Abstract

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é um evento crucial na invasão tumoral e metástase. No entanto, a maioria dos estudos EMT passados ​​foram realizados na cultura convencional em monocamadas bidimensionais (2D). Portanto, ainda não está claro quais fenótipos invasiva são adquiridos por células cancerígenas induzida por EMT. Para fazer face a este ponto, buscou-se caracterizar células EMT na cultura gel mais fisiológica, tridimensional (3D) de colágeno. EMT foi induzida por tratamento de três linhas de células de carcinoma humano (A549, Panc-1 e MKN-1) com TGF-ß. O tratamento de TGF-ß estimulou estas células para sobre-expressar a γ2 marcadores invasão laminina e MT1-MMP em cultura 2D, em adição à indução de alterações morfológicas bem conhecido e expressão do marcador de EMT. indução EMT motilidade celular melhorada e aderência à fibronectina e colagénio em cultura 2D. Embora as células de EMT mostrou crescimento celular comparável para controlar células em cultura 2D, as suas taxas de crescimento foram extremamente suprimida em culturas de gel de agar e de colagénio macio. Mais caracteristicamente, as células cancerígenas induzida por EMT comumente e marcadamente estendida saliências invasivos em gel de colágeno. Estas saliências foram suportados principalmente pelos microtúbulos em vez do citoesqueleto de actina. Snail-introduzido, células EMT estáveis ​​mostrou saliências semelhantes em condições 3D sem TGF-ß. Além disso, estas saliências foram suprimidos pela colchicina ou inibidores de proteína de choque térmico 90 (HSP-90) e a proteína fosfatase 2A. No entanto, os inibidores de MMP não suprimir a formação saliência. Estes dados sugerem que a EMT aumenta a infiltração de células do tumor no estroma intersticial saliências estendendo-base de microtúbulos e suprimir o crescimento celular. A adesão celular elevada para fibronectina e colágeno e motilidade celular alta também parecem importantes para a invasão tumoral

Citation:. Oyanagi J, Ogawa T, Sato H, Higashi S, Miyazaki K (2012) epitelial-mesenquimal Transição Estimula células cancerosas humanas para estender à base de microtúbulos invasiva Saliências e suprime celular Crescimento em colágeno Gel. PLoS ONE 7 (12): e53209. doi: 10.1371 /journal.pone.0053209

editor: Olivier de Wever, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 23 Agosto, 2012; Aceito: 27 de novembro de 2012; Publicado: 31 de dezembro 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Oyanagi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid (23112517 e 23300351) de Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Assim como as células epiteliais normais, células de carcinoma ductal

in situ

manter a polaridade celular, que é suportado por contacto célula-célula e adesão celular a membrana basal. Durante a progressão do cancro, algumas células de carcinoma perder a polaridade celular e invadir através da membrana basal e, em seguida, no tecido conjuntivo. Este fenómeno é referido como epitelial-mesenquimal transição (EMT) e que se pensa ser um acontecimento essencial da progressão do cancro [1] – [3]. EMT é crítica, não só para vários passos de desenvolvimento, tais como a gastrulação e formação da crista neural mas também para eventos patológicos tais como fibrose e tecido de cicatrização de feridas [1], [3], [4]. EMT é geralmente caracterizada pela perda de células epiteliais marcador de E-caderina, a sobre-regulação de marcadores mesenquimais, tais como N-caderina e vimentina, e obtenção da forma da célula fuso do tipo fibroblastos em culturas em monocamada [4].

EMT de células cancerosas é induzida normalmente por TGF-ß [5], mas outros factores de crescimento e factores micro-ambientais, tais como HGF, EGF e FGF, também são capazes de induzir ou promover alterações fenotípicas semelhantes, dependendo dos tipos de células [1] , [3], [6]. TGF-ß exerce várias atividades biológicas sobre o desenvolvimento e o crescimento, diferenciação, produção de matriz extracelular e a apoptose de células normais e cancerosas [7]. TGF-ß é um regulador de crescimento negativo de células epiteliais normais. Considerando que TGF-ß suprime o crescimento de células de tumor nos estágios iniciais da carcinogénese, promove a progressão do tumor em estágios posteriores [7]. tem sido desde há muito sabido que o TGF-ß a uma combinação com outros factores, tais como TGF-α e EGF, promove o crescimento independente de ancoragem de fibroblastos normais [8]. A actividade indutora de EMT de TGF-ß é mediada predominantemente pela via Smad, a principal via de sinais de TGF-ß complexos, que promove a expressão dos factores de transcrição relacionados com o EMT incluindo caracol, Slug, torção, e ZEB 1/2 [ ,,,0],6]. Estes factores de transcrição ligam-se a E-box elementos de sequências promotoras de ligação e suprimir a expressão de E-caderina em um nível de transcrição [9], [10].

EMT em células de cancro aumenta a expressão de invasion- ou metástase genes relacionados com tais como metaloproteinases de matriz (MMPs). O nosso estudo recente mostrou que a invasão do tumor γ2 marcador laminina, bem como a MMP-9, é induzida pela indução de EMT de células gástricas cancerosas [11]. Outros estudos recentes têm sugerido que as células cancerosas induzidas EMT têm resistência a fármacos anti-cancro e a radioactividade [12] e têm propriedades semelhantes a células estaminais do cancro [13]. Apesar de um número de estudos anteriores sobre o EMT de células cancerosas, no entanto, não é claro como EMT contribui para a invasão pelo tumor e metástases e o fenótipo invasivo são adquiridos por células cancerosas induzidas por EMT. Isto é, pelo menos, em parte devido ao facto de que a maioria dos estudos EMT foram realizados no sistema de cultura convencional bidimensional (2D). Tornou-se evidente que as células crescidas em cultura 2D plana consideravelmente diferente do que as cultivadas na tridimensional cultura (3D) na morfologia celular, proliferação, diferenciação, interacção célula-célula, interacção célula-matriz e a expressão do gene [14], [15 ]. A fim de compreender a consequência patológica da EMT de células cancerosas, parece importante para caracterizar células induzida por EMT em um sistema de cultura 3D mais fisiológica.

Neste estudo, caracteriza as células cancerígenas induzida por EMT em 2D cultura em monocamada e cultura em gel de colagénio 3D, usando três linhas de células. Descobrimos que as células induzidas EMT mostrou extensão proeminente de saliências invasivos baseados em microtúbulos e supressão do crescimento na cultura gel de colágeno 3D.

Resultados

EMT Indução de linhas de células cancerosas humanas Três

Para investigar alterações fenotípicas induzidas pela EMT de células cancerosas, foram utilizados modelos de três linhas de células cancerosas humanas. Nós anteriormente relatado que o TGF-ß e TNF-a induzir sinergicamente EMT em cultura livre de soro de MKN-1 células de cancro gástrico humano [11]. Tem sido relatado que a linha celular de adenocarcinoma do pulmão A549 [17] e linha celular de cancro pancreático Panc-1 [16] submetido a EMT por tratamento com TGF-ß. Neste estudo, foram primeiro testados três citoquinas (TGF-ß, TNF-a e EGF) para a indução de células de EMT A549 e Panc-1, analisando a expressão de alguns marcadores invasão do tumor, bem como marcadores de EMT. Em ambas as linhas celulares, única de TGF-ß foi necessária para induzir EMT como avaliado pela alteração morfológica mesenquimais (Fig. S1), bem como a redução da expressão de E-caderina e a indução de vimentina (Fig. 1A e B). TGF-ß simulado também a expressão de dois marcadores de invasão tumoral, MT1-MMP e da cadeia da laminina γ2, em ambas as linhas celulares. No entanto, uma combinação de TNF-α com TGF-ß aumentou ainda mais os níveis da cadeia da laminina γ2 e MMP-9 em células A549 (Fig. 1A). A cadeia da laminina γ2 e MT1-MMP, também foram induzidos por TNF-α e /ou de EGF em células Panc-1 (Fig. 1B). Além disso, verificou-se que embora tanto o TNF-α e TGF-ß foi necessário para a indução de células de EMT MKN-1 em cultura isento de soro, apenas a TGF-ß foi necessário na presença de soro (dados não mostrados). Estes resultados indicam que o TGF-ß é o indutor mais comum e potente de EMT para as três linhas de células de cancro, mas de TNF-α também é necessário para a expressão eficiente de alguns marcadores de invasão, dependendo dos tipos de células.

As células A549 (a) e Panc-1 (B) foram incubadas em meio isento de soro com 10 ng /mL de EGF, 10 ng /ml de TNF-α, 10 ng /ml de TGF-ß, ou TNF-α + TGF-ß . Após 48 h de incubação, meio condicionado (MC) e celulares lisados ​​foram preparados e sujeitos a imunotransf erência para os marcadores EMT (E-caderina e vimentina nos lisados ​​de células), o y2 invasão marcador laminina (CMS), MT1-MMP (lisados ​​celulares ), e actina como controlo de carga interno (lisados ​​celulares). Os menores painéis mostram zimografia de MMP-9 e MMP-2 no CMS. Os valores entre parênteses indicam o tamanho molecular aproximado em kDa. Outras condições experimentais são descritos em Materiais e Métodos.

Efeito da EMT Indução na adesão e migração celular em monocamada Cultura

EMT

Como mostrado acima,-SS TGF induzida de forma eficiente entre os três diferentes linhas de células de carcinoma. Em seguida, examinamos o que fenótipos foram adquiridas pela indução EMT de células cancerosas para o seu crescimento invasivo. Primeiro, a actividade de adesão celular de células A549 foi investigada após a indução de EMT, utilizando três substratos de adesão celular, laminina-332, fibronectina e colagénio tipo I. As células foram pré-tratadas com TGF-ß durante 24 h e depois semeados sobre estes substratos. Como mostrado nas Figs. 2A e 2B, as células de controlo não tratadas mais eficazmente aderida à laminina-332. tratamento TGF-ß diminuiu apenas ligeiramente a adesão celular à laminina-332. Em contraste, aumentou significativamente a eficiência de adesão celular da fibronectina para substratos estromais e colagénio tipo I. O ensaio de adesão celular de lapso de tempo elétrica mostrou claramente as alterações induzidas pelo EMT na atividade de adesão celular de células A549 a fibronectina e colágeno tipo I (Fig. 2C). Estas alterações também foram observadas em Panc-1 e MKN-1 de células (dados não apresentados).

(A e B) Uma placa de noventa e seis poços foram revestidas com 2 ng /ml de laminina-332 (Lm332 ), 5 ug /mL de fibronectina (FN), e 2 ug /ml de colagénio I (Col I) a 4 ° C durante a noite, e, em seguida, bloqueadas com 1,2% de BSA durante 1 h a 37 ° C. As células A549 foram incubadas com 10 ng de TGF-ß ml /em meio isento de soro durante 24 h. As células tratadas com TGF-ß (TGF-ß) e células não tratadas (de controle) foram suspensos e inoculadas na placa. Após incubação durante 30 min, imagens de contraste de fase foram levados a actividade (A), e a adesão de células foi medida (B). A barra de escala indica 50 um. Os números relativos de células ligadas foram determinadas como descrito em Materiais e Métodos. Cada barra indica a média ± DP de células aderentes em poços em triplicado. (C) ensaio de adesão celular Eléctrica de lapso de tempo com e-placas. A placa foi pré-revestidos com fibronectina (○, •) e colágeno I (□, ▪) como mostrado acima, e a adesão de células tratadas com TGF-ß (TGF-ß: •, ▪) e células não tratadas (controle: ○, □) para a placa foi monitorado a cada 5 minutos. índice da célula indica unidade arbitrária reflectindo fixação e disseminação das células na matriz de microeléctrodos no fundo dos poços. Outras condições experimentais são descritas em Materiais e Métodos.

Em segundo lugar, a actividade de migração celular foi investigada utilizando dois ensaios diferentes. Em

In vitro

ferida ensaio de cura, o TGF-ß promoveu significativamente a migração celular de A549 e células Panc-1 na ausência de TNF-α sob condições suplementado com soro (Fig. 3A e B). TNF-α não tem efeito adicional sobre a actividade de migração das células (dados não apresentados). Quando a migração celular foi analisada por microscopia de vídeo de lapso de tempo, a motilidade celular aumentada pelo tratamento com TGF-ß foi mais claramente mostrado com as duas linhas de células (Fig. 3C). Nós também confirmou que o tratamento de TGF-ß a motilidade aumentada das células MKN-1 na ferida curando ensaio (dados não apresentados).

(A e B) Para medir a actividade de migração celular, A549 (esquerda painéis) e Panc-1 (painéis da direita), as células foram submetidas a

in vitro

ferida ensaio de cura na presença ou ausência (controlo) de TGF-ß, como descrito no texto. Micrografias de contraste de fase das culturas foram colhidas após 16 horas de incubação. linhas quebradas pretas indicam as bordas da ferida inicial. Barra de escala, 50 mm. B) área de migração celular foi estimada através da análise do pixel com Imagem J. Cada barra indica a média ± SD para as áreas de células que migraram em 3 campos diferentes (painéis da direita). (C) As células que tinham sido pré-tratadas com ou sem TGF-ß durante 24 h foram incubadas em 1% de meio de FBS contendo sem ou com o TGF-ß para uma placa de 24 cavidades, durante 6 h a 37 ° C. A migração celular foi monitorizada com um sistema de vídeo de lapso de tempo de 12 h. distância de migração celular foi medida por 15 células seleccionadas aleatoriamente. Cada barra indica a média ± DP para a velocidade de migração de células de 15 células. Outras condições experimentais são descritas em Materiais e Métodos.

Efeito de EMT Indução em Anchorage-dependente e independente de Crescimento Celular

Em terceiro lugar, a actividade de crescimento celular de células de EMT-induzida foi investigada sob três condições diferentes. Na cultura em monocamada 2D, o tratamento de TGF-ß não afectou o crescimento de células MKN-1 e de forma insignificante, ou apenas ligeiramente suprimido que de A549 e células Panc-1 (Fig. 4a). Quando a formação de colónias foi examinada em culturas 2D esparsos (500 células /35 mm de prato) de A549 e células Panc-1, não houve diferença significativa entre as culturas de TGF-ß-tratados e não tratados (dados não mostrados). Na cultura em suspensão em placas não-adesivas, as três linhas celulares cresceram lentamente formando agregados de células ou em esferóides sobre as placas. Sob tais condições, o tratamento de TGF-ß suprimiu o crescimento de células MKN-1, mas não teve efeito sobre o de células A549 e Panc-1 (Fig. 4B). Em contraste, a formação de colónias de as três linhas de células em cultura de ágar mole foi fortemente suprimida pelo tratamento com TGF-ß. Tanto o número de colónias totais e a área total da colónia foram extremamente reduzida nas linhas de células TGF-ß-tratados do que os não tratados (Fig. 4C, 4D, e S2). células Panc-1 No entanto, o TGF-ß-tratadas formaram colónias relativamente grandes em comparação com as células não tratadas (Fig. S2). A falta de adesão célula-célula mediada por E-caderina em TGF-ß-tratados células pode suprimir os potenciais de sobrevivência e a proliferação celular na condição independente de ancoragem

(A) MKN-1 (1,0 ×. 10

4 células), A549 (0,5 x 10

4 células) e Panc-1 (1,0 x 10

4 células) foram incubadas em cada poço contendo FBS a 1% contendo meio sem (controlo) ou com TGF-ß em placas de cultura de 24 cavidades durante 7 dias em cultura de monocamada. Após a incubação, o número de células foi medida com um contador de células. Cada barra indica a média ± DP dos números de células nos poços em triplicado. (B) As células foram cultivadas a uma densidade de 1 x 10

4 culas por po em placas de 24 cavidades de cultura de suspensão contendo 1% de FBS contendo meio sem (controlo) ou com TGF-ß durante 7 dias. O número relativo de células foi medido utilizando um kit de contagem de células Dojindo 8. Cada barra indica a média ± desvio padrão dos valores de absorvância a 485 nm em poços em triplicado. As células (C e D) foram inoculadas a uma densidade de 7000 células por 35 mm de prato em FBS a 10% contendo meio de agar mole, sem (controlo) ou com TGF-ß e incubou-se durante 10 (MKN-1) ou 14 (A549 e Panc-1) dias. Após a incubação, as células foram coradas com

P

-iodonitrotetrazolium violeta, e o número de colónias total (C) e a área total da colónia (D) foram determinadas por Image J e mostrados como o número relativo ao controlo ( 100%). Cada barra indica a média ± DP de poços em triplicado. Outras condições experimentais são descritos em Materiais e Métodos.

Comportamento das células cancerosas induzidas EMT em 3D Colágeno Gel Cultura

A expressão gênica

in vivo

é diferente de que, no sistema de cultura de monocamada (15). Como um sistema de cultura que imita

in vivo

condições, usamos a cultura gel de colágeno 3D para caracterizar melhor as células cancerosas induzida por EMT. As células cancerosas foram cultivadas dentro da camada de gel de colágeno contendo TGF-ß e /ou outros fatores durante 7 dias. No gel de colagénio 3D, células MKN-1 mostrou extensões ou saliências proeminentes de membrana quando tratados com TGF-ß (Fig. 5A e B). Uma alteração morfológica similar foi observado em A549 e linhas celulares de Panc-1 (Fig. S3). A adição de TNF-α à cultura TGF-ß-promovido contendo ainda mais esta mudança morfológica apenas no caso de células MKN-1 (Fig. 5B). EGF sozinho, que induzida em células de EMT MKN-1, também induziu a formação de protrusão nesta linha de células, mas este efeito não foi observado em células A549 e Panc-1. Estes resultados sugerem que a alteração morfológica é específico para a indução de EMT, em vez de estimulação de TGF-ß.

(A) MKN-1 As células foram incubadas em 3D de colagénio com ou sem citocinas indicadas em lâminas de câmara 3 poços para 7 dias. O meio de cultura foi trocado a cada 3º dia. Barra de escala, 50 mm. (B) Depois de 5 dias de incubação, o número de aglomerados de células totais e aqueles com saliências foram contadas num campo central sob um microscópio, e a percentagem de aglomerados de células protrusão-positivos foi calculada. Cada barra indica a média ± DP dos números relativos de aglomerados de células protrusão-positivo em poços em triplicado. (C) Após 7 dias de incubação, as células em gel de colagénio foram coradas com um kit de contagem de células Dojindo 8 durante 4 h, e a absorvância a 485 nm de cada meio de cultura foi medido. Cada barra indica a média ± desvio padrão dos valores de absorvância nos poços em triplicado. Outras condições experimentais são descritos em Materiais e Métodos.

A seguir, analisou se a indução EMT suprimiu o crescimento celular dentro de gel de colágeno. Como encontrada na cultura em agar mole, de TGF-ß suprimiu fortemente o crescimento de todas as linhas celulares examinadas em gel de colagénio (Fig. 5C). EGF nunca ou apenas fracamente suprimiu o crescimento das três linhas de células em gel de colagénio 3D. TNF-α não teve qualquer efeito adicional significativo nestas culturas. Estes dados indicam que a indução de EMT promove uma extensão proeminente de saliências, mas suprime o crescimento celular nas culturas de gel de colagénio 3D das três linhas de células cancerosas.

Estrutura à base de saliências de microtúbulos induzida por colagénio em gel EMT 3D

Para caracterizar as saliências induzida pela EMT, analisamos as alterações do citoesqueleto após a indução EMT por TGF-ß. actina filamentosa (F-actina) e microtúbulos citoesqueleto de células de EMT-induzidas foram coradas por fluorescência com rodamina faloidina e um anticorpo específico para a tubulina, respectivamente. células MKN-1 foram estimuladas com TGF-ß em culturas 2D e 3D e, em seguida, coradas para os citoesqueleto (fig.6a e B). Na cultura 2D de células induzidas por EMT, fibras de stress robustas de F-actina, assim como os microtúbulos, apoiou a forma da célula original (Fig. 6A). No gel de colagénio 3D, filamentos F-actina foram fortemente detectadas à superfície da estrutura de esferóide em células não estimuladas (Fig. 6B). Em células TGF-ß-tratados, os filamentos de actina periféricos foram encontradas ao redor do corpo celular e saliências, mas fibras de stress foram raramente encontrados nas saliências. Em contraste, muitos feixes de microtúbulos foram detectados proeminentemente no centro das saliências nas células induzida por EMT. Nas células de controlo, microtúbulos estavam uniformemente distribuídos no citoplasma. Estes padrões de citoesqueletos foram geralmente encontrada em células MKN-1 e Panc-1 (dados não mostrados).

células MKN-1 foram incubadas sem (controlo) ou com 10 ng /ml de TGF-ß no sérica contendo meio de cultura em 2D (a), ou cultura em gel de colagénio 3D (B), durante 3 dias. Estas células foram para α-tubulina (verde) coradas por fluorescência utilizando um anticorpo específico, F-actina por rodamina faloidina (vermelho), e DAPI (azul). As imagens de fluorescência foram obtidas com um microscópio de fluorescência confocal. Outras condições experimentais são descritas em Materiais e Métodos.

Para examinar se a microtúbulos é um citoesqueleto princípio suporte das saliências induzida por EMT, examinámos os efeitos de alguns inibidores do citoesqueleto sobre a extensão de células induzida pelo colagénio em EMT gel. Citocalasina B e colchicina são conhecidos por inibir tanto a polimerização e estabilização de F-actina e microtúbulos, respectivamente. Quando as células foram tratadas com estes inibidores, ao mesmo tempo que o tratamento de TGF-ß, a extensão de células foi parcialmente inibida por 1 uM citocalasina B, mas completamente por 10 nM de colchicina (Fig. 7A). Quando estes inibidores foram adicionados 24 h após a estimulação de TGF-beta, as protuberâncias foram significativamente retraída por colchicina após 3 h de tratamento, mas não por citocalasina B (Fig. 7B). De igual modo, dois outros inibidores de microtúbulos vinblastina e taxol (paclitaxel) bloqueou dependentemente da dose a extensão celular quando adicionada em conjunto com o TGF-ß a cultura a 3D (Fig. S4). Analisamos também efeitos de alguns inibidores de sinais sobre a extensão celular induzida por EMT em gel de colágeno. A proteína fosfatase 2A (PP2A) cantharidin inibidor ea proteína de choque térmico-90 (HSP-90) inibidor radicicol, tanto que inibem a estabilização dos microtúbulos, fracamente inibida a extensão da célula (Fig. 7C). Quando tanto a cantaridina radicicol e foram adicionados em combinação, a extensão de células foi suprimida de forma aditiva. Estes dados sugerem que as saliências de células cancerosas induzidas EMT em gel de colagénio 3D são suportados principalmente pelos microtúbulos, e tanto a PP2A e HSP-90 actividades são necessárias para a formação saliência. Embora citoesqueleto de actina é necessário para a extensão das protuberâncias, parece desnecessária para manter as estruturas salientes.

células MKN-1 foram incubadas com 10 ng /ml de TGF-ß no meio contendo soro, em cultura em gel de colagénio 3D , conforme descrito nas Figuras 5 e 6. Para a cultura de colagénio foram adicionados vários inibidores, e a formação de protrusão foi quantificada 24 horas mais tarde (a, C e D) ou 3 h depois (B). (A) As concentrações indicadas de citocalasina B e colchicina foram adicionados ao meio de cultura ao mesmo tempo que a adição de TGF-ß. (B) citocalasina B (5 ^ M) e colchicina (1 uM) foram adicionados ao meio de cultura após incubação com TGF-ß durante 24 h. (C) MKN-1 As células foram tratadas sem (controlo) ou com cantaridina (1? M) e /ou do radicicol (1 uM) como descrito em (A). (D) MKN-1 As células foram pré-tratadas com 10 ug /ml de cada anticorpo neutra a 37 ° C durante 30 min, e as células pré-tratadas foram embebidas em gel de colagénio contendo 10 ug /ml do anticorpo anti-integrina indicada e 10 ng /ml de TGF-ß. Todos estes inibidores não eram citotóxicos, pelo menos, nas condições experimentais acima, como analisado pela coloração com azul de tripano. No entanto, tornou-se evidente efeitos citotóxicos quando as células foram incubadas com 5 pM de citocalasina B ou 1 uM durante 24 h colchicina.

As saliências formadas em células cancerosas induzidas EMT dentro de gel de colagénio muito diferiam na aparência de a morfologia das células na cultura de monocamada. Isto implica que a interacção das células com o colagénio no ambiente 3D está envolvida na formação de protrusão. Esta possibilidade foi examinada usando anti-integrina, anticorpos neutros. Como esperado, os anticorpos anti-integrina-α2 e anti-integrina-SS1 bloqueou eficazmente a extensão das protuberâncias (Fig. 7D). Uma combinação dos dois anticorpos inibiu mais fortemente a formação de protrusão que cada anticorpo. Estes resultados demonstram que a formação de saliências à base de microtúbulos requer tanto citocina indutora de EMT e colagénio /sinais de integrina.

Diferenças de outras saliências invasivos.

é bem sabido que as células cancerosas malignas invadem na matriz extracelular 3D, estendendo alguns tipos de protrusão ou projeção. Invadopodium é, uma saliência típico à base de actina produzido por células cancerosas invasoras [18]. MT1-MMP é pensado para ser um marcador de invadopodia e a sua actividade é necessária para a formação invadopodium. Para testar se as saliências observadas nas células cancerosas induzida por EMT dentro do gel de colagénio são idênticos aos invadopodia, examinámos efeito de um amplo espectro de inibidor de MMP (TAPI) na extensão de protuberância. Quando TAPI foi adicionado simultaneamente com a TGF-beta na cultura de colagénio, ou pouco efeito muito fraco na extensão saliência foi obtido nas três linhas celulares testadas (Fig. S5, A-C). No essencial, os mesmos resultados foram obtidos quando o TIMP-2, um inibidor de MMP natural, foi usado em vez de TAPI (dados não mostrados).

Porque a actividade quinase de Src está também associada com a formação invadopodium, que examinaram os efeitos da próxima três tipos de inibidores de Src quinase, analógico PP1, SU6656 e lavendustina C, sobre a formação de protrusão em gel de colagénio 3D. Quaisquer tipos de inibidores não suprimir a formação de células saliência MKN-1 (Fig. S5, D). Estes resultados sugerem que a saliência induzida por EMT é uma estrutura de célula diferente do invadopodium.

Saliências à base de Microtúbulos em Células EMT-induzidas dentro do caracol Collagen Gel

Como se mostra acima, o TGF-ß estimulou as células cancerosas normalmente estender saliências invasivos baseados em microtúbulos na cultura em gel de colagénio 3D. Para generalizar mais este fenómeno, estabelecemos células estavelmente induzidas EMT, introduzindo um vector caracol cDNA expressão em células Panc-1 (Caracol-Panc-l). Tal como as células TGF-ß-estimuladas, caracol-Panc-l células apresentaram morfologia das células dispersas, em comparação com as células de controlo, transfectadas com vector vazio (Mock-Panc-1) (Fig. 8A). De acordo com a alteração morfológica, expressão de E-caderina foi suprimida e expressão de vimentina foi aumentada em células do caracol-Panc-l em comparação com as células de controlo (Fig. 8A). Quando estas células transfectadas foram semeadas em gel de colagénio 3D, caracol-Panc-l, mas não Mock-Panc-1 células estendida, saliências robustos com base em microtúbulos na ausência de TGF-ß (Fig. 8B). A extensão das protuberâncias em células caracol-Panc-l foi fortemente inibida por colchicina, mas dificilmente por citocalasina B (Fig. 8C e D). Estes dados também suportam que a formação de microtúbulos saliência-com base reflecte EMT em gel de colagénio 3D.

Panc-1 foram transfectadas com um vector vazio (Mock-Panc-1) ou um vector de expressão de Snail (caracol-Panc -1), e seus transfectantes estáveis ​​foram estabelecidos. Estas células foram cultivadas sem TGF-ß em cultura em monocamada 2D ou cultura gel de colágeno 3D. (A) Morfologia de Mock-Panc-1 (painel superior) e caracol-Panc-1 (painel inferior), as células foram incubadas durante 2 dias em cultura em monocamada 2D, e expressão de E-caderina, vimentina e caracol nestas células (painéis da direita ). Ver Figura 1 para as condições experimentais. Barra de escala, 50 mm. (B) Morfologia do Mock-Panc-1 (painel superior) e as células incubadas em cultura de gel de colágeno 3D durante 3 dias Caracol-Panc-1 (painel inferior), e sua formação protrusão (figura à direita). Ver Figura 5 para as condições experimentais. Barra de escala, 50 mm. (C e D) Efeitos de 1 uM cholchicine (C) e 5 uM citocalasina B (D), na formação de protrusão em cultura de gel de colagénio 3D. Estes inibidores foram adicionados ao meio de cultura após 24 h de incubação com TGF-ß. Outras condições experimentais são as mesmas descritas nas Figuras 5 e 7B.

Também comparamos os potenciais de crescimento em condições de ancoragem dependentes e independentes entre as células Caracol-Panc-l Mock-Panc-1 e. Não houve diferença significativa na taxa de crescimento entre os dois tipos de células em cultura de monocamada (Fig. 9A). Na cultura de agar mole, tanto o número de colónias total e área total de colónias eram claramente inferior em células Caracol-Panc-l do que Panc Mock-1 células (Fig. 9B e C), mas grandes colônias foram mais abundantes no Caracol-Panc-l células do que as células de controlo (Fig. 9D). A proliferação de células no gel de colagénio foi ligeiramente, mas significativamente inferior nas células do caracol-Panc-l do que as células de controlo (

P

0,05) (Figura 9E).

(A) de monocamada. cultura. Mock-Panc-1 (coluna aberta) e caracol-Panc-1 (coluna fechada) foram semeadas a uma densidade de 1,0 x 10

4 células por cavidade de placas de 24 poços em 10% de FBS contendo meio e incubou-se durante 7 dias. Após a incubação, o número de células foi medida com um contador de células. (B-D) de cultura em agar mole. células caracol-Panc-1-Mock Panc-1 e foram cultivadas em meio de agar mole para 14 dias. Após a incubação, o número de colónias totais (B) e a área total da colónia (C) foram analisadas por Image J. As culturas de agar mole foram fotografadas e cada imagem típica é mostrada em (D). barra de escala, 500 mm. Outras condições experimentais foram as mesmas como descrito na Figura 4. cultura (E) O colagénio. células pseudo-Panc-1 e caracol-Panc-1 foram cultivadas em gel de colagénio 3D durante 7 dias, conforme descrito na Figura 5. Após a incubação, o número relativo de células foi medido utilizando um kit de contagem de células Dojindo 8.

Discussão

neste estudo, foram utilizados modelos de EMT de três linhas de células de carcinoma humano (A549, Panc-1 e MKN-1) caracterizar as células induzidas por EMT em sistemas de cultura 2D e 3D . De acordo com outros estudos [16], [17], as células A549 e Panc-1 apresentaram fenótipos EMT típicos após o tratamento com TGF-ß sozinho em culturas em monocamada 2D. células MKN-1 necessária TGF-ß mais TNF-α em meio isento de soro para a indução de EMT como relatado anteriormente [11], mas apenas o TGF-ß foi necessária em meio contendo soro. Expressão dos dois marcadores invasão γ2 laminina e MT1-MMP foi associada com a indução de EMT uma destas linhas celulares. No entanto, a expressão de MMP-9 e a laminina γ2 era muito maior com TGF-ß mais TNF-α que sozinho TGF-ß [11]. Estes resultados sugerem que a aquisição de fenótipos invasivos de células cancerosas requer TNF-α e /ou outros fatores além TGF-ß, mesmo que sozinho TGF-ß é suficiente para a indução EMT morfológica.

O presente estudo revelou que as células A549 induzida por EMT mais eficazmente aderida à célula estromal substratos de adesão fibronectina e colagénio de tipo I do que as células de controlo não induzidas, embora a adesão celular ao substrato de membrana basal laminina-332 não foi alterado pela indução de EMT. Isto é consistente com o facto de que a expressão de proteínas da matriz extracelular do estroma, tais como a fibronectina e o colagénio do tipo I é aumentada por indução EMT [16]. Nós também confirmaram o aumento da produção de fibronectina nas células EMT-induzida em cultura 2D (dados não mostrados). altamente Espera-se que a alteração induzida por EMT da actividade de adesão celular que depende da expressão de integrina. Além disso, mostrámos que os potenciais de migração de células de as três linhas de células em cultura 2D foram significativamente aumentada pela indução de EMT, de acordo com os resultados para células Panc-1 reportados pelo Horiguchi et al. [17]. Estas alterações fenotípicas, que são consistentes com o conceito geral da EMT, parecem ser necessários para a invasão de células cancerosas através dos tecidos intersticiais do estroma.

O presente estudo revelou grandes diferenças nos fenótipos de células cancerosas induzidas EMT entre 2D e culturas em 3D. Em primeiro lugar, o crescimento de células em resposta a TGF-ß foi completamente diferente entre os dois sistemas de cultura.