Abstract

Fundo

A resistência aos medicamentos, um processo mediado por vários mecanismos, é um determinante crítico para o tratamento de cancro do pulmão. O objetivo deste estudo é determinar se o ácido oleanólico (OA), um triterpeno pentac�lico presente em várias plantas, é capaz de contornar os mecanismos de resistência aos medicamentos presentes no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) linhas de células e induzir a sua morte .

principais conclusões

OA diminuiu a viabilidade celular das linhas celulares de NSCLC A459 e H460, apesar da presença de, multi-resistente (MDR) proteínas MRP1 /ABCC1 activas e as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e survivina. Estes efeitos são devidos à apoptose, como evidenciado pela capacidade de OA para induzir a fragmentação de ADN e activar a caspase 3. A indução da morte de células NSCLC pela OA não pode ser explicada pela inibição das proteínas de MDR, uma vez que o tratamento com triterpeno teve pouco ou nenhum efeito sobre a actividade ou a expressão de MRP1. Além disso, o tratamento com OA não teve efeito sobre a expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2, mas aumentou a expressão da proteína Bax pró-apoptótica, alterar o equilíbrio de Bcl-2 /Bax no sentido de um perfil pro-apoptótica. OA também diminuiu a expressão da survivina proteína anti-apoptótica. Além disso, a OA diminuiu a expressão do factor de crescimento endotelial vascular angiogénico (VEGF) e diminuiu o desenvolvimento de metástases do pulmão induzida por melanoma.

Conclusão

Nossos dados fornecem uma visão significativa na anti-tumoral e atividade anti-metastática da OA em NSCLC e sugerem que a inclusão de OA nos regimes NSCLC pode ajudar a diminuir o número de recaídas e reduzir o desenvolvimento de metástases

Citation:. Lúcio KA, Rocha GDG, Monção-Ribeiro LC, Fernandes J, Takiya CM, Gattass CR (2011) Oleanolic ácido Iniciados a apoptose em Non-Small Cell Lung Cancer linhas de células e reduz a metástase de um melanoma B16F10 Modelo

In Vivo

. PLoS ONE 6 (12): e28596. doi: 10.1371 /journal.pone.0028596

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de janeiro de 2011; Aceite: 11 de novembro de 2011; Publicação: 09 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lúcio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP /FNDCT /NQTN Conv. 01.06.0390.00), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, conceda número e-26 /110,135 /2009) , Instituto Nacional para Pesquisa translacional em Saúde e Ambiente na Região Amazônica (INCT-INPeTAm /CNPq /MCT Conv. # 57,3695 /2008-3) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES, PhD bolsa para KAL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é a causa mais frequente de morte relacionada ao câncer [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) representa mais de 80% de todos os cânceres de pulmão diagnosticados. A elevada mortalidade desta doença é atribuível às dificuldades de detecção precoce. No momento do diagnóstico, a maioria dos pacientes tem uma doença irressecável, avançado envolvendo linfonodo ou metástase visceral, ou ambos. quimioterapia à base de platina, um dos principais tratamentos para NSCLC nas últimas décadas, exibiu vários problemas: além de ser muito tóxico, como a quimioterapia só produziu uma melhoria modesta na sobrevivência global [2]. Mesmo após o desenvolvimento de drogas que têm como alvo o crescimento de um tumor, a taxa de sobrevivência global dos doentes com NSCLC permaneceu baixa [3]. O fracasso quimioterapêutico no cancro do pulmão pode contribuir para metástase e alta morbidade, indicando que terapias eficazes são necessários.

A multirresistência (MDR) desempenha um papel crítico no fracasso da quimioterapia do cancro do pulmão. Apesar de vários mecanismos podem mediar MDR, os pesquisadores têm dedicado uma grande atenção à sobre-expressão de proteínas transportadoras da adenosina 5′-trifosfato (ATP) liga�o ao cassete (ABC) a família e a alterações de fatores envolvidos no processo de apoptose. Expressão de proteínas de MDR é considerada a principal causa de recidivas de um paciente após o tratamento; dados da literatura [4], [5] descreveram uma relação entre a expressão de proteínas ABC e os pobres resultados dos pacientes com NSCLC tratados com quimioterapia. proteínas MDR, tais como P-glicoproteína (P-gp) /ABCB1 e proteína resistente a múltiplas drogas trabalho 1 (MRP1) como bombas de efluxo que são capazes de remover uma variedade de drogas a partir da célula, evitando assim a morte celular [6]. Alterações de mecanismos que atenuam vias pró-apoptóticos e /ou amplificar as vias anti-apoptóticas são também factores importantes no desenvolvimento de resistência quimioterapêutica nos tumores [7], [8]. Vários estudos mostraram que a inibição de proteínas anti-apoptóticas do linfoma de células B 2 (BCL-2) [9], [10] ou inibidor de apoptose (IAP) famílias [11], [12] sensibiliza células NSCLC à quimioterapia.

Outra característica das células cancerosas malignas é a sua capacidade de estabelecer metástase. Desde que a doença metastática, em vez de crescimento local do tumor, determina a mortalidade dos pacientes, tendo como alvo a metástase tumoral tem a prioridade mais elevada na terapia do cancro. Um substancial corpo de evidências surgiram sugerindo que o eixo entre o receptor vascular factor de crescimento endotelial (VEGF) e a quinase do receptor do domínio de inserção de Flk-1 (KDR) (VEGF-Flk-1 /KDR) é o tumor via de transdução de sinal dominante regulação angiogénese e metástase [13]. No entanto, porque o requisito principal para o desenvolvimento de metástases, é a presença de células tumorais vivas, mecanismos envolvidos na resistência à droga, tal como a expressão de proteínas de MDR e factores anti-apoptóticos, têm sido propostos como condições favoráveis ​​para o desenvolvimento de metástases [14], [15].

Muitos compostos de origem natural são capazes de modular a resistência a drogas. ácido oleanólico (OA), um triterpeno pentacíclico encontrados numa variedade de espécies de plantas, apresenta diversas propriedades biológicas, incluindo anti-inflamatório [16], [17], hepato e nefrotoxicidade protecção [18], [19], a recuperação do sistema hematopoiético após irradiação [20] e a citotoxicidade contra várias linhas celulares de cancro [21], [22], [23]. Em um estudo anterior, mostramos que a OA também é eficaz contra as células eritroleucémica MDR com superexpressão P-gp e sua contraparte sensíveis [24]. O presente estudo foi realizado para examinar os efeitos citotóxicos de OA em NSCLC células (A549 e H460), que expressa tanto MRP1 [25], [26] e factores anti-apoptóticos [7], [8], e para investigar os efeitos da este triterpeno em vias envolvidas na resistência à droga e o desenvolvimento de metástases.

OA induzida apoptose em ambas as linhas celulares. O tratamento com este triterpeno diminuiu a expressão de survivina e aumentou a expressão da Bax, sem afectar a expressão de Bcl-2 ou MRP1. Além disso, a OA diminuiu a expressão de VEGF e inibiu o desenvolvimento de metástases do pulmão induzida por melanoma. Em conjunto, estes dados sugerem que a OA pode ser um bom candidato para o tratamento de tumores com expressão intrínseca dos mecanismos de resistência, tais como tumores do pulmão.

Materiais e Métodos

Materiais

ácido oleanólico (OA), peso molecular 456,7, fornecida pela Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, EUA), foi dissolvido em 10 mM de sulfóxido de dimetilo (DMSO), armazenada a -20 ° C e diluídas em meio de cultura para usar. DMSO, 3- (4,5 dimethylthiozol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio (MTT), iodeto de propídio (PI) e rodamina 123 (Rho123) foram adquiridos da Sigma. diacetato de 5-carboxifluoresceína (5-CFDA) foi obtido a partir de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal de vitelo (FCS), penicilina e estreptomicina foram de Life Technologies, Inc. (EUA). Solução de lise FACS foi da BD Biosciences (San José, CA). Caspases-3 kit de ensaio (CaspGlow) era de Biovision (Mountain View, CA, EUA). Os anticorpos contra o Bax (clone P-19), VEGF (clone de C-1) e tubulina (clone b-7) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Bcl-2 de anticorpo (clone 124) foi da Dako (Carpinteria, CA, EUA) e anticorpo de survivina (ab24479) foi adquirido a partir de Abcam (Cambridge, MA, EUA). Biotinilado de rato anti-IgG e estreptavidina marcada com Cy3 foram da Sigma. Anti-IgG biotinilada de cabra, anti-IgG de coelho e meio de montagem Vectashield® foram adquiridos da Vector Laboratories (Burlingame, CA, EUA). 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e marcado com PE anti-MRP1 (QCRL-2) eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Anti-MRP1 (clone A23, Axxora, San Diego, CA), Bcl-2 (clone bcl2-100, Zymed, São Francisco, CA), anti-ratinho de HPR (Amersham, Arlington, IL) e HPR anti-coelho (GE Healthcare, Piscataway, NJ) foram usados ​​para a transferência de western.

células e condições de cultura

o não pequenas do cancro do pulmão de células linhas de células A549 e H460 humano e a linha de melanoma de murideo B16F10 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com inactivado pelo calor 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, em garrafas de plástico descartáveis, a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram sub-cultivadas utilizando Tripsina-EDTA a cada 3-4 dias.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT. Resumidamente, 180 mL da suspensão de células do cancro de pulmão (10

4 /células por poço) foi distribuído em placas de 96 poços e incubadas durante 24 h a 37 ° C /5% de CO

2 para permitir que a cultura de estabilizar. As células foram então tratadas com 20 ul de meio, várias concentrações de OA (10, 25, 40 ou 50 ug /mL ou 21,9, 54,7, 87,6 ou 109,5 uM, respectivamente); As concentrações de DMSO para cada dose foram utilizados como controlos. Após 48 h de incubação, a cultura foi tratada com 20 ul de MTT (5 mg /mL) e mantida durante 4 h a 37 ° C no escuro antes de serem centrifugadas e o sobrenadante descartado. O formazano produzido por redução do MTT pelas células viáveis ​​foi dissolvido em DMSO e a densidade óptica foi medida num leitor de ELISA (de referência, Bio-Rad, CA) a 570 nm (filtro de referência 630 nm). As experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os resultados foram expressos como a média ± SD de percentagem de inibição da viabilidade celular. Para verificar se concentrações elevadas de OA iria interferir com as leituras de MTT, OA foram incubadas com MTT nas mesmas condições utilizadas para a determinação da viabilidade das células. Não foi observada nenhuma interferência.

DNA fragmentação ensaio

A apoptose foi avaliada através da análise do ciclo celular por citometria de fluxo. Após repouso de 24 h, as células pulmonares plaqueadas (2 × 10

4 /poço) foram tratados com meio ou várias concentrações de OA (10, 25, e 50 ug /ml) e incubou-se durante mais 48 h. Após este tempo, as células foram colhidas, re-suspensas numa solução hipotónica fluorescente (50 ug /ml de PI e 0,1% de Triton X-100 a 0,1% em tampão de citrato de Na) durante 1 h, a 4 ° C no escuro. O ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo (FL-2) (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) para determinar o teor de ADN sub-G0 /G1. populações sub-diplóides foram consideradas como sendo apoptótica. aquisição e análise de dados foram controlados por software Cellquest, versão 3.1f. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. Os resultados foram apresentados como histogramas representativos e como média ± DP da percentagem do ADN que foi fragmentado.

activação de caspase ensaio

caspase-3 de activação foi testada usando um kit comercial, de acordo com a as instruções do fabricante (BioVision, mountain View, CA). Em resumo, as células plaqueadas como descrito em

ensaio de viabilidade celular

(H M) foram incubados durante 48 h com meio (controlo) ou com várias concentrações de OA (10, 25 ou 50 ug /ml) antes de serem colhidas , centrifugadas e suspensas em solução de ensaio da caspase-3. Esta solução de ensaio contém um inibidor potente da caspase conjugado a FITC que é permeável célula, não-tóxicos e, de forma irreversível a caspase activado. Após 1 h de incubação (37 ° C, 5% de CO

2), as células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem e a percentagem de células da caspase-3-activado foi analisada por citometria de fluxo (FL-1). Os resultados foram apresentados como histogramas representativos de três experiências diferentes.

Actividade de proteínas MDR

A actividade das proteínas MDR foi determinada pela acumulação de substratos específicos. Rho123 e diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA), uma molécula não-fluorescente que é convertido no fluorescente carboxi-fluoresceína (FC) por esterases intracelulares, foram usadas para medir a actividade da P-gp /ABCB1 e MRP1 /ABCC1, respectivamente [ ,,,0],27], [28].

para cada experiência, as células (1 x 10

5 /po) foram semeadas em placas de 24 cavidades e pré-incubadas durante 24 h a 37 ° C /5% CO

2 para permitir que a cultura a estabilizar. As células foram incubadas durante 30 min com meio (autofluorescência); 400 nM ou 5 uM Rho123 CFDA na presença de meio, os inibidores de P-gp (25 uM verapamil) ou MRP1 (50 uM MK-571); ou a concentrações de OA desejado. Em seguida, as células foram lavadas em PBS, colhidas e mantidas em gelo até a análise de citometria de fluxo (FACSCalibur, Beckton-Dickinson citómetro). Os resultados foram apresentados como histogramas representativos ou como a média ± SD de unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência média (MIF).

A expressão de proteínas MDR

A expressão de MRP1 foi avaliada utilizando citometria de fluxo e Western blot. As células foram plaqueadas e tratadas durante 24 h com meio ou OA (25 ou 50 ug /mL). Para a citometria de fluxo, as células foram colhidas, permeabilizadas com solução de lise de FACS e incubadas com marcado com PE anti-MRP1 (clone QCRL-2) durante 30 minutos a 4 ° C. Após duas lavagens com PBS, as células foram re-suspensas em solução de FACS a fluorescência e avaliadas. Os resultados foram apresentados como histogramas representativos. Para Western blot, extractos de células completas foram preparadas diluindo os peletes de células directamente em RIPA (Tris-HCl a 50, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS e Kit de inibidor de protease a 1% (Amersham, Arlington , IL). quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para difluoreto de polivinilideno (PDF) de membranas. As membranas foram bloqueadas durante 2 h em PBS /0,05% Tween contendo 5% secou-se leite magro, sondadas com anticorpos específicos para MRP1 ( A23 clone, 1:1000) ou tubulina (clone b-7, 1:500) durante a noite e incubadas com anticorpos secundários conjugados com HPR-(1:2000 diluição;. Amersham Biosciences, Reino Unido) durante 1 hora à temperatura ambiente blots foram desenvolvidos através o sistema de quimioluminescência amplificada (ECL, Amersham, Arlington, IL) de acordo com as instruções do fabricante. intensidade da banda foi quantificada utilizando o software de imagem e expressão de proteína Scion foi normalizada em relação ao ácido a-tubulina.

ensaios imunocitoquímica

células A459 (3 × 10

4 /po) foram semeadas em lamelas em placas de 24 cavidades, deixou-se repousar durante 24 h e depois tratou-se com meio ou 50 ug /mL OA. Após 24 h de incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão salino de fosfato (PBS), pH 7,4, e fixado com uma solução de paraformaldeído a 4% tamponada contendo 4% de sacarose durante 40 min a 4 ° C. Após três lavagens em PBS, as lamelas foram incubadas durante 30 min em 50 mM de NH

solução 4Cl, pH 8,0, e depois lavou-se novamente em PBS (3X). A ligação não específica de imunoglobulinas foi bloqueada durante 60 minutos com uma solução de PBS contendo 5% de BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% de Tween 20 e 0,01% de gelatina. O passo seguinte foi a inibir a biotina endógena utilizando um kit de bloqueio biotina (Vector Lab.), De acordo com as instruções do fabricante.

Depois disso, as células foram incubadas com uma diluição de um monoclonal de ratinho anti-Bcl 1:50 -2 anticorpo, anticorpo de 2 ug /mL de anticorpo policlonal de coelho anti-Bax, 2 /anticorpo survivina gu mL monoclonal de ratinho anti-VEGF ou anticorpo 5 ug /ml, diluídos em PBS contendo 3% de BSA e 0,05% de Tween e mantidas durante a noite a 4 ° C em câmara húmida. Em seguida, as células foram lavadas em PBS contendo 0,25% de Tween 20 e incubadas durante 1 h com 10 ug /mL de anticorpo secundário seleccionado para esse ensaio: anti-IgG biotinilada de cabra, anti-IgG de coelho ou anti-IgG de ratinho. Após este passo, as lamelas foram lavadas (3 vezes) com PBS /0,25% de Tween e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente com 10 ug /ml de estreptavidina conjugada com Cy3. Em seguida, as lamelas foram lavadas e depois coradas com 0,5 ug /ml de DAPI, durante 5 min. Depois de mais duas lavagens, um com PBS e uma em água destilada, as lamelas foram montadas com Vectashield® meio de montagem e observado por microscopia de epi-fluorescência (Eclipse E-800, Nikon, Japão). As lamelas manchadas de DAPI foram inspeccionados para excluir a possibilidade de contaminação por micoplasma.

A análise quantitativa foi realizada utilizando um sistema de análise de imagem (imagem-Pro® Plus 4.5, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, EUA), composto por uma câmera digital (Evolution, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, EUA) acoplado a um microscópio de fluorescência. Imagens de alta qualidade de células foram capturados (2048 × 1536 pixels tampão), usando a lente objetiva de 40 ×. Pelo menos vinte campos por tampa de deslizamento foram contadas e a percentagem de células imunorreactivas foi calculada a partir das células positivas DAPI.

A expressão de Bax, Bcl-2, VEGF e survivina foram também avaliadas por transferência de Western utilizando anticorpos específicos . células plaqueadas foram tratados com meio ou 50 mg /mL durante 24 h a OA e extractos celulares totais foram preparados como descrito em

Expressão de proteínas MDR

(H H). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para membranas e sondados com PDF anticorpos específicos para a proteína Bax (clone P-19, 1:1000), Bcl-2 (clone Bcl2-100, 1:500), VEGF (clone C1, 1 :100), survivina (ab469 clone, 1: 1000) ou tubulina (clone b-7, 1:500). As manchas foram desenvolvidas usando o sistema de quimioluminescência amplificada (ECL, Amersham, Arlington, IL) de acordo com as instruções do fabricante. intensidade da banda foi quantificada usando o software de imagem e expressão de proteína Scion foi normalizado em relação ao ácido a-tubulina.

O desenvolvimento de metástase pulmonar induzida por células de melanoma B16F10

Todos os procedimentos experimentais em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão de Ética para Avaliação do Uso de animais em Experimentação do IBCCF /CCS /UFRJ (CAUAP-IBCCF) e aprovado sob a designação, o Projeto # 1005.

no dia 0, C57BL masculino /6 os ratinhos (10 a 12 semanas de idade) foram injectados nas suas veias da cauda com células de melanoma B16F10 (1 × 10

6 células /animal). De células de tumor de rolamento camundongos foram divididos em quatro grupos de cinco e 3 dias após a inoculação, tratados diariamente durante duas semanas (de segunda a sexta-feira), com 20 mL de solução salina, de DMSO ou de OA (5 mg kg

-1 ou 10 mg kg

-1). A dose do triterpeno para o terceiro e quarto grupos foi decidido por referência a um relatório anterior [29]. O peso corporal de cada rato foi registado a cada 4 dias para determinar se o tratamento influenciam o estado de saúde do animal. Dezoito dias após a inoculação das células tumorais, os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical, sob anestesia com CO

2. Os pulmões foram removidos, e dois observadores independentes determinado o número de nódulos metastáticos nos pulmões de cada ratinho. Os resultados são expressos como média ± DP do número de metástases.

A análise estatística

Os dados são apresentados como média ± DP. teste t de Student foi realizado usando o software Instat. Um valor de

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A549 e células H460 linhas expressam MRP1 ativa bomba

O A549 e H460. linhas celulares expressaram níveis significativos de proteínas transportadoras de MDR [25], [26]. Para investigar a presença de bombas activas nestas linhas, as células foram incubadas com substrato de fluorescência para a P-gp (Rho123) ou MRP1 (CFDA) na presença ou ausência de inibidores para estas proteínas e, em seguida, a fluorescência intracelular foi medido. A falta de alteração na fluorescência observada na presença de verapamil, um inibidor específico da P-gp [30], e o elevado aumento na fluorescência obtida quando A549 e H460 foram tratados com MK571, um inibidor de MRP1 específica [31], revelam que estes linhas têm muito baixa ou nenhuma actividade P-gp, mas exibir uma atividade MRP1 forte (Figura 1).

para a P-gp /atividade ABCB1, células A549 ou H460 foram incubadas durante 30 minutos com média (AF) ou 400 nM de Rodamina 123 na ausência (RHO) ou na presença de 50 uM de verapamil (VP), por MRP1 /ABCC1, as células foram incubadas com 5 pM de CFDA na ausência (CF) ou na presença de 50 uM de MK-571 (MK) . Após a lavagem, a fluorescência celular foi medida por citometria de fluxo. Histogramas são representativos de três experiências independentes realizadas em duplicado.

ácido oleanólico inibe a viabilidade e induz a fragmentação do DNA dependente de caspase em linhas de NSCLC

Para avaliar o efeito citotóxico da OA sobre A549 e H460, as células foram tratadas com diferentes concentrações de OA ou com cisplatina (um fármaco quimioterapêutico tradicional para NSCLC) e, em seguida, após 48 h; viabilidade das células foi medida através de um ensaio MTT. ácido oleanólico diminuiu a viabilidade das linhas celulares de um modo dependente da dose (Figura 2A). A observação microscópica das células sugeriu que o efeito do OA era devido a apoptose. Para explorar mais esta observação, as células tratadas foram incubadas com uma solução hipotónica contendo PI e, em seguida, uma análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo (FCM). populações sub-diplóides foram considerados apoptótica. O aumento da percentagem de células de ADN fragmentados e na activação da actividade de caspase-3 induzida por OA o tratamento (Figuras 2B e 2C), reforçou a natureza apoptótica da OA citotoxicidade. Esta observação foi confirmada por dados /PI AnnexinV (dados não mostrados).

A549 ou células H460 foram incubadas com várias concentrações de OA (10, 25, 40 ou 50 ug /mL ou 21,9, 54,7, 87,6 ou 109,5 ^ M) ou cisplatina durante 48 h. viabilidade (A) celular foi avaliada por MTT e representados graficamente como percentagem de inibição da viabilidade celular. Os resultados representam SD ± média de 4 experimentos realizados em triplicado. (B) Em paralelo, as células foram tratadas com uma solução hipotónica contendo iodeto de propídio (PI) e ADN-conteúdo foi analisada por citometria de fluxo. Painel superior: histograma representativo do ciclo celular. painel inferior: percentagem de células sub-G1 apoptóticos. Os valores representam SD ± média de 3 experimentos realizados em triplicado. Caspase-3 células activadas (C) foi determinado por citometria de fluxo, utilizando um kit CaspGlow como descrito em H H. Histogramas são representativos de duas experiências independentes realizadas em duplicado.

Efeitos do ácido oleanólico sobre a atividade e expressão MDR

Para investigar se o efeito citotóxico da OA sobre A549 e H460 foi mediada pela modulação da bomba de MDR, analisamos os efeitos da OA sobre a atividade MRP1 e expressão. As células foram incubadas durante 30 min com CFDA na presença de diferentes concentrações de OA (6,25, 12,5, 25 ou 50 ug /mL) e a acumulação de FC foi medida por fluorescência. Como mostrado na Figura 3A, o tratamento com OA não alterou a acumulação de CF por A549. Um pequeno mas significativo aumento na fluorescência foi observada em H460, sugerindo que o OA pode ser capaz de modular a actividade de MRP1. Por outro lado, também foi possível, em vez disso, que a OA modifica a expressão de MRP1. Esta possibilidade foi analisada por FCM e western blot em células incubadas com o meio ou OA (25 ou 50 ug /ml, cada um durante 24 horas e, em seguida, tratados com anti-MRP1. Como se mostra nas Figuras 3B e 3C, nenhuma alteração da expressão de MRP1 estava observado.

(a) para determinar a actividade de MRP1, células A549 ou H460 foram incubadas durante 30 min com meio (AF), 5 uM na ausência de CFDA (CF) ou na presença de 50 uM de MK-571 (MK -571), ou com CFDA na presença de várias concentrações de OA (6,25, 12,5, 25 ou 50 ug /mL). fluorescência celular foi medida por citometria de fluxo. os resultados são expressos como a média ± desvio padrão da intensidade média da fluorescência obtido . em 3 diferentes experimentos realizados em triplicata * e ** indicam

p Art 0,05 e

p

. 0,01, respectivamente, em relação ao controle (CF) (B) para determinar a expressão de MRP1, as células foram tratadas com meio ou OA (25 ou 50 ug /mL) durante 24 h antes de serem colhidas, permeabilizadas e incubadas com marcado com PE anti-MRP1 durante 30 minutos a 4 ° C. Após duas lavagens com PBS, as células foram re-suspensos em solução de FACS e a fluorescência foi avaliada. Os histogramas são representativos de três experiências independentes. (C) Para determinar MRP1 por western blot, extractos de células completas foram obtidas a partir de células tratadas tal como descrito em B. As proteínas foram separadas por meio de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) -gels, transferidos para membranas e sondados com PDF um anticorpo para MRP1 como descrito na M M seção. Os números representam a intensidade da banda em relação ao ácido a-tubulina.

ácido oleanólico inibe a expressão de proteínas envolvidas na resistência à apoptose e induzir angiogénese na linha de células A549

Para investigar se o citotóxica actividade da OA pode ser devido a modulação de vias envolvidas na resistência à apoptose, as células A549 foram tratadas durante 24 h com 50 ug /mL desta triterpeno e, em seguida, a expressão de Bcl-2, Bax e survivina foram analisados ​​utilizando técnicas de imunocitoquímica. Nós não encontramos nenhuma micoplasma em lamelas preparados para imunocitoquímica. Observou-se que a expressão de Bcl-2 não se alterou após o tratamento com OA (Figuras 4A-B); houve um aumento significativo (

P

0,005) aumento da Bax (Figuras 4C-D) e uma diminuição significativa (

P

0,0001) na expressão da proteína (Figuras survivina 4e- F). Estes resultados sugerem que o tratamento com OA alterou o meio celular para um perfil de apoptose e que este processo pode também contribuir para reduzir o número de focos metastáticos. Para explorar esta possibilidade adicional, o efeito do OA na expressão de VEGF [13], um factor envolvido na proliferação celular e na angiogénese, foi avaliada por imunocitoquímica. Os dados apresentados nas Figuras 4 (G-H) demonstrou que o tratamento com OA levou a uma redução significativa (

P

0,05) de células VEGF-positiva. Resultados semelhantes foram observados quando os efeitos da OA sobre a expressão destas proteínas foram analisadas por Western blot (Figura 5). No seu conjunto, estes dados revelam um possível efeito inibidor da OA em vias de resistência a drogas e desenvolvimento de metástases.

(painel superior) por imunofluorescência de células A549 coradas para Bcl-2 (A-B), Bax (C-D), survivina (e-F) e o VEGF (G-H). As células A549 foram tratados com meio (A, C, E, G) ou com 50 ug /mL a OA (B, D, F, H), durante 24 h, fixadas, coradas com os anticorpos primários, revelada com IgG biotinilado seguido de estreptavidina -CY3 e contra-coradas com DAPI, como descrito em H H. micrografias de imunofluorescência representativas de três experiências. Barra: 100 fim. (Painel inferior) representação gráfica dos resultados do ensaio histomorfométricas imunocitoquímica. A percentagem de células imunorreactivas foi calculada a partir das células positivas DAPI. Bcl-2 não foi modulado por OA (p 0,05), mas o Bax foi significativamente aumentada (*

P

0,005), enquanto que a survivina e VEGF foram significativamente menores após o tratamento (**

p

0,0001 e ***

p

. 0,05, respectivamente)

As células A549 foram tratadas com meio ou com 50 ug /ml de ácido Oleanolic durante 24 h e Os extractos celulares totais foram obtidos como descrito em H H. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para membranas de PDF, sondados com anticorpos para Bcl-2, Bax, Survivina, VEGF ou α-tubulina e desenvolvidos com ECL, como descrito em H H. Os números representam a intensidade da banda em relação ao ácido a-tubulina.

ácido oleanólico inibe o desenvolvimento de metástases do pulmão induzida por melanoma

metástase é geralmente considerado como um crescimento de tumor originado a partir de células que perderam a aderência , entrou na circulação, e depois migraram para nichos metastáticas específicas; no caso de o cancro do pulmão, estes nichos são o cérebro, fígado e ossos. Na ausência de um modelo de metástase específica para este tipo particular de cancro do pulmão, foi utilizado o modelo de melanoma, frequentemente utilizada na literatura para investigar o efeito da droga sobre a metástase, para avaliar os efeitos da OA sobre o desenvolvimento de metástases

in vivo

. Para este efeito, as metástases do pulmão foram induzidas por

i.v.

Inoculação de células de melanoma B16F10 como previamente descrito [29]. De um modo semelhante ao A549 e H460, estas células também exibem uma bomba de MRP1 activo (resultados não mostrados). Começando 3 dias após a inoculação do tumor, os grupos de ratinhos foram tratados intra-nasalmente durante 2 semanas com 10 doses de PBS (controlo) ou com várias concentrações de OA (5 ou 10 mg kg

-1 dia

-1). Os ratinhos foram sacrificados no dia 17 e o número de metástases pulmonares foi contado. A concentração mais elevada de tratamento com OA significativamente (

P

0,05). Reduziu o número de metástases em comparação com controlos não tratados (Figura 6)

Os grupos de murganhos, injectados na cauda veias com B16F10 células de melanoma, foram tratados com solução salina, DMSO, OA (5 mg kg

-1 dia

-1) ou OA (10 mg kg

-1 dia

-1), como descrito na H M e a secção do painel superior; o número de metástase do pulmão foi contado no dia 18 (painel inferior). Os resultados são expressos como média ± DP do número de metástases. * Indica

p

. 0,001 em relação ao controle (DMSO)

Discussão

A presença de resistência intrínseca ou adquirida a agentes quimioterápicos é uma das principais obstáculo para o tratamento eficaz do NSCLC. De facto, a observação de que cerca de metade dos doentes morrem porque o tumor se espalha para órgãos distantes tem sido atribuída ao desenvolvimento de MDR. Os dados aqui apresentados demonstram que, para além de ser activos contra linhas de NSCLC que expressavam actividade de MRP1 /ABCC1 intrínseca, OA factores envolvidos na resistência à apoptose modulado e inibiu o desenvolvimento de metástases do pulmão induzida por melanoma.

Porque as proteínas são MDR encontrada no epitélio pulmonar normal, tumores derivados deste tecido elevar os níveis destas proteínas após a quimioterapia ou radioterapia [32], [33] e são muitas vezes insensíveis à exposição a agentes citotóxicos. Os dados apresentados neste trabalho demonstram que a OA é citotóxico e apoptose induzida de duas células NSCLC que constitutivamente MRP1 expresso [25], [26] e apresentam atividade MRP1 alta (Figura 1). morte celular mediada pelo ácido oleanólico é devido a apoptose, tal como evidenciado pela capacidade de OA para induzir a fragmentação de ADN e activar a caspase 3 (Figura 2).