-resposta.

Kava extrato de raiz e kavalactones diminuir a expressão de PSA e TMPRSS2 através aceleração da AR degradação de proteínas

a Figura 3A mostra que o extrato de kava e kavalactones (ie kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin e methysticin) acentuadamente para baixo-regulam a expressão de mRNA de genes alvo AR (

PSA

e

TMRSS2

), mas não a expressão do mRNA de AR em células C4-2B. A Figura 3B e C mostra que tanto o extracto kava e cavalactonas individuais diminuir a AR e a expressão da proteína de PSA também. O efeito inibidor do crescimento dos cavalactonas pobre correlação com os seus efeitos sobre a proteína AR sub-regulação. células C4-2B, um derivado LNCaP andrógeno-independente, foram mais sensíveis à AR efeito down-regulação dos kavalactones eo extrato de kava do que as células LNCaP foram.

(A). células C4-2B foram tratados com 0,1% de DMSO, extrato de raiz de kava, dehydrokawain, kawain, yangonin e methysticin durante 8 horas. níveis de mRNA de genes alvo Ar e Ar (

PSA

e

TMPRSS2

) foram determinadas por real-time RT-PCR. As barras são médias ± DP de três medidas quantitativas independentes. Kava extrato de raiz e kavalactones diminuir significativamente a expressão do mRNA de genes alvo AR (Student

t

teste, P 0,01), mas não a de AR (P 0,05). (B) e (C). A expressão da proteína de AR e de PSA em células LNCaP e C4-2B após tratamentos indicados, a uma concentração de sua IC

50 s durante 16 horas foram analisados ​​por Western blot. ácido a-tubulina foi detectado como um controlo de carga. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. Y = yangonin; H = methysticin; D = 5’6; -dehydrokawain; K = kawain, KRE = extrato de kava raiz. (D). C4-2B células foram pré-tratadas com 10 ug /ml de cicloheximida durante 2 horas e, em seguida, suplementado com extracto de raiz ou kava 5’6; -dehydrokawain a uma concentração de suas sub IC

50 s para diferentes períodos de tempo. Após os tratamentos, os níveis de proteína AR foram analisados ​​por transferência de Western e semi-quantificados por densitometria de medição. A blot representativo foi mostrado a partir de três experiências independentes.

A seguir, examinou a estabilidade da proteína AR tratando as células com cicloheximida para inibir a síntese de novas proteínas. A Figura 3D mostra que a proteína AR exibe uma degradação acelerada em células C4-2B tratados com o extracto de kava ou 5’6′-dehydrokawain, quando comparada com a sua estabilidade em células tratadas com o veículo. Às 16 e 24 horas de tratamento, o extracto kava e tratamentos 5’6′-dehydrokawain diminuir os níveis de proteína AR por cerca de 80% e 70%, respectivamente, enquanto que o nível de proteína AR no controlo de veículo só diminui em cerca de 20% e 37% , respectivamente (Figura 3D).

Flavokawain B down-regula a expressão de AR e de seus genes-alvo (PSA e TMPRSS2)

Flavokawain B é o agente mais potente para inibir o crescimento celular entre os componentes bioativos examinados do extrato kava. Por isso, investigamos o efeito da flavokawain B na expressão AR. mostra a Figura 4A que flavokawain B diminuir significativamente a expressão da proteína AR em todas as linhas de células AR expressando (LAPC4, C4-2B, WPMY-1, LNCaP e 22Rv1). Curiosamente, o nível da proteína em células AR WPMY-1 é a mais sensível à flavokawain tratamento B. Desde WPMY-1 representa uma linha de miofibroblastos próstata transformadas [12], este resultado sugere que flavokawain B pode ser um novo agente para o direccionamento CaP estromal AR. Flavokawain B, também diminuiu os níveis de proteína de PSA (Figura 4A). A Figura 4B mostra que flavokawain B inibe a expressão de proteínas de AR e de PSA induzidos por um análogo de androgénio sintético, R1881. Pré-tratamento com um inibidor de proteassoma, MG132, não recuperou o flavokawain B regulada negativamente-AR nível de proteína (Figura 4C). Em contraste com o extracto kava e kavalactones tratamentos, o tratamento das células LNCaP e C4-2B com 5 ug /ml flavokawain B durante 4 e 8 horas resultou num decréscimo acentuado nos níveis de ARNm de

AR

e seu alvo genes

(PSA e TMPRSS2)

(Figura 4D). Estes resultados sugerem que a AR flavokawain B mediada por sub-regulação é através da sua regulação da transcrição.

(A) .A expressão da proteína de tratamentos indicados após AR e de PSA durante 16 horas ou FKB 5 ug /ml para o período indicado de tempos foi analisada por Western blot. ácido a-tubulina foi detectado como um controlo de carga. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. (B) .western análise de transferência mostra que FKB diminui tanto constitutivo e um andrógeno sintético, R1881, estimulado expressão AR e PSA em células LNCaP. As células LNCaP foram cultivadas em meio com FBS a carvão despojado. FKB e R1881 nas concentrações indicadas células tratadas durante 16 horas. α-tubulina foi detectado como um controlo de carga. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. (C). inibidor do proteassoma, MG132, não afeta FKB mediada infra-regulação da expressão da proteína AR. As células LNCaP foram tratados com MG132 durante 2 horas e, em seguida, adicionado FKB durante mais 16 horas. ácido a-tubulina foi detectado como um controlo de carga. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. (D). células LNCaP e C4-2B foram tratados com 5 ug /ml FKB para 4 e 8 horas. Em tempo real de RT-PCR foi realizada para analisar a expressão de ARNm de genes alvo de Ar e Ar (

PSA

e

TMPRSS2

). As barras representam o SD ± média de três experiências independentes. FKB diminui significativamente a expressão do mRNA de genes alvo AR (Student

t

teste, P 0,01).

A supressão da transcrição do AR por flavokawain B requer a expressão do fator de transcrição Sp1

A seguir, investigou o potencial mecanismo de flavokawain B transcrição AR mediada. SP1 é um fator de transcrição putativo para a regulação AR. Sp1 liga-se directamente por CG-box no promotor do AR através de um motivo de proteína de dedo de zinco-[13], [14]. Portanto, um repórter da luciferase promotor AR que contém quatro sítios de ligação de Sp1 foi usado para a atividade do promotor ensaio de AR em linhas de células APC. A Figura 5A mostra que os tratamentos flavokawain B diminuir acentuadamente a actividade do promotor de AR em uma forma dependente da dose. A diminuição da actividade do promotor de AR por flavokawain B foi associada com uma redução dos níveis de proteína Sp1 (Figura 5B). Por conseguinte, a análise ChIP revelou que o tratamento de células B flavokawain C4-2B e LNCaP marcadamente inibida a ligação de SP1 para as sequências do promotor de AR (Figura 5C). Para examinar se Sp1 é necessário para flavokawain AR regulação negativa, as células foram transfectadas transientemente C4-2B com SP1 e, em seguida, tratada com flavokawain B. A Figura 5D mediada por B mostra que a sobre-expressão de Sp1 aumentou os níveis de proteína AR e atenuou a induzida por B flavokawain AR infra-regulação. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram claramente que flavokawain B diminui a expressão da proteína SP1, levando a AR transcricional a sub-regulação.

células .C4-2B (A) foram co-transfectadas com PSA-Luc ou Plars-Luc, juntamente com um plasmídeo de luciferase de Renilla luciferase PGL 4.71 e as actividades foram medidas. FKB diminui significativamente actividades promotoras do

AR Comprar e

PSA

genes (Student

t

teste, P 0,01). As barras representam o SD ± média de três experiências independentes. (B) .western blotting análise da expressão da proteína SP1. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. α-tubulina foi detectado como um controlo de carga. (C). ChIP análise da ligação de SP1 para a sequência do promotor AR revela que 16 horas de tratamento FKB resulta numa diminuição significativa na ligação de SP1 para a sequência do promotor de AR que contêm dois locais de ligação SP1. IgG de rato foi usada como um controlo blank. (D). Superexpressão de Sp1 em células C4-2B atenua FKB proteína AR induzida infra-regulação. Após 48 horas de Sp1-HA plasmídeo de transfecção, as células foram tratadas com C4-2B FKB durante 16 horas. Foram examinados SP1 e os níveis de proteína AR. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. α-tubulina foi detectado como um controle de carga.

kavalactones e flavokawain B combinação resulta em um efeito inibitório reforçada no crescimento de células C4-2B e na expressão da proteína AR

Figura 6A e B mostra que 7,5 ug /ml yangonin e 1 ug /ml flavokawain B sozinho inibiu o crescimento de células C4-2B por 15% e 20%, respectivamente, enquanto que a sua combinação reduziu o crescimento de mais de 70%. Da mesma forma, 5’6′-dehydrokawain a uma dose de 7,5 ug /ml diminuiu o crescimento das células C4-2B por menos de 5%, enquanto que a sua combinação com 1 ug /ml flavokwain B inibiu o crescimento em cerca de 60%. Consistente com este resultado, flavokawain B em combinação com outros cavalactonas (i.e. kawain e methysticin) também resultou num efeito inibidor sinergético no crescimento de células C4-2B (Figura 6C e D). Além disso, a combinação de 5’6′-dehydrokawain ou yagonin com tratamentos flavokawain B resultou numa aumentada a sub-regulação da expressão da proteína AR em ambas as células e C4-2B 22Rv1 (Figura 6 E e F). Notavelmente, 22Rv1 abriga uma variante de splicing de AR com um peso molecular de aproximadamente 80 KD [15]. Flavokawain B e 5’6′-dehydrokawain são mais eficazes na diminuição da expressão da variante de splicing de AR do que o do AR de comprimento completo (Figura 6F). Estes resultados indicam que cavalactonas e flavokawain B actuam de forma sinérgica ou de forma aditiva para inibir o crescimento de células APC e para sub-regular a expressão da proteína de AR e a variante de splicing AR.

O inibidor do crescimento de FKB e yagonin (A), ou 5’6; -dehydrokawain (B), ou kawain (C), ou methysticin (D) sozinho e em combinação com células C4-2B. Cada ponto representa a média de quatro experiências independentes; Barras, DP. Cada amostra foi contada em duplicado. IC

50 s foram estimados por meio de curvas de dose-resposta, IC

50 s das combinações são significativamente mais baixos do que aqueles dos tratamentos sozinhos (estudante

t

teste, P 0,01). (E) e (F) a análise Western blot da expressão de AR de comprimento completo (110 kDa), a variante de splicing AR (83 kDa) e PSA em células C4-2B e 22Rv1, respectivamente. Um blot representativo foi demonstrado a partir de três experiências independentes. α-tubulina foi detectado como um controle de carga.

Kava extrair e flavokawain B diminuir o crescimento do derivado do paciente xenotransplantes APC no SCID, expressão AR em tecidos tumorais e níveis séricos de PSA

Para determinar o

in vivo

anti-PCA efeito do extrato de kava e flavokawain B, foram desenvolvidos dois modelos de xenotransplante mais clinicamente relevantes, derivadas de doente de PCA, GM0308 e RC0309. O APC GM0308 paciente derivado xengrafts linha foi derivada de um (escore de Gleason soma = 5 + 5) de alto grau CaP espécime prostatectomia obtido a partir de um paciente que foi tratado previamente com a terapia da privação do andrógeno (ADT), docetaxel mais carboplatina e etoposídeo mais cisplatina. O crescimento do tumor de xenoenxerto foi inicialmente determinada por meio de uma técnica de xenoenxerto subrenal, e, em seguida, passados ​​através de injecção subcutânea de peças tumorais. A linha de RC0309 foi derivado de um alto grau de amostra (escore de Gleason sum = 5 + 4) CaP prostatectomia obtidos a partir de um paciente que não teve tratamento prévio. Estes xenotransplantes cancerosas humanas fielmente preservar as características histopatológicas da amostra clínica inicial. Ambas as linhas segregam PSA no soro de ratinho hospedeiro (Figura 6A). A linha de GM0308 expressa um AR truncada em torno de 80 kDa, sem mutações de sentido trocado nos exões 3, 4, ou 5 (dados não apresentados). Em contraste, RC0309 mantém a AR comprimento completo (dados não mostrados).

Os ratinhos portadores de tumores GM0308 na passagem 3 foram tratados com controlo de veículo ou 200 mg /kg flavokawain B diariamente por injecção IP durante 28 dias. A Figura 6A mostra um crescimento de tumor de xenoenxerto e soro PSA aumento progressivo ao longo de todo o estudo no grupo de controlo com veículo. O tratamento flavokawain B, no entanto, resultou numa diminuição da taxa de crescimento do tumor comparada com o grupo de controlo ao longo do estudo (Figura 7A). Os pesos dos tumores molhado ou de PSA no soro em controlo e grupo flavokawain tratou-B registados no final do tratamento é de 0,43 ± 0,27 g e 0,097 ± 0,048 g, ou 66,6 ± 12,8 ng /mL e 18,4 ± 4,8 ng /ml, respectivamente ( média ± SD; n = 13 para o controlo e n = 6 para os grupos de tratamento FKB; P 0,001, teste t de Student). tratamento Flavokawain B atenuou o crescimento do tumor por 77,3% e diminuiu os níveis de PSA no soro em 68% no final do tratamento.

(A) e (B). Os ratinhos com tumores CaP derivadas de pacientes foram divididos aleatoriamente em grupos de tratamento e controle com pré-tratamento níveis séricos de PSA semelhantes em cada grupo. Os volumes tumorais e PSA no soro foram registrados e apresentados como média ± SD. peso húmido de tumores é representado como média dos tumores de ratinho individual em cada grupo. Bares, significa ± SD. Os volumes do tumor (com medidas repetidas de análise de variância (ANOVA), p 0,01) e os pesos dos tumores (estudante

t

teste, P 0,01) de FKB e o KRE ratinhos tratados eram significativamente inferiores aos de veículo ratinhos tratados de controlo. (C). coloração imuno de expressão AR em tecidos tumorais. Controlo imunocoloração foi realizada apenas com isotipo IgG; As lâminas foram contrastadas com hematoxilina e fotografadas utilizando um microscópio de luz. Ampliação original: × 200. (D). AR células positivas foram contadas em 12 campos em cada grupo. A percentagem de células positivas AR foi calculado e apresentado como médias ± DP (os dois painéis da esquerda). Os níveis de mRNA de

AR

,

PSA

e

TMPRSS2

em tecidos tumorais tratados com veículo ou FKB foram analisadas por RT-PCR em tempo real (painel da direita). Bares, significa ± SD. As percentagens de células positivas para AR são significativamente mais baixos no KRE e FKB grupos tratados do que nos grupos de controlo tratados de veículo (Student

t

teste, P 0,01). Os níveis de mRNA de

AR

,

PSA

e

TMPRSS2

é menor no KRE e FKB grupos tratados do que aqueles em grupos de controlo (Student

t

teste, P 0,01.)

os ratinhos portadores de tumores RC0309 na passagem 13 foram alimentados com o alimento suplementado com controlo de veículo ou 6 g /kg do extracto kava durante 18 dias. Da mesma forma, a suplementação de extracto de raiz de kava resultou numa diminuição significativa da taxa de crescimento de tumores em comparação com o controlo de veículo (Figura 7B, ANOVA, P 0,01). Os pesos dos tumores molhadas foram 1,83 ± 0,79 g no grupo controle e 0,73 ± 0,34 g no grupo extrato de kava raiz (Figura 7B; n = 5, a média ± SD; P 0,05, teste t de Student). (B). (C).