Sumário

A sinvastatina e lovastatina são estatinas tradicionalmente usados ​​para baixar os níveis de colesterol sérico. No entanto, não existe evidência indicando suas características com potencial quimioterápico em câncer. Neste estudo, foram utilizados análise bioinformática de dados disponíveis publicamente, a fim de identificar sistematicamente os genes envolvidos na resistência a efeitos citotóxicos destes dois medicamentos no painel linha de células do NCI60. Utilizou-se disponíveis os dados farmacológicos para todas as linhas celulares NCI60 para classificar linhas de células resistentes e sensíveis a simvastatina ou lovastatina, respectivamente. Em seguida, realizamos testes de associação todo o genoma único caso-controle marcador para a lovastatina e células resistentes e sensíveis sinvastatina usando seus dados genômicos Affymetrix 125K SNP publicamente disponíveis. Os resultados foram então avaliadas usando a metodologia de RNAi. Após a correção do

p

valores para testes múltiplos utilizando Falso taxa de detecção, nossos resultados identificaram três genes (

NRP1

,

COL13A1

,

MRPS31

) e seis genes (

EAF2

,

ANK2

,

AKAP7

,

STEAP2

,

LPIN2

,

) associado com resistência a simvastatina e lovastatina, respectivamente. validação funcional usando RNAi confirmou que silenciamento de

EAF2

expressão modulada a resposta do HCT-116 células cancerígenas do cólon para ambas as estatinas. Em resumo, temos utilizado com sucesso os dados publicamente disponíveis sobre as linhas de células NCI60 para realizar estudos de associação todo o genoma para sinvastatina e lovastatina. Nossos resultados indicaram genes envolvidos na resposta celular a estes estatinas e estudos siRNA confirmou o papel da

EAF2

em resposta a essas drogas no HCT-116 células cancerígenas do cólon

Citation:. Savas S , Azorsa DO, Jarjanazi H, Ibrahim-Zada I, Gonzales IM, Arora S, et al. Dados Panel (2011) Linha Cancer Cell NCI60 e RNAi Análise ajudar a identificar EAF2 como modulador da sinvastatina e lovastatina Response no HCT-116 Cells. PLoS ONE 6 (4): e18306. doi: 10.1371 /journal.pone.0018306

editor: Eric Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de julho de 2010; Aceitou: 3 de março de 2011; Publicação: 04 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Savas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo TGen fundos de pesquisa institucional e uma bolsa da Fundação de câncer de próstata (H. Ozcelik). Y.H. Choi é apoiado por uma bolsa da Canadian Breast Cancer Foundation – Ontario capítulo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a sinvastatina e lovastatina são duas estatinas tradicionalmente usados ​​para baixar os níveis de colesterol sérico. As estatinas são inibidores reversíveis da enzima microssómica de HMG-CoA redutase, que converte a HMG-CoA em mevalonato. Este é um passo limitante da velocidade no início da biossíntese do colesterol. Nos seres humanos, a inibição da HMG-CoA redutase estatinas, por diminui a biossíntese de colesterol intracelular, que conduz então a produção transcricionalmente regulada positivamente de receptores de LDL e de reductase de superfície de células microssomal HMG-CoA redutase. No entanto, a sinvastatina e lovastatina diferem em alguns aspectos importantes sobre o grau de metabolismo e o número de metabolitos activos e inactivos [1]. Mais recentemente, as estatinas têm ganhou notoriedade significativa como agentes anti-cancro com base em evidências pré-clínico da sua antiproliferativa, proapoptotic propriedades, anti-invasivas e radiosensíveis [2], [3], [4], [5], [6]. O papel das estatinas no metabolismo do colesterol pode explicar as suas características citotóxicas potenciais.

O colesterol é um lípido chave que se acumula na membrana micro-domínios chamados jangadas lipídicas. jangadas lipídicas desempenhar um papel importante na transdução de sinal que desencadeia o crescimento celular, sobrevivência e muitos outros processos que estão correlacionados com o cancro. a acumulação do colesterol na tumores tem sido demonstrada por uma série de estudos no passado [7], [8], [9], [10]. A acumulação de colesterol dentro da jangada lipídica micro-domínios da membrana de plasma pode desempenhar um papel na estimulação de vias de transdução de sinal. Freeman e Solomon (2004) propuseram que o aumento do colesterol em membranas celulares de tumor da próstata, que pode resultar de um aumento nos níveis de circulação ou de desregulação da síntese endógena, para dar origem a coalescência dos domínios jangada [7]. Este por sua vez pode ter um efeito sobre a segregação de reguladores positivos de sinalização oncogénica dentro jangadas, mantendo reguladores negativos na fracção de membrana de mosaico fluido [7]. Além disso, propõe-se que o estudo da função de jangadas lipídicas em células de cancro da próstata pode fornecer informações sobre o papel do colesterol que circula no crescimento maligno e sobre a relação entre o potencial de dieta e doença agressiva. Portanto, caracterização de proteínas dentro de micro domínios ricos em colesterol pode servir para esclarecer melhor as vias de sinalização, o que levará à identificação de novos biomarcadores para a progressão da doença e novos alvos para a terapia do cancro.

variável resposta ao tratamento medicamentoso , tais como a resistência, é um problema de saúde grave. Vários factores, tais como idade e dieta, estão implicadas na resistência quimioterapêutica ao influenciar a adsorção da droga, transporte, metabolismo, e as suas acções fisiológicas. Os factores genéticos também estão envolvidos na resistência à droga. Por exemplo, as variações genéticas que causam alterações na função e expressão de genes estão implicados na resistência aos medicamentos [11], [12]. Portanto, para uma eficácia de tratamento ideal, precisamos saber os genes associados à resistência aos medicamentos, bem como os seus perfis em cada (medicina personalizada) paciente. A este respeito, o painel de linha celular do NCI60 forma uma ferramenta promissora para descobrir novas drogas contra o câncer. O painel de linha celular NCI60 é estabelecida a partir de uma variedade de tumores, a fim de identificar os compostos que podem matar as células cancerosas [13]. Até agora, este painel de linha celular foi exposto a mais de 100.000 compostos diferentes e as respostas celulares na forma de taxas de crescimento foram medidas. Utilizando linhas de células NCI60, L-asparaginase foi identificado como eficaz na destruição de um subconjunto de carcinomas do ovário [14]. Este painel foi também utilizado no desenvolvimento de bortezomib para o tratamento de mieloma [13].

Os resultados experimentais obtidos nas linhas de células NCI60 são compilados no site do Developmental Therapeutics Program (DTP) [13]. Além dos dados farmacológicos mencionados acima, outros dados para linhas celulares NCI60 está disponível no site do DTP, como os genótipos dos polimorfismos de nucleotídeo único chip Affymetrix 125K (SNPs). Affymetrix 125K SNP plataforma chip tem um conjunto denso de SNPs (~124,000) e é utilizado para identificar as regiões do genoma que são associados com a predisposição da doença e da resposta ao tratamento variável. Anteriormente, foram utilizados os dados da linha celular NCI60 para investigar os genes de resistência a drogas no genoma humano [15], [16], [17]. Neste estudo, nós tiramos proveito de ambos os dados farmacológicos e genômicas disponíveis nas linhas celulares NCI60 para identificar os genes associados à resistência citotóxica para sinvastatina e lovastatina e realizados estudos funcionais usando siRNA para validar

EAF2

como um modulador da atividade estatina.

Materiais e Métodos

lovastatina e sinvastatina linhagens resistentes e sensíveis celular NCI60

Nós temos seguido uma abordagem previamente desenvolvido para executar o caso-controle de todo o genoma estudo de associação [15], [16], [17]. Em resumo, nós utilizamos os dados publicamente disponíveis sobre o painel linha de células NCI60 publicado no site da Developmental Therapeutics Program (DTP) do NCI /NIH (https://dtp.nci.nih.gov/index.html). Em primeiro lugar, que transferiu o GI

50 (a quantidade de dados das drogas requeridas para inibir o crescimento de 50%) com a dose de 10

-4,5 M para as linhas celulares. Em seguida, nós categorizados como as células relativamente resistente ou sensível após a normalização do log

10 de GI

50 para obter uma média zero e desvio padrão de um, como descrito anteriormente [15], [16], [17] . O GI padronizado

50 valores foram então analisados ​​pelo SAS 9.1 (PROC UNIVARIATE) com um teste de distribuição não-paramétrica (densidade de kernel estimativa), com larguras de banda estimados de 0,2476 e 0,2896, bem como média assintótica integrados erros quadrados (Amise) de 0,0224 e 0,0172, para a sinvastatina e lovastatina, respectivamente. Os antimodes visuais foram usadas como um valor de cut-off no -0,2 para -0,3 simvastatina e lovastatina para definir sensíveis (controlos) e (casos) NCI60 células resistentes (Figura 1). No caso da simvastatina, havia 19 sensível e 32 linhas celulares resistentes no painel (Tabela S1). Havia 16 sensível e 41 linhas de células resistentes no painel NCI60 para lovastatina (Tabela S2).

A função de densidade mostrou dois principais modos para cada droga. Os antimodes visuais foram utilizados como valor de corte em -0.2 para -0.3 sinvastatina e lovastatina para definir linhas de células NCI60 sensíveis e resistentes.

Whole Genome-Case-Control Study Association

Nós baixado os dados Affymetrix 125K SNP (que contava com aproximadamente 124.000 SNPs espaçadas com uma distância intermarker mediana de 8,5 kilobases) do site da DTP (https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html) [ ,,,0],18]. testes de associação de genoma completo único caso-controle marcador para a lovastatina e células resistentes sinvastatina e sensíveis foi realizada pelo software Plink [19] utilizando o teste do qui-quadrado padrão. Apenas os SNPs que foram genotipados em, pelo menos, 75% das células e tinham uma frequência do alelo menor mínimo de 2% (n = 79622) foram incluídos neste estudo e foram utilizadas para o teste de associação. A fim de diminuir a chance de associações falso-positivo, uma correção para o teste múltiplo,

i

. Falso Descoberta Rate (FDR) proposto por Benjamini e Hochberg (FDR_BH) [20] Também foi realizada pelo software Plink. Resultados com

p

valores. 0,05 foram considerados significativos

As informações relativas aos locais genómicos (gênica

contra

intergênico) de SNPs ou foram recuperados do banco de dados dbSNP [21 ] ou por explodir as sequências SNP-flanqueando contra o genoma humano e através da visualização utilizando a opção NCBI Map Viewer [22].

Epistasia (SNP-SNP Interaction) Análise

modelos de regressão logística foram usado para analisar as interações bidirecionais entre os SNPs associados individualmente com sinvastatina ou lovastatina resistência, assumindo um modelo aditivo para cada SNP. Para testar interações SNP-SNP, foi utilizada a abordagem de teste da razão de verossimilhança, comparando o ajuste de dois modelos, um com apenas os efeitos principais SNP e outro com os efeitos principais e efeito da interação de duas vias. O P-valores correspondentes foram ajustados para testes múltiplos pelo método FDR_BH [20].

Cultura de Células

As linhas de células humanas de câncer de cólon HCT-116 e HT-29 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). HCT-116 é uma linha celular de carcinoma colo-rectal tumorigénico estabelecida a partir de um tumor primário [23]. HT-29 é uma linha celular de adenocarcinoma do cólon de grau II estabelecida a partir de células de tumor primário [24]. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 UI /ml de penicilina G, e 100 ug /ml de estreptomicina. Todos os reagentes foram obtidos a partir de meios de comunicação Invitrogen (Carlsbad, CA). As linhas celulares foram rotineiramente mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera.

Validação funcional de lovastatina e simvastatina sensibilização

para ARNsi e estudos de droga, as células foram transfectadas com ARNsi por transfecção inversa em placas de 384 poços, como anteriormente descrito [25]. Resumidamente, siARN foi impresso em placas de 384 poços em volume de 2 mL. Diluído reagente siLentFect (BioRad, Hercules, CA) em OptiMEM (Invitrogen) foi adicionado aos poços e deixou-se com complexo de siARN durante 30 min à temperatura ambiente. HCT-116 ou células HT-29 foram ressuspensas em meio de crescimento sem antibiótico e adicionadas a placas para uma concentração final de 1000 células /poço. As placas foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2. Depois de 24 horas, variando as concentrações que variam de 12 nM a 667