Abstract

NRP-2 é um receptor de alta afinidade quinase deficiente para ligantes pertencentes à classe 3 semaforina e famílias de factores de crescimento endotelial vascular. NRP-2 foi detectada na superfície de vários tipos de células cancerosas humanas, mas a sua expressão e função de células gastrointestinais (GI) de cancro continua a ser determinado. Procurou-se determinar a função de NRP-2 na mediação de sinais a jusante que regulam o crescimento e sobrevivência das células cancerosas gastrointestinais humanos. Em amostras de cancro gástrico humano, NRP-2 foi detectada em tecidos de tumor, mas não em mucosa normal adjacente. Em células CNDT 2,5, shRNA mediada knockdown expressão NRP-2 conduziu a uma diminuição da migração e invasão in vitro (p 0,01). Análise do gene-matriz focado demonstrado que a perda de NRP-2 reduziu a expressão de um gene metástase mediador crítico, S100A4. níveis e função de β-catenina, um regulador conhecido da S100A4 em estado estacionário, foram também diminuiu nos shNRP-2 clones. células CNDT 2,5 Além disso, knockdown de NRP-2 sensibilizados

in vitro

à toxicidade de 5-FU. Este efeito foi associado com a activação de caspases 3 e 7, a clivagem de PARP, e regulação negativa de Bcl-2.

In vivo

crescimento de 2,5 CNDT células no fígado de ratinhos nus foi significativamente diminuída no grupo shNRP-2 (P 0,05). A administração intraperitoneal de NRP-2-siRNA de DOPC diminuiu o peso do tumor em ratos (p = 0,01). Coletivamente, nossos resultados demonstram que derivada de células de tumor NRP-2 medeia sobrevivência crítica sinalização em células de câncer gastrointestinal

Citation:. Samuel S, Gaur P, Fan F, Xia L, cinza MJ, Dallas NA, et al . (2011) Neuropilin-2 mediada β-catenina Sinalização e Sobrevivência em linhas celulares de cancro gastrointestinal humano. PLoS ONE 6 (10): e23208. doi: 10.1371 /journal.pone.0023208

editor: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 31 de março de 2011; Aceito: 12 de julho de 2011; Publicado: 20 de Outubro 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Samuel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. RE ” Bob “Fundo Smith para Pesquisa do Câncer (SS); National Institutes of Health subvenção 5 T32 CA09599 (ND, PG, e DB); o Centro de interferência de RNA e RNA não-codificante (GL-B, AS), e um projeto de Grant Programa de Desenvolvimento formar o fundo de pesquisa do cancro do ovário (GL-B, AS); O William C. Liedtke, Jr., Presidente de Pesquisa do Câncer (LE); National Institutes of Health subvenção R01 CA112390 (LE). Esses financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Genentech, Inc. pagou salário e infraestrutura de pesquisa para os seus empregados GP e AB, mas não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, ou preparação do manuscrito. Genentech, Inc. aprovou a publicação do manuscrito

Conflito de interesses:. LE é um consultor para Genentech, Inc., que forneceu os anticorpos NRP-2, e Roche. GP e AB foram pagos funcionários da Genentech, no momento do estudo. Um pedido de patente foi apresentado relativo aos anticorpos anti-NRP da Genentech que foram utilizados neste manuscrito. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Neuropilin-2 (NRP-2) é uma glicoproteína transmembranar que foi originalmente descrita como um receptor para os mediadores axon orientação, as semaforinas [1]. Subsequentemente, verificou-se ser expressa por células endoteliais venosas e linfático e identificado como um co-receptor para os membros da família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [2], sugerindo um papel na angiogénese e linf angiogénese [3]. NRP-2 expressão tem sido relatada em células tumorais no câncer de pulmão [4], [5], neuroblastoma [6], câncer pancreático [7], osteossarcoma [8], e cancro da bexiga [9]. No entanto, a função da NRP-2 na membrana da célula tumoral em cancros humanos, incluindo os do tracto gastrointestinal (GI) e neuroendócrino origem gástrica, permanece largamente indefinida. Anteriormente, mostrámos que NRP-2 é expresso em células do cólon e cancro do pâncreas e que a sua expressão está envolvido na promoção do crescimento do tumor [10], [11]. O propósito do presente estudo foi o de determinar a função de NRP-2 na mediação de sinais a jusante que regulam o crescimento e sobrevivência de células de cancro gastrointestinal humano. Descobrimos que NRP-2 foi sobre-expresso em amostras de cancro gástrico humano e em células gástricas e carcinóides in vitro. Nós elucidou o papel da NRP-2 nas linhas de células com a expressão mais elevada de NRP-2. Nós descobrimos que a perda de NRP-2 reduziu os níveis de estado estacionário e função de β-catenina nestas células. NRP-2 knockdown levou a uma diminuição na expressão de S100A4 e diminuição da migração e invasão das células in vitro. Além disso, knockdown de NRP-2 sensibilizados CNDT 2,5 células in vitro para a toxicidade de 5-FU. Estes resultados indicam que NRP-2 medeia as funções críticas oncogénicas em células cancerosas gastrointestinais e que a inibição da sua expressão e actividade poderia ser explorada para benefício terapêutico em pacientes com doença metastática.

Resultados

Expressão de NRP-2 em linhas de tecido de câncer e células gástricas humanas

o primeiro avaliou a expressão da proteína NRP-2 em tecidos embebidos em parafina de cancro gástrico humano e mucosa normal adjacente por coloração com imunoperoxidase. Em amostras de cancro gástrico representativos, proteína de NRP-2 foi expressa no epitélio cancro gástrico, mas não no epitélio da mucosa normal (Figura 1A). NRP-2 da proteína (~130 kD) foi expressa heterogeneamente entre cinco das seis linhas celulares de cancro gastrointestinais analisados ​​por transferência de Western: AGS, CNDT 2,5, MKN74, NCI-N87 e KKLS (Figura 1B). CNDT2.5 (a linhagem humana carcinóide celular [12], [13]) e NCI-N87 expressa os mais altos níveis de NRP-2 e, portanto, foram utilizados para estudos knockdown subsequentes. Como um controlo, a pré-incubação do anticorpo NRP-2 com o péptido imunizante confirmou a especificidade do anticorpo.

(A) coloração imuno-histoquímica para a NRP-2 de expressão em secções de tecido representativos (20x) da mucosa gástrica humana normal e espécimes de câncer gástrico (B) análise de imunotransferência de NRP-2 expressão em seis linhas celulares de cancro GI humano. Vinculin serviu como um controlo de carga interno. (C) Geração de linhas celulares estáveis ​​CNDT 2,5 com NRP-2 knockdown. A análise de imunotransferência de NRP-1 e -2 expressão em células CNDT 2,5 transfectadas com shcntr ou shNRP-2 plasmídeos (shNRP-2 clones; C6 e C10). Vinculina serviu como um controlo de carga. (D) os resultados do ensaio MTT. As taxas de crescimento não foram diferentes entre as células de controle e NRP-2 clones knockdown. As barras indicam o SEM. (E) superior: número de células que migraram em um ensaio de câmara de Boyden média. Resumindo: Imagens representativas (10x) de ensaios de migração. (F) superior: número de células que invadiram no ensaio de câmara de invasão BioCoat Matrigel média. Bottom: Imagens representativas (10x) de ensaios de invasão

Efeito do NRP-2 expressão na proliferação celular in vitro

Para entender a função de NRP-2 no cancro gastrointestinal, nós. primeiro, examinou os efeitos de silenciamento NRP-2 sobre o crescimento das células CNDT 2,5 in vitro. Nós escolhemos estas células porque expressam elevados níveis endógenos de NRP-2. células CDNT 2,5 foram transfectadas de forma estável com um shRNA controle (shcntr) ou shNRP-2 (-2 shNRP) plasmídeo, e dois shNRP-2 clones transfectados com uma diminuição marcada na expressão de proteína de NRP-2 (C6 e C10, Figura 1C) foram selecionado. shNRP-2 transfecção não afectou a expressão de NRP-1 nestas células, verificar a especificidade da NRP-2 shRNA. Em seguida, utilizado um ensaio de MTT para determinar o efeito do knockdown de NRP-2 sobre as taxas de crescimento das células in vitro. Clones estavelmente transfectadas com shNRP-2 não mostrou alteração na taxa de proliferação em relação à de células transfectadas-shcntr (Figura 1D).

Efeito do NRP-2 expressão em migração e invasão

O efeito de NRP-2 ARNi na motilidade de 2,5 CNDT células foi examinada utilizando ensaios de câmara de Boyden. O número de células que migraram para a câmara do fundo foi significativamente menor no shNRP-2 células transfectadas (37 ± 5 por campo) do que em células shcntr transfectadas (140 ± 12 por campo) (p 0,001; Figura 1E, em cima). Por outro lado, quando as células com baixa expressão endógena de NRP-2 (KKLS) foram transientemente transfectadas com um ADNc de expressão NRP-2 construir de modo a sobre-expressar a proteína, a migração celular foi significativamente aumentada (dados não mostrados).

invasão de células foi avaliada utilizando o ensaio de câmara de Boyden modificada com membranas revestidas com Matrigel. NRP-2 ARNi inibiu significativamente a invasão de células CNDT 2,5 (64,4%; p 0,001; Figura 1F, em cima). No entanto, porque a invasão de células neste ensaio é também uma função do potencial de migração das células, é difícil para provocar as contribuições individuais. Como tal, uma vez que as diferenças entre os dois grupos é semelhante em ambos os ensaios, não podemos descartar a noção de que o número reduzido de células invasoras podem apenas refletem diminuição da migração de clones shNRP2.

Efeito da NRP- 2 knockdown na expressão de genes metastáticos conhecidos

Desde a invasão e migração estão associados com o fenótipo metastático, foi realizada uma análise de conjunto de genes utilizando um microarray metástase de tumor humano focado que representa 113 genes conhecidos por serem envolvidos na metástase. Supressão de NRP-2 causou uma redução no nível de vários genes metastáticas (Figura 2A) expressão. Muitos dos genes regulados negativamente que respondiam a NRP-2 knockdown são conhecidos por estarem associados com a degradação da matriz extracelular e são altamente expresso durante a metástase. Mais notavelmente, foi observado que downregulating NRP-2 causou uma redução significativa ( 95%) na expressão de S100A4 (Figura 2A). Porque S100A4 foi altamente sensível às NRP-2 knockdown, enfocamos este gene para estudos posteriores. A análise Western blot confirmou que a expressão da proteína S100A4 foi significativamente reduzida após NRP-2 knockdown (Figura 2B).

(

Um

) imagem autorradiográfica da membrana matriz que mostra a expressão diferencial de genes metastáticas em shcntr (

esquerdo

) e shNRP-2 (

direito

) células. pontos circulados indicar a posição do gene S100A4. (B) Validação do nível de expressão da proteína em células S100A4 por análise de imunotransferência. Actina serviu como um controlo de carga. (C) Redução do nível de estado estacionário de β-catenina pelo NRP-2 knockdown. expressão β-catenina em células shcntr e shNRP-2 foi determinado por imunotransferência. Vinculina serviu como um controlo de carga. (D) Verificação de reduzida expressão β-catenina em shNRP-2 células por imunofluorescência. shcntr e shNRP-2 CNDT 2,5 células que crescem em lâminas de câmaras foram fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-β-catenina (vermelho). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). (E) Validação de redução β-catenina em uma segunda linha celular de cancro gástrico knockdown NRP-2. NCI-N87 células cancerosas gástricas foram infectadas com lentivírus contendo shcntr ou shNRP-2 construções. A análise de imunotransferência mostrou redução na expressão de β-catenina em NCI-N87 NRP-2 células knockdown. Actina serviu como um controlo de carga. (F) nível β-catenina no citoplasmático (Cyto) e (Nuc) fracções nucleares de células e shcntr shNRP-2. HSP90 (citoplasmática) e LaminB (nuclear) serviram como controle de fracionamento.

Efeito do NRP-2 knockdown na expressão e localização de β-catenina

Porque S100A4 é um alvo transcricional directo de β-catenina, examinámos a expressão de β-catenina em células de knockdown NRP-2. a expressão da proteína β-catenina total foi significativamente inferior nas células CNDT 2,5 shNRP-2 do que nas células shcntr (Figura 2C). Para posterior confirmação, shcntr e shNRP-2 clones foram fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-β-catenina (fluorescência vermelha). Consistente com os dados de Western blot, os níveis totais de β-catenina foram significativamente reduzidos nas células NRP-2 knockdown (Figura 2D). Para mais de validação em uma segunda linha de células de câncer gástrico, NRP-2 foi derrubado em células NCI-N87, que expressam um alto nível endógeno do NRP-2, por estável shNRP-2 incorporação mediada por lentivírus. Após a verificação da NRP-2 knockdown (Figura 2E, painel do meio) nestas células, o nível de β-catenina foi avaliada por Western blotting. O nível total β-catenina foi significativamente reduzida nestas células NRP-2 knockdown (Figura 2E, painel superior).

Para determinar se a expressão β-catenina NRP-2 mediada por ligando era dependente ou independente do ligando, β-catenina estado foi avaliado por análise de western blot em CNDT 2,5 células após o tratamento com anticorpos bloqueadores de NRP-2 (anti-NRP-2

B, cuja ligação blocos de VEGF-C, e pan-anti-PRN, que bloqueia Sema de ligação para ambos os blocos de NRP-1 NRP-2 e também a ligação de FCEV e através de impedimento espacial); anticorpo anti-NRP1 serviu como um controlo (todos da Genentech, San Francisco, CA). Em comparação com o controlo, não houve diferença na expressão de β-catenina em células tratadas com os anticorpos de bloqueio, sugerindo que a sinalização de NRP-2 mediada por estas células é independente de ligando (dados não mostrados).

β-catenina é conhecido por exercer a sua função de translocação desde o citoplasma para o núcleo, onde se liga a factores de transcrição tais como o factor de células T (TCF) /factor de ligação potenciador linfóide e assim estimula a transcrição de genes alvo. Por conseguinte, analisada a abundância relativa da proteína β-catenina no citosólica e compartimentos nucleares em shNRP-2 e células shcntr CNDT2.5 depois de fraccionamento celular. Tal como mostrado na Figura 2F, NRP-2 knockdown levou a uma redução significativa do nível de estado estacionário da proteína β-catenina tanto na citosólica e fracções nucleares das células.

Efeito de NRP-2 knockdown em função de β-catenina

Para determinar se NRP-2 knockdown também afectou a actividade de sinalização de β-catenina, que as células transfectadas CNDT 2,5 shcntr e shNRP-2 com o plasmídeo repórter TOPflash TCF ou o plasmídeo de controlo FOPflash. TOPflash contém um repórter de luciferase sob o controlo de três cópias do elemento de ligação de tipo selvagem TCF-a montante do promotor mínimo da timidina-cinase e é especificamente regulada por sinalização β-catenina. Em FOPflash, o elemento de ligação TCF é mutado. O ensaio de luciferase repórter demonstraram que a actividade diminuiu 2 vezes nas células shNRP-2 em comparação com a actividade nas células shcntr (Figura 3A).

(a) Avaliação da actividade repórter TCF utilizando o β-catenin- TOPflash responsiva ou repórteres FOPflash mutantes. actividades de luciferase foram medidas após a transfecção transiente dos plasmídeos repórter em shcntr e shNRP-2 CNDT 2,5 células (B) Aumento da degradação mediada por proteassoma de β-catenina em células shNRP-2. shcntr e shNRP-2 CNDT 2,5 as células foram tratadas com 30? M MG132 ou um volume igual de DMSO (um solvente para MG132) durante 2 horas. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransf erência utilizando o anticorpo anti-β-catenina ( ‘φ’, sem tratamento; ‘Ub’, ubiquitinada β-catenina). (C) Análise de imunotransferência que mostra a restauração de nível β-catenina nas fracções citoplasmática e nuclear após o tratamento com 30 uM MG132 durante 2 horas. (D) Diminuição dos níveis de GSK3β fosforilada em células knockdown NRP-2. A análise de imunotransferência de GSK3β fosforilada (em Ser-9) e GSK3β. (E) Restauração de nível de β-catenina depois de bloquear a atividade GSK3β em células knockdown NRP-2. shcntr ou shNRP-2 CNDT 2,5 knockdown células foram tratadas com concentrações crescentes de LiCl durante 24 horas e colhidas para análise de imunotransferência para detectar β-catenina.

Efeito de NRP-2 knockdown na estabilidade de β- catenin

Os níveis de proteína β-catenina intracelulares são mantidos por um multiprotein “complexo de destruição” que contém APC, Axin e GSK3β. Em um complexo ativo, GSK3β fosforila β-catenina, etiquetando-lo para o reconhecimento por β-TRCP, polyubiquitinylation e subsequente degradação pelo complexo de proteassoma. Foi realizada inibidores de estudos para avaliar a estabilidade de β-catenina em células de knockdown NRP-2. O tratamento com MG132, um inibidor de proteassoma, levou a restauração do nível de proteína total de β-catenina em células de knockdown NRP-2 para o nível nas células shcntr (Figura 3B). Além disso, o tratamento com MG132 também restaurado o nível de proteína total β-catenina tanto na citosólica e compartimentos nucleares nas células NRP-2 knockdown (Figura 3C).

modificações pós-tradução são conhecidos por desempenhar um papel crítico na regulação do volume de negócios β-catenina, e β-catenina é sequencialmente fosforilada por GSK3β. Para investigar se a activação GSK3β estava envolvido na downregulation de β-catenina, examinou-se o estado de fosforilação de GSK3β por utilização de um anticorpo contra a forma fosforilada Ser-9 de GSK3β. Ser-9 fosforilação tem sido relatado para processar GSK3β inactivo. Tal como mostrado na Figura 3D, Ser-9 fosforilação de GSK3β foi significativamente diminuída nas células shNRP-2, indicando que existem nessas células foram aumentados os níveis de proteína GSK3β activo, que promove a degradação β-catenina. Para confirmar ainda mais o envolvimento de activação GSK3β na regulação da β-catenina, o efeito do cloreto de lítio (LiCl)

, um inibidor conhecido da actividade GSK3β, foi analisado. LiCl tem sido relatado para induzir a inibitória Ser-9 fosforilação de GSK3β não tendo qualquer efeito sobre outras cinases de proteína. Como se mostra na Figura 3E, o tratamento com LiCl proteína estabilizada β-catenina em células shNRP-2 de um modo dependente da dose.

Efeito de NRP-2 knockdown na quimiossensibilidade de células cancerosas gastrointestinais in vitro

Dado o papel conhecido de β-catenina na mediação da sobrevivência da célula, a hipótese de que um nível reduzido β-catenina em células de knockdown NRP-2 se traduziria em quimiossensibilidade aumentada destas células. Para testar esta hipótese, foram realizadas primeiro um ensaio de quimiossensibilidade in vitro com 5-fluorouracilo (5-FU), que é utilizado como terapia padrão para cancros gastrointestinais. Consistente com nossa hipótese, por meio de coloração de anexina V, CNDT 2,5 shNRP-2 células tratadas com uma dose clinicamente relevante de 5-FU demonstrou uma percentagem significativamente mais elevada de células apoptóticas do que células shcntr (25,5% vs 12,5%, respectivamente; p 0,05;. a Figura 4A)

(a) ensaio de anexina V em shcntr e 2,5 células shNRP-2 CNDT após o tratamento sem ou com 5-FU durante 48 horas. (B) Análise de Western blot de marcadores apoptóticos em extratos de células de shcntr e shNRP-2 CNDT 2,5 células tratadas sem ou com 5-FU. Vinculina actina e serviram como controlos de carga.

Para confirmar o mecanismo da morte celular induzida por 5-FU, comparou-se a activação de mediadores apoptóticos no CNDT 2,5 shcntr e células shNRP-2 tratados com 5FU. A activação da caspase-3 e -7, as caspases efectoras da cascata apoptótica, e a clivagem do substrato de caspase PARP, que exerce uma actividade pró-apoptótica, foram avaliadas por imunotransferência, utilizando anticorpos que reconhecem especificamente os seus produtos clivados. Consistente com o aumento da apoptose nas células NRP-2 knockdown tratados com 5-FU, observou-se um aumento acentuado nos níveis de caspase-3 e -7 activa nestas células, mas não nas células shcntr (Figura 4B). Além disso, observou-se a clivagem de PARP em células shNRP-2 tratados com 5-FU, mas não em células tratadas com 5-FU shcntr (Figura 4B). Além disso, observou-se expressão significativa de proteína anti-apoptótico Bcl-2 nas células shcntr CNDT 2,5; Bcl2 expressão estava ausente nas células shNRP-2.

Efeito de NRP-2 knockdown sobre o crescimento in vivo de células cancerosas gastrointestinais

Para examinar o efeito do knockdown de NRP-2 sobre o crescimento de células de cancro gastrointestinal in vivo, injectou CNDT 2,5 shcntr ou shNRP-2 clones no fígado (um sítio comum de metástases do cancro gastrointestinal) de ratinhos (10 animais por grupo) e incidência de tumor avaliada e o volume do tumor. Todos os ratinhos foram de aproximadamente o mesmo peso quando sacrificados. a incidência tumoral foi significativamente inferior nos murganhos injectados com shNRP-2 clones do que em ratinhos injectados com células shcntr (30% para shNRP-2 -C 6 e 10% para shNRP-2 C10 vs. 80% para shcntr; p 0,05, Fishers Teste exato, Figura 5A). Além disso, os tumores produzidos por CNDT 2,5 células shNRP-2 foram significativamente menores (volume do tumor do fígado de 38 ± 24 milímetros

3 e de 14 ± 10 mm média

3 para os dois clones, respectivamente) do que os tumores produzidos por controle células (volume do tumor do fígado de 1.797 ± 880 milímetros média

3; p 0,05; Figura 5B). Os dados representados graficamente inclui todos os 10 ratinhos em cada grupo, incluindo aqueles que não desenvolveram quaisquer tumores (isto é, 10/07 e 10/09, respectivamente, nos dois grupos shNRP2 Vs 2/10 no grupo de controlo). Imagem representativa do fígado inteiro com o tumor de cada grupo é mostrada no painel inferior. O knockdown de NRP2 nos tumores foi confirmada por análise de imunotransf erência de NRP-2 em tecidos de tumor de fígado de ratos injectados com 2,5 CNDT shcntr ou 2-shNRP células C6 (Figura 5C).

(A) diminuiu a incidência tumoral e volume médio do tumor após NRP-2 knockdown. incidência de tumores (10 ratos) após a injeção de fígado com CNDT 2,5 células shcntr ou uma das duas shNRP-2 clones. (B) superior: os volumes dos tumores hepáticos finais em camundongos injetados com shcntr e shNRP-2 clones. Resumindo: Imagens representativas de tumores. (C) Análise de imunotransferência de NRP-2 em tumores de murganhos injectados com 2,5 CNDT shcntr ou 2-shNRP células C6 [ ‘T1’; Tumor # 1; ‘T2’; Tumor # 2]. β-Actina serviu como um controlo de carga.

Efeito de direccionamento in vivo de NRP-2 sobre o crescimento de células cancerosas gastrointestinais

Em seguida, examinou-se o efeito da administração in vivo de NRP-2 alvo ARNsi utilizando 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (NRP-2-siRNA DOPC) nanoliposomes neutras [10], [14] sobre o crescimento de xenoenxertos de cancro gastrointestinal em ratos. As células foram cultivadas 2,5 CNDT como s.c. xenotransplantes e NRP-2 tratamento siRNA-DOPC foi iniciado no dia 7 em camundongos com tumores visíveis (15 ± 1,5 milímetros

3). O tratamento consistiu em duas vezes injecção intraperitoneal semanal com 5 ug cntr siRNA-DOPC ou NRP-2 siRNA-DOPC. O volume médio dos tumores em ratinhos tratados com NRP-2-siRNA DOPC foi menor do que para os ratos tratados com Cntr sequências de siRNA-DOPC (264,4 ± 19,4 milímetros

3 vs. 751,3 ± 150,6 milímetros

3, respectivamente; p = 0,01; Figura 6A). Além disso, os ratinhos tratados com NRP-2 siRNA-DOPC exibiram uma redução significativa da massa tumoral em comparação com a massa do tumor em ratos tratados com Cntr sequências de siRNA-DOPC (160 ± 18 mg vs 459 ± 102 mg, respectivamente; p 0,05; Figura 6B). a coloração imuno-histoquímica de tecidos tumorais confirmaram que NRP-2 foi reduzida nos tumores de ratos tratados com sequências de NRP-2-siRNA DOPC em comparação com os tumores de ratos tratados com Cntr sequências de siRNA-DOPC (Figura 6c).

volumes (A) do tumor após a administração de sicntr e siNRP-2 lipossomas. Os ratinhos nus (7 por grupo) foram s.c. injetados com 1 × 10 2,5 células

6 CNDT. Os ratinhos com tumores visíveis foram estratificados e tratou-se com 5 ug de conjugado de siRNA-lipossoma (injecções i.p.) duas vezes por semana. NRP-2-siRNA DOPC-tratamento conduziu a uma redução significativa no crescimento do tumor em comparação com center c siARN DOPC-tratamento (264,4 mm

3 vs. 751,3 mm

3, respectivamente; *

P =

0,01). (B) Topo: No final da experiência, s.c Os tumores foram excisados ​​e pesados. O peso do tumor foi significativamente menor no NRP-2-siRNA-DOPC ratinhos tratados (média, 160 mg) em comparação com Cntr ratos tratados com DOPC siRNA (média, 459 mg; *

p

= 0,01). Resumindo: Imagens representativas de tumores (C) Análise de imunotransferência de NRP-2 em tumores de camundongos tratados com cntr-siRNA DOPC ou NRP-2-siRNA DOPC

Discussão

Neuropilin. -2 (NRP-2) é tradicionalmente conhecido funcionar como um co-receptor para a classe 3 nonsignaling semaforinas e os membros da família VEGF [1], [2]. Embora a expressão de NRP-2 foi originalmente pensado para ser limitada aos neurónios, estudos têm mostrado que NRP-2 é expressa em VSMC, células endoteliais e células tumorais. NRP-2 é relatado para interagir com VEGFR2 e VEGFR3 e aumentar a sobrevivência e a migração de células endoteliais vasculares e linfáticas [15]. Recentes estudos funcionais por Caunt e colegas demonstraram que o bloqueio da NRP-2 num modelo de metástases do pulmão pré impedido metástase de tumor, bloqueando a formação de vasos linfáticos associados ao tumor [16].

A expressão de NRP-2 tem sido detectado em células tumorais de amostras de pacientes de diversos tipos de tumores, incluindo o glioblastoma, neuroblastoma e melanoma. O nosso laboratório e outros mostraram que o derivado de células de tumor de NRP-2 desempenha um papel no crescimento do tumor [10], [11]. Buscou-se melhor elucidar o papel funcional dos mecanismos de sinalização que medeiam a função de NRP-2 em células de cancro gastrointestinal, incluindo células carcinóides gástricos e NRP-2 e. Demonstramos neste estudo que NRP-2 é altamente expressa por células tumorais em tecidos do carcinoma gástrico e por linhas de células de cancro gastrointestinal, mas que não é detectável por imuno-histoquímica em mucosa gástrica normal. Os mecanismos pelos quais os níveis de NRP-2 são regulados positivamente em cancros gastrointestinais permanecem obscuros. Curiosamente, Tsukamoto e colegas [17] verificou que 40% dos doentes com cancro gástrico analisados ​​tiveram um ganho em 2q33 (a região em que o gene NRP-2 está localizado) por análise de matriz comparativa hibridação genómica (CGH), sugerindo número de cópias aberração ( CNA) desta região.

Utilizamos uma abordagem interferência de RNA shRNA mediada para suprimir a expressão NRP-2 em células cancerosas gástricas para investigar as alterações fenotípicas resultantes, incluindo proliferativa, migratório, e atividades invasivas. Knockdown de NRP-2 não afectou a proliferação das células in vitro CNDT 2,5; No entanto, a perda de NRP-2 reduziu o crescimento de xenoenxertos tumorais

in vivo

. A discrepância entre

in vitro

e

in vivo

inibição do crescimento pode ser devido a respostas NRP-2-mediadas de células do microambiente do tumor no local do tumor

in vivo

que não são apreciáveis ​​em um

in vitro

sistema.

In vitro

estudos demonstraram também que havia uma marcada inibição de tanto a migração e invasão das células. Usando genes associados a metástase em uma análise de cDNA microarray, identificamos S100A4, um gene chave metástase mediador, para ser significativamente regulada negativamente após NRP-2 silenciamento. S100A4 tenha sido previamente ligado a metástase em diversos sistemas experimentais [18], [19]. Estudos recentes têm mostrado que S100A4 também pode contribuir para a progressão do cancro, melhorando as funções de sobrevivência celular. Mahon e colaboradores [20] demonstraram que S100A4 knockdown sensibiliza as células cancerígenas pancreáticas para o tratamento de gemcitabina, para além da activação das caspases e PARP, resultando num aumento da apoptose e paragem do ciclo celular. Observou-se que a regulação negativa da NRP-2 em células de cancro gástrico chemosensitized as células para o tratamento 5-FU. Mais estudos são necessários para determinar se NRP-2 medeia funções prosurvival em células cancerosas gástricas via S100A4.

Uma análise mais aprofundada da regulamentação S100A4 NRP-2 mediada demonstraram que os níveis de estado estacionário e função de β-catenina, um regulador da transcrição directa de S100A4, foram comprometidos nas células knockdown NRP-2. Um grande corpo de dados suporta a contribuição da activação da via de sinalização β-catenina no desenvolvimento e progressão de cancros. A activação da sinalização de Wnt /β-catenina é encontrada em cerca de 30% dos cancros gástricos [21]. Em um estudo recente, Wang e seus colegas [22] propuseram a estabilização β-catenina como um modo de ação para a função oncogénica CTDM mediada em câncer pancreático. Usando um modelo de rato transgénico, Oshima e colegas [23] mostraram que a cooperação da sinalização Wnt e a prostaglandina E

2 (PGE

2) via faz com que o desenvolvimento de câncer gástrico. A β-catenina activação da via sustentada observada nas células NCI-N87 deve ser independente de mutações nos genes da APC e β-catenina, pois esta linha de células não abriga quaisquer mutações inerentes em qualquer um destes genes. O mecanismo pelo qual NRP-2 silenciamento afecta esta via permanece obscuro.

Uma limitação potencial do nosso estudo é que nós analisamos o crescimento do NRP-2 knockdown células cancerosas gástricas como tumores primários, mas não avaliou a metástase de tumores. Dada a nossa observação de que essas células têm diminuído migração e invasão após NRP-2 knockdown, o

in vivo

potencial metastático destas células necessidades ser explorado no futuro. Estudos adicionais também são necessários para melhor elucidar o mecanismo potencial subjacente a atenuação da via β-catenina pelo NRP-2 silenciamento. Esta continua a ser um grande problema por resolver e é objecto de uma investigação em curso em nosso laboratório.

NRP-2 está a emergir como um novo alvo terapêutico. Dado o papel de NRP-2 na migração celular e invasão do tumor, a segmentação de NRP-2 oferece uma potencial abordagem nova para inibir o crescimento e a sobrevivência de células de cancro em pacientes com doença metastática. Além disso, porque NRP-2 parece ter papéis distintos do da família VEGF de receptores, a segmentação de NRP-2 é improvável que tenha o mesmo resultado que a segmentação de VEGF. Verificou-se que o tratamento de células cancerosas gastrointestinais com bevacizumab não tem qualquer efeito na expressão β-catenina (dados não mostrados). Segmentação NRP-2 pode, portanto, complementam e ampliam os efeitos antitumorais de terapias que visem VEGF, tais como bevacizumab.

Descobrimos que a expressão β-catenina NRP-2 mediada observada neste estudo é ligando independente. Esta sinalização independente do ligando NRP2 é novo no entanto; o mecanismo (s) de mediar este fenómeno continua a ser entendido. No presente momento, só podemos especular sobre o mecanismo (s) em causa, com base em as documentadas para outros receptores de membrana. (I) É concebível que, em células tumorais expressão aumentada de NRP2 sobre os resultados da superfície celular na activação independente do ligando de sinalização NRP2 mediadas através da ligação a VEGFR /plexina NRP2 espontânea. (Ii) Em alternativa, a sinalização NRP2 independente do ligando também pode ser activado através de homo-dimerização (ou heterodimerização com NRP1) como no caso de muitos outros receptores de membrana. PNR são conhecidos para formar homo- ou hetero-multímeros, mesmo na ausência do ligando através do domínio C-proximal de membrana. (Iii) Uma terceira possibilidade invoca a ativação via crosstalk via com outros receptores de membrana, mas isso levanta a questão de como os receptores postulados são ativados. Em todos os casos, as proteínas que se associam com NRP2, incluindo neuropilina interagindo proteína (NIP) /synectin, é provável que sejam fundamental para a sinalização independente do ligando.