Abstract

O desenvolvimento de vacinas baseadas em células dendríticas é uma abordagem promissora na imunoterapia do cancro. Para o seu uso bem sucedido nas clínicas, a propagação e funcionalidade do DCS é crucial. Nós anteriormente estabelecido um método de dois passos para a geração de grande escala de DCs do sangue do cordão umbilical derivado PTM /células CD34 +. Este trabalho tem por objectivo melhorar a sua funcionalidade com base nas seguintes observações:

in vitro

gerado DCs pode ser menos eficiente na migração e outras atividades funcionais devido a diminuir os níveis de eicosanóides. A produção de eicosanóides a partir de ácido araquidónico (AA) pode ser prejudicada devido à supressão da fosfolipase A2 enzima por IL-4, uma citocina essencial necessário para a diferenciação de DCs. Colocámos a hipótese de que a adição exógena de AA para o meio de cultura durante a geração de DC pode resultar em DCs com funcionalidade melhorada. DCs foram gerados com e sem AA. Os dois conjuntos DC foram comparados por análise fenotípica, morfologia e ensaios funcionais, como absorção de antigénio, MLR, ensaio de CTL e

in vitro

e

in vivo

migração. Embora não houvesse diferenças entre os dois tipos de DCs em termos de morfologia, fenótipo e absorção de antigénio, AA

+ DCs exibiu uma reforçada

in vitro

e

in vivo

migração, T capacidade da célula estimuladora, a actividade de CTL e os níveis de transcritos de significativamente mais elevados de COX-2. AA

+ DCs também mostram um perfil favorável de citocinas Th1 do que AA

– DCs. Assim, a adição de AA ao meio de cultura é inclinar as DCs para a secreção de mais IL-12 e menos de IL-10 juntamente com a restauração de níveis de eicosanóides em uma via mediada por COX-2, aumentando assim a funcionalidade destas células a serem usadas como uma vacina celular potente. Tomados em conjunto, estes resultados serão úteis para melhor contriving de DC vacinas baseadas para a imunoterapia do cancro

Citation:. Kumar J, Gurav R, Kale V, Limaye L (2014) exógena adição de ácido araquidônico à Cultura mídia melhora a funcionalidade das células dendríticas para o seu uso possível em Câncer imunoterapia. PLoS ONE 9 (11): e111759. doi: 10.1371 /journal.pone.0111759

editor: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Holanda

Recebido: 13 de junho de 2014; Aceito: 30 de setembro de 2014; Publicação: 04 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kumar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro dos arquivos de informações de apoio

Financiamento:. O projeto recebeu recursos financeiros do Departamento de Biotecnologia (DBT), Governo da Índia através da concessão não. BT /PR13565 /MED /31/89/2010. JK recebeu a bolsa do Conselho da Scientific and Industrial Research (CSIR) Índia e da DBT (PR- 4930/31). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as células dendríticas (CDs) são mais eficientes células apresentadoras de antígenos (APCs) que reconhecem o universo de antigénios e controlar vários tipos de respostas [1], [2]. DCs são capazes de captar antigénios, processá-los, e apresentando-os com moléculas de co-estimula�o adequada e desencadear a resposta imune [3], [4]. DC não são apenas crítico para a indução de ambas as respostas primárias e secundárias de células T e B mediadas imunes, mas também são importantes para a indução de tolerância imunológica. DCs estão no centro do sistema imunitário e na modulação da resposta imune é importante na imunidade terapêutica contra o cancro [5]. A capacidade única de DCs na apresentação de antígenos e regulação da resposta imune fez-lhes um adjuvante atraente na imunoterapia do cancro [6]. Avanços no

in vitro

protocolos de geração de DC e uma melhor compreensão da biologia DC resultaram na sua utilização como vacinas DC nas clínicas. Uma vez que o seu primeiro relatório, em 1995, um grande número de ensaios clínicos foram conduzidos para avaliar as vacinas baseadas em DC contra mais do que uma dúzia de diferentes tipos de tumores [7], [8], [9]. O uso clínico de DCs requer vacinação repetida para induzir relativamente altas freqüências de linfócitos antígeno tumoral específicos T citotóxicas (CTLs) e uma resposta completa. Este, por sua vez, requer um grande número de DCs, gerado

ex vivo

[10].

DCs pode ser gerada a partir de CD34

+ células usando uma etapa ou um sistema de cultura de duas etapas . No primeiro tipo de sistema de cultura de células CD34

+ células são cultivadas com uma combinação de factores de crescimento, em que em que são directamente diferenciadas como células dendríticas [11], [12], [13]. Por outro lado, no sistema de dois passos de cultura CD34

+ células são primeiro expandida em larga escala como precursores de DC. Estas células expandidas são ainda diferenciados como DCs [14], [15], [16], [17]. Apesar do entendimento completo do regulamento mediada por DC complexo de respostas de leucócitos hospedeiras,

in vitro

gerado DCs podem não representar o equivalente a DC migratória

in vivo

, limitando assim a sua utilização como balas mágicas para melhorar a precisão e a eficácia na imunoterapia do cancro. evidências experimentais recentes demonstram que monócitos humana derivada de CC (MoDC) pode ser prejudicado na sua capacidade para migrar em resposta aos inflamatória, bem como quimiotaxinas homeostáticos [18]. Relatórios anteriores indicam que a IL-4, que é uma citocina importante para

In vitro

geração de DC, inibe muitas das vias a jusante de ácido araquidónico (AA) resultam do metabolismo na produção diminuída de eicosanóides e do factor de activação das plaquetas ( PAF). Prostaglandina E

2 (PGE

2) é um membro da família de eicosanóides derivados de AA oxigenados. O primeiro passo da PGE

2 biossíntese é a libertação de AA a partir de fosfolípidos de membrana por fosfolipases, como a fosfolipase A2 (PLA

2). Desde eicosanóides e PAF são conhecidos por desempenhar um papel importante em processos tais como a migração de leucócitos, activação de células assassinas naturais, e o tipo de diferenciações celulares ajudante 2 T, a deficiência na biossíntese destes factores podem ser responsáveis ​​para as desvantagens observadas de MoDCs [19] .

anteriormente estabelecido um método de aderência ao plástico em dois passos para a geração de grande escala de DCs derivadas de ambos umbilical CD34 + do sangue do cordão células [17] e PTM (células mononucleares) [20]. As DCs geradas pelo nosso método tem um fenótipo maduro e são funcionalmente activa. No entanto, uma das citocinas utilizadas para gerar DCs pelo nosso método é a IL-4 e, como mencionado acima IL-4 pode afectar libertação de ácido araquidónico a partir do membrane.We a hipótese de que a adição exógena de AA a nossas culturas durante a fase de diferenciação pode ajudar na continuar a melhorar as funções de DCs. A razão para a adição de AA exógeno foi que ela poderá ser convertidos em prostaglandinas num (COX-1) e 2-ciclooxigenases forma ciclooxigenases-1 (COX-2) dependente. Para verificar esta hipótese, no presente estudo testou o efeito da adição AA em

in vitro

geração de DC. Nossos dados demonstraram que, de fato AA

+ DCs são superiores em funções, tais como uma melhor

in vitro

e

in vivo

migração, capacidade estimuladora de células T, a captação de antigénio, a atividade CTL, significativamente maior níveis de transcrição de COX-2 e uma citocina Th1 favorável do AA

– DCs. Assim, os nossos resultados nos levar um passo mais perto para gerar a forma melhoram as da vacina contra o câncer baseada DC.

Materiais e Métodos

As citocinas

As citocinas humanas recombinantes utilizadas para o estudo foram Fms como tirosina-quinase 3 de ligando (Flt-3L), trombopoietina (TPO), factor de células estaminais (SCF), a interleucina-4 (IL-4), factor de estimulação de granulócitos monócitos -colony (GM-CSF), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), CD40 ligando e ligando de quimiocina-19 (CCL-19). Todas as citocinas humanas recombinantes foram adquiridos de Peprotech Ásia, Revohot Israel

Os anticorpos

Os anticorpos usados ​​para citometria de fluxo foram rato anti mAbs humanos:. CD1a, CD34, CD11c, CD40, CD8 -APC marcado ; CD14, CD20, CD33, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-A2, CD45RA-PE com etiquetas; CD3, CD54, HLA-DR, HLA-ABC -FITC marcado, anti CD murino 45,1 -PB marcados e CCR-7 (purificado mAb de rato anti-humano). Todos os anticorpos monoclonais e respectivos controlos isotípicos utilizados para o estudo foram adquiridos de BD Pharmingen (San Diego, CA).

Outros reagentes utilizados

araquidônico a ácido (Cat. No. é A3555) a partir de Sigma Aldrich, um produto testado de cultura de tecidos derivadas de fígado de porco. A pureza do produto foi ≥99%, tal como analisada por cromatografia gasosa capilar

Ficoll Hypaque-Histopaque (densidade 1,007 g /ml).; isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com dextrano (40 kDa); Wright Stain, Giemsa, lipopolissacarídeo, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) e IMDM (Modificado de Dulbecco meio de Iscove) todos eram da Sigma Aldrich; kit ELISA (BD OptEIA); Heparina de SRL Pvt. Limited, Mumbai; Hidroxi etil amido (HES), Rosette setembro de isolamento de células T (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá); [

3H] timidina (240 GBq /mole mili, BRIT, Navi Mumbai, Índia); Dimetil sulfóxido (MP biomédica, Ohio, EUA); kit Dynal para o isolamento de mRNA (Dynal ASA, Oslo Noruega).

Recolha e Tratamento de Amostras de sangue do cordão

sangue do cordão umbilical (CB) amostras foram obtidas a partir dos hospitais locais de acordo com o conselho de revisão institucional [Comitê de Ética Institucional (IEC) e da Comissão Institucional de Stem Cell Research (IC-SCRT)] -aprovado orientações éticas que estão em conformidade com a Declaração de Helsinki. Foi obtido um consentimento informado por escrito antes da mãe. O processo de aprovação foi aprovado pelo IC-SCRT. As cópias impressas dos formulários de consentimento assinados são numerados e arquivados com a gente. As amostras foram coletadas em recipientes estéreis contendo heparina sem conservantes (40 UI de heparina /ml de sangue) em IMDM simples. As amostras foram levadas para o laboratório em blocos de gelo e foram processadas para isolamento de células mononucleares (MNC).

Isolamento de MNC

multinacionais sangue do cordão umbilical foram separadas por Ficoll centrifugação em gradiente Hypaque. As células na interfase foram recolhidas e lavadas para remover o Ficoll-Hypaque. contagem de células nucleadas (violeta coloração de cristal) foi tomada e as multinacionais foram utilizados para a geração de DC.

O isolamento de células T de sangue periférico

O sangue periférico foi coletado de doadores saudáveis ​​de acordo com a avaliação institucional borda. [Comitê de Ética Institucional (IEC) e da Comissão Institucional de Stem Cell Research (IC-SCRT)] -aprovado orientações éticas que estão em conformidade com a Declaração de Helsinki. Foi obtido um consentimento informado por escrito antes do doador saudável. O processo de aprovação foi aprovado pelo IC-SCRT. As cópias impressas dos formulários de consentimento assinados são numerados e arquivados com a gente. Células T foram isoladas a partir de sangue usando kit de selecção negativa (Roseta setembro) de acordo com instruções do fabricante (Stem Cell Technologies). Depois de Ficoll células gradiente Hypaque na interfase de Ficoll e meio foram recolhidos, lavados então utilizados nos experimentos.

In Vitro

Geração e Cultura de DCs

Expansão culturas e aderência de plástico.

PTM (frescos ou congelados) foram expandidas por 3 semanas, em seguida, enriquecidas em células CD14 + por aderência ao plástico e, posteriormente diferenciadas conforme descrito anteriormente [17], [20]. Resumidamente, após 21 dias de expansão, as células foram lavadas e semeadas a uma densidade de 3 x 10

5 células /poço em placas de seis poços contendo 2 ml de IMDM suplementado com 1% de plasma autólogo. As células foram mantidas durante 1,5 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora e o não-aderentes e as células fracamente aderentes foram removidos por lavagem com IMDM. As células aderentes foram utilizados para a geração de DC

Diferenciação de DCs a partir de precursores na presença de AA (AA

+ DCs) e ausência de AA (AA

– DCs)..

As populações de células precursoras foram divididos em dois conjuntos. As células foram induzidas para se diferenciarem como DCs através da sua cultura em GM-CSF (50 ng /ml) e IL-4 (30 ng /ml) durante 3 dias, no dia 3

rd o GM-CSF (50 ng /ml) mais TNF-α (30 ng /ml) foram adicionados às culturas e ainda mantida durante 4 dias em IMDM suplementado com 5% de plasma autólogo. A fim de avaliar o efeito de AA, um conjunto de cultura foi mantida com 100 uM de AA para além das condições acima mencionadas. No dia 7, as células foram sujeitas a maturação com uma combinação de TNF-α, lipopolissacarídeos, e CD40L, na concentração de 100 ng /ml cada, durante 48 horas. A concepção experimental é representado sob a forma de um fluxograma, a Fig. S1. Em todos os experimentos DCs geradas sem AA foi considerada como conjunto de controle e com AA foi considerada como conjunto de teste

Análise morfológica:.. Wright e Giemsa Coloração

As células aderidas em placas de cultura foram fixadas em metanol durante 10 minutos à temperatura ambiente e coradas com Wright Giemsa e. As observações foram feitas em microscópio invertido e as imagens foram tiradas (Olympus IX70)

Análise fenotípica: Citometria de fluxo

AA maduro

+ e AA

– DCs foram lavadas e suspensas.. em 2 × 10

5 células em 100 ul de solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e a coloração foi levada a cabo de acordo com o protocolo descrito [17], [20]. Para a CCR-7 coloração, as células foram incubadas com anticorpos primários seguido de secundárias e terciárias de 25 minutos cada. As células foram lavadas duas vezes, após incubações de cada anticorpo e finalmente ressuspenderam-se em 1% de paraformaldeído. As células foram analisadas num citómetro de fluxo (FACS Canto II a partir de BD Pharmingen- San José, Califórnia). Os detritos celulares foram eliminados da análise usando um portão em dispersa para a frente e lateral, e as células totais foram analisadas. Os dados foram analisados ​​e sobreposições histograma foram preparadas usando Diva FACS software de computador e celular Busca Pro (Beckon Dickinson San Jose Califórnia), respectivamente.

Caracterização funcional

ensaio Endocytosis com FITC-dextrano.

DCs imaturos colhidos no dia 5 foram incubadas com FITC-dextrano (20 ug /mL), quer em + 4 ° C (controlo internalização) ou a + 37 ° C, durante 30 e 60 minutos. As células foram então lavadas três vezes com PBS frio contendo 0,01% de azida de sódio e 1% de BSA. As células foram re suspensos em 1% de paraformaldeído e foram adquiridas em um citômetro de fluxo (Canto II, BD).

quimiotaxia.

DCs A quimiotaxia do

in vitro

gerados direção CCL-19 foi avaliada em 24 poços placas de cultura celular com BD Falcon

™ cultura celular 0,8 mm inserções. 500 mL de IMDM com ou sem rhCCL-19 (concentração final, 500 ng /mL) foi adicionada à câmara inferior de acordo com o protocolo descrito [17], [20]. Para verificar a especificidade do receptor de quimioquina (CCR) interacção, Em algumas experiências as DCs foram pré-tratados com o anticorpo de bloqueio de CCR-7 durante 1 h em 1 × PBS e, em seguida, a sua migração para CCL -19 foram estudados como descrito acima. As células migradas foram coradas pelo corante azul de tripano e as células viáveis ​​foram contadas utilizando um hemocitómetro. Os resultados são expressos como o número médio de migração de células ± desvio padrão (SD).

Reacção leucocitária mista (MLR).

T alogénicos células foram distribuídos em 10

5 células por bem em 96 poços de fundo redondo micro placas (Greiner Bio-One) e foram co-cultivadas na presença de números graduadas de DC irradiadas (2500 rad, de origem CO) em 200 ul de meio contendo 10% de sangue de cordão reunidas AB + do plasma. A incorporação de timidina foi medido no dia 3 após um pulso de 18 horas com [

3H] timidina (1 uCi /cavidade), utilizando procedimentos convencionais [17], [20].

medição de citoquinas.

os sobrenadantes da

in vitro

culturas DC produzidos foram recolhidos em 48 horas após a adição de estímulos de maturação e foram mantidas congeladas a -20 ° C. Os sobrenadantes foram subsequentemente testadas quanto ao teor de citocinas (IL-10 e IL-12 p70) por ELISA, utilizando um kit de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Quantidade de interleucinas presentes nos sobrenadantes foram calculados pelo método de curva padrão.

In vitro

CTL (linfócitos T citotóxicos) Ensaio

Preparação de lisado celular.

MCF-7 é uma HLA-A2 restrita linha de células e foi utilizado como linha de células alvo no ensaio de CTL. A lise das células MCF-7 foi feito por descongelação repetidos de congelação, em seguida, seguido por sonicação. Depois de estimativa proteína esterilização do filtro foi feito e o lisato foi armazenado a -80 ° C durante antigénio pulsante ao DCS.

A geração de células efectoras e o ensaio de CTL.

HLA-A2 positiva cordão As multinacionais de sangue foram usados ​​para gerar DCs. Imaturo DCs foram incubadas com lisado de células MCF-7, a uma concentração final de 100 ug /ml de proteína, juntamente com KLH (hemocianina de lapa) 25 ug /ml durante 48 horas como estímulos de maturação do meio de cultura para apresentação transversal de antigénio tumoral de células T naive autólogas. Para o conjunto de DCs de controlo, os estímulos de maturação compreendida de 100 ng /ml cada de LPS, CD40L e TNF-α. As células T naive autólogas foram obtidos por triagem de CD3, CD8 e células positivas CD45RA em FACS Aria (BD). As células T naive foram co cultivadas com células MCF-7 de lisado DCs pulsadas que foram gerados a partir da mesma amostra de SCU com ou sem AA. cultura co DC-culas T foi mantida durante 3 semanas, com a adição de citocinas IL-2 (0,1 ug /ml) e IL-7 (5 ng /ml) e a estimulação re semanalmente com DCs antigénio fresco pulsadas para gerar efectoras células citotóxicas assassino . CTL assim gerado a partir de LPS de AA pulsado e lisado pulsadas

+ DC /AA

– DCs foram co cultivadas com as células alvo MCF-7 durante 18 horas. As células foram então lavadas com meio de deslizamento e, em seguida, pulsadas com [3H] timidina durante 8 horas. Por cento morte de MCF-7 foi calculado por ensaio P-JAM [21], [22] com a matança formulação% = CPM [Alvo sozinho – Target + assassino]. X 100 /CPM alvo Sozinho

RT análise de PCR

mRNA foi isolado do AA

+ DCs e AA

– DCs usando kit Dynabeads mRNA DIRECT, conforme as instruções do fabricante. Os ARNm foram eluídas transcrito reversamente em ADNc utilizando transcriptase reversa (Sigma Aldrich) e iniciadores de oligo-dT (Invitrogen), conforme as instruções e a PCR foi realizada com os iniciadores específicos. O ciclo térmico utilizado foi (95 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 45 seg, emparelhamento (como por genes diferentes) durante 45 seg, extensão a 72 ° C durante 2 min) durante 35 ciclos e uma extensão final a 72 ° C durante 5 minutos. As sequências dos iniciadores utilizados estão descritos na Fig. S2.

Homing de DCs maduras em camundongos NOD-SCID

O NOD /camundongos LtSZ-SCID /SCID foram obtidos a partir dos Laboratórios Jackson e foram criados no biotério do nosso instituto. O estudo foi realizado aderindo às diretrizes da instituição para pecuária e foi aprovado pelo AICE-NCCS /CPCSEA (animal Institucional ética comissão de NCCS /Comissão para efeitos de controlo e supervisão de experiências com animais Número de aprovação:. IACUC-Institucional animal Cuidados e Uso Comissão, EAF-Experimental Biotério /2004 /B-71). procedimentos com animais envolvendo infusão intra-venosa foram realizadas sob anestesia. Ratos em 4-6 semanas de idade foram expostos à dose letal sub de 300 rads de irradiação total do corpo de um

60Co (Gamma Câmara 5000, BRIT, Navi Mumbai, Índia). 10

6 AA

+ DCs e AA

– DCs foram infundidos através da veia da cauda nos sub ratinhos letalmente irradiados (n = 43; infusão de AA

+ DCs – 20 ratos, AA

– DCs – 20 ratos e PBS – 3 ratos). Os ratinhos foram sacrificados após 18 horas para avaliar homing de DC humanas na medula óssea. Homed células foram identificadas como DC por coloração com o mAb CD11c humano. CD murino 45,1 mAb foi usado para negar as células presença de origem murina

A análise estatística

Diferentes variáveis ​​de AA

+ DCs e AA

-. DCs foram comparados. A análise estatística foi feita usando Sigma Stat (Versão-2,03) e os gráficos foram preparados utilizando o software Sigma Plot (Versão 10) (Jandel Scientific, San Rafael, CA, EUA) e o GraphPad Prism Software 5 (San Diego, Califórnia, EUA). A análise estatística das diferenças entre os dois grupos foram feitas utilizando um teste t. valor de probabilidade: P ≤ 0,05 (*), p≤0.01 (**) P≤0.001 (***) foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

morfológica e Caracterização fenotípica de DCs

O AA

+ DCs e AA

– DCs mostrar morfologia semelhante

os precursores DC geradas após 21 dias de expansão das multinacionais foram enriquecidas pelo método de aderência ao plástico e mais diferenciada como DCs [20].. Houve diferença marginal no número absoluto de DCs geradas pelos dois métodos de mesmo número de começar população (aproximadamente 3 × 10

7 AA

+ DCs e 2,5 × 10

7 AA

– DC por 10 multinacionais

7 entrada). A morfologia do AA

+ DC e AA

– DCs era comparável. Verificou-se que as DCs de ambos os conjuntos exibiu a morfologia característica velado e agrupamentos DC; FIG. S3. imagens de contraste de fase revelou DCs imaturas típicos aderentes, em ambos os conjuntos de [S-3 (A)]. Após a adição de estímulos de maturação agregados típicos DC não aderentes foram observados em ambas as culturas de [S-3 (B)]. Wright-Giemsa coloração de células aderentes maduros mostra a presença de DCs com dendrites nos dois conjuntos [S-3 (C)]

O AA

+ DCs e AA

-. DCs mostrar semelhante DC fenótipo.

In vitro

DCs geradas foram coradas para um painel de DC marcadores associados específicos e DC e analisadas no citômetro de fluxo. FIG. 1A representa o perfil de citometria de fluxo de uma amostra representativa com células positivas por cento e valores de MFI entre parênteses. AA

+ DCs e AA

– DCs mostrou uma alta e uma percentagem equivalente de células que expressam diferentes moléculas co-estimuladoras, como CD40, CD80, CD86, DC-associado CD11c integrina, moléculas de adesão, como CD54 e CD58, moléculas MHC de classe II como HLA ABC e HLA DR. FIG. 1B e 1C representa o perfil fenotípico em termos de positividade por cento e MFI respectivamente, de três amostras (média ± DP, n = 3). A expressão de linhagem mielóide marcador específico de CD 33 foi significativamente maior em AA

+ DCs (67,4%) em comparação com a AA

– DCs (38,7%) A Fig. 1B. valores de MFI de molécula de adesão CD 58 foi encontrada significativamente maior em AA

+ DCs (1423), em comparação com AA

– DCs (1048) Fig. 1C. Tomados em conjunto, AA

+ DCs e AA

– DCs mostrar morfologia semelhante e típica fenótipo DC intersticial

perfil

(A) FACS histograma de uma experiência representativa.. histogramas cheios mostrar o controle isotipo e os abertos mostram o fenótipo específico com respectivos valores de MFI nos suportes. (B) Vê-se que DCs completamente maduros foram geradas e não havia muita diferença nos níveis de marcadores de superfície diferentes de expressão, exceto CD33 (linhagem mielóide) foi maior em AA

sets + DC (média ± SD, n = 3, P ≤ 0,05 *). (C) Gráfico de barras para a DC marcadores específicos e associados em termos de MFI, para o CD 58 (molécula de adesão) foi encontrada a diferença significativamente maior (média ± SD, n = 3, P ≤ 0,05 *). (D) Receptor mediada captação de antigénio de AA

+ DCs e AA

– DCs: captação de dextrano-FITC por DCs (n = 3, a média ± SD). O valor de controlo (absorção a 4 ° C) é deduzido do respectivo valor de teste (captação a 37 ° C).

Caracterização funcional de DCs

A capacidade de endocitose de AA

+ DCs foi maior em comparação com a AA

-. DCs

DCs imaturas são caracterizadas pela capacidade de absorção de antigénio através de mecanismos diferentes. Analisou-se a capacidade dos

In vitro

DCs geradas para a sua captação de antigénio mediada por receptor medindo a absorção FITC etiquetado dextrano. AA

+ DCs e AA

– DCs foram igualmente eficientes na captação mediada pelo receptor em 30 min e 60 min intervalos de tempo testados. AA

+ DCs exibiu absorção de FITC-dextrano alta e comparável, em comparação com AA

– DCs Fig. 1D (média ± DP, n = 3).

In vitro

DCs geradas exibiram mais absorção a 60 min de intervalo em relação a 30 min, mostrando que eles são funcionalmente activa e apresentam uma absorção aumenta com o aumento no tempo.

Melhoria da

in vitro

quimiotaxia de AA

+ DCs em direção CCL19.

a migração dos DCs em direção a um gradiente de quimiocina é uma propriedade funcional importante porque nos protocolos de imunoterapia que eles devem ser capazes de migração do local da injeção para a os gânglios linfáticos, em que eles interagem com as células T e iniciar a resposta imune. FIG. 2a mostra, as células suspensas em IMDM adicionadas à câmara superior no poço a 0 hrs. Nenhuma migração espontânea foi observada nos poços após 3 horas, onde CCL-19 não foi adicionado (Fig. 2B). Mais número de AA

+ DCs (Fig 2D.) Migrou em direção CCL-19, em comparação com AA

– DCs (Fig 2C.) Ea diferença foi estatisticamente significativa (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01 ; n = 3; A Fig. 2E). Migração para CCL19 é principalmente porque os DCs expressar receptor CCR7. Quando manchado as DCs dos dois conjuntos para o anticorpo do receptor CCR-7, o AA

+ DCs e AA

-. DCs mostrou células positivas 93,25% e 91,89%, respectivamente, juntamente com valores de MFI em suportes (Fig 2F ). Os valores médios de IFM de 3 amostras para AA

– DCs foram 821 ± 156 e AA

+ DCs foram 1,089 ± 392. Assim, ambos os conjuntos exibiram elevada e comparável nível de expressão CCR7. A especificidade de CCR7-CCL19 reacção ligando do receptor foi ainda confirmada através do bloqueio do receptor CCR-7 com Ab de bloqueio e, em seguida, testando a capacidade migratória. Como pode ser visto na Fig. 2G, houve uma redução significativa na migração de células pré-tratadas com o anticorpo de bloqueio nas duas culturas. A migração das células de teste foi novamente significativamente mais elevada do que as células de controlo. Estes dados indicaram que, a adição de AA durante o passo de diferenciação de DCs melhora significativamente a sua capacidade migratória.

Depois de 3 horas (B) n migração espontânea foi observada nos poços, onde CCL-19 não foi adicionada. Menos não. de AA

– DCs (C) migraram em direção CCL-19 do que AA

+ DCs (D). (E) AA

+ DCs mostrou estatisticamente migração eficiente no sentido de CCL-19 em comparação com AA

– DCs (n = 3, a média ± SD). histograma perfil (F) FACS de uma experiência representativa que mostra a expressão de CCR-7 dos receptores de quimioquinas, juntamente com os valores de MFI entre parênteses. Os histogramas a cheio mostram o controlo de isotipo e os abertos mostram o fenótipo específico. (G) O bloqueio com a CCR-7 Ab provoca redução significativa na migração dos AA

+ DCs e AA

– DCs (n = 3, a média ± SD). [P ≤ 0,05 (*), p≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].

AA

+ DCs função estimuladora superiores T-Cell exibiu.

DCs são caracterizados pela sua capacidade de estimular células T alogénicos . Esta capacidade foi avaliada por MLR. A MLR foi realizada misturando o AA

+ DCs e AA

– DCs com células T alogeneicas do sangue periférico em diferentes proporções. Triplicados foram tomadas para cada concentração testada. A proliferação de células T foi medida pelo ensaio de incorporação de timidina conforme descrito nos métodos. Os dados da FIG. 3 (média ± SD, n = 3) indicam que o AA

+ DCs têm maior capacidade allostimulatory. As diferenças foram estatisticamente significativas a quatro dos seis DC: índices de células T testados. No 1:10, incorporação de timidina em AA

+ foi maior do que AA

-. Set Online

AA

+ DCs mostrou uma melhor estimulação das células T do que o AA

– DC , as diferenças foram significativas em quatro de seis DC: índices de células T testado (* P ≤ 0,05, ** p≤0.01). Os dados representativos de três experiências independentes, é apresentada. TdR = timidina.

citocinas perfil de AA + DCs é mais favorável para a imunoterapia adoptiva.

IL-12 não apenas sinais para o desenvolvimento de funções efetoras de células T, mas também programas as as células sobrevivam como células de memória funcionais [23].

In vitro

DCs geradas eram capazes de segregar um nível elevado de IL-12 p70 e um baixo nível de IL-10. O AA

+ DCs mostrou um melhor perfil de secreção de IL-12 p70 em comparação com AA

– DCs (Fig. 4). AA

– DCs no outro lado tinha um maior nível de secreção de IL-10 em comparação com o de AA

+ DC (n = 3). A proporção de IL-12 /IL-10 foi mais elevada em AA

+ DCs, como mostrado na Fig. S4. Estas observações sugerem que a AA

+ DCs ter um melhor perfil de citocinas Th1 favorável em comparação com AA

– DCs, tornando-os uma escolha melhor para a aplicação clínica

Os resultados mostram que DCs geradas por ambos. condições de cultura foram capazes de secreção de IL-12 p70 e de IL-10. (A) AA

+ DCs mostrou uma melhor secreção p70 IL-12 em comparação com AA

– DCs. (B) Similarmente, AA

+ DCs têm baixo nível de IL-10 perfil de secreção, em comparação com AA

– DCs. Os dados de três amostras independentes são mostradas (N = 3, média ± DP). [P ≤ 0,05 (*), p≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].

AA

+ DCs demonstrar maior

in vitro

atividade CTL

Figura 5A apresenta dados de CTL de um exemplo representativo. Vê-se claramente que o AA

+ DCs são mais eficientes na função efetora de células T ou seja, trazendo sobre a matança de células MCF-7 no ensaio CTL, em comparação com AA

– DCs. A morte é significativamente mais elevado em quatro proporções de concentrações de células alvo efetoras. As outras duas amostras mostrou também tendência semelhante (Fig. S5). CTLs derivados de AA

+ DCs exibiu uma função melhorada efetoras ou seja matança geral melhorada, em comparação com CTLs derivados de AA

– DCs. Para o conjunto de controle negativo, AA

+ DCs e AA

– conjuntos DCs foram maturados com LPS, TNF-α e CD40L [20]. Os CTLs assim gerado não foram eficazes para matar a linha de células alvo MCF-7. Nenhuma morte foi observado em qualquer um destes conjuntos (dados não mostrados). Como controlo negativo adicional para a especificidade de alvo, os CTL obtidos de MCF-7 DCs lisado preparado foram utilizados no ensaio de CTL contra a linha de células H1299, mas sem efeito de morte foi observado nestes conjuntos, bem (valores de CPM para a incorporação de timidina em caso de controlo foi 12649,33 ± 30,73 SD. para o grupo pulsado e não pulsados ​​em maior alvo para os rácios de células T foram 12405,66 ± 36,35 SD e 12537,33 ± 27,47 SD respectivamente).

(a) os dados de CTL de uma amostra representativa ou seja, morte do alvo ( MCF-7) células por CTLs gerados por AA

+ DCs /AA

– DCs pulsadas com MCF-7 ligado celular. CTLs derivados de AA

+ DCs exibiu uma função melhorada efetoras ou seja matança geral melhorada, em comparação com CTLs derivados de AA

– DCs. A morte é significativamente mais elevado em quatro proporções de concentrações de células alvo efetoras. (* P ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001). perfil (B) A expressão gênica de três enzimas-chave associadas a via de AA junto com a GAPDH gene housekeeping. Há um aumento da regulação substancial do nível de transcrição da enzima chave COX-2 nas DCs cultivadas na presença de AA.

Os níveis de mRNA de enzimas envolvidos no metabolismo do AA são mais elevados em AA

+ DCs

Os níveis de transcrição de três enzimas associadas com a via metabólica do ácido araquidónico, tais como a COX-1, COX-2, PLA

2, não foram detectadas por RT-PCR realizada de acordo com métodos padrão. FIG. 6B.