Abstract

Fundo

Nós investigamos como tamanho corporal e atividade física influenciar o risco de o CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) no cancro colorectal (CRC).

Métodos

no Cohort Study Países Baixos (n = 120.852), fatores de risco foram auto-relatados em linha de base em 1986. Após 7,3 anos de acompanhamento, 603 casos e 4.631 membros da sub-coorte estavam disponíveis. CIMP estado de acordo com os marcadores Weisenberger foi determinada utilizando PCR específica de metilação no DNA a partir de tecido de tumor embebido em parafina. rácios de taxa de risco (HR) e intervalos de confiança de 95% para CIMP (27,7%) e não-CIMP (72,3%) tumores foram calculados de acordo com o IMC, IMC aos 20 anos, a mudança IMC, calças /tamanho da saia, altura e atividade física .

resultados

IMC modelada por 5 kg /m

2 aumento foi associado com ambos os tumores não-CIMP CIMP e, no entanto, o HRS foram atenuados quando adicionalmente ajustados para calças /saia tamanho . o tamanho das calças /saia, por 2 aumento de tamanho, foi associado com ambos os subtipos de tumor, mesmo após o ajuste para o IMC (CIMP HR: 1,20, 95% CI: 1,01-1,43; não CIMP HR: 1,14, 95% CI: 1,04-1,28 ). Altura por 5 cm foi associado com ambos os sub-tipos de tumor, mas RHs foram atenuados quando ajustada para o peso corporal. IMC aos 20 anos foi positivamente associado com aumento do risco de tumores CIMP ea associação foi significativamente menos pronunciada para os tumores não-CIMP (

P

-heterogeneity = 0,01). A atividade física foi inversamente associado com ambos os subtipos, mas uma associação dose-resposta foi observada apenas para os tumores não-CIMP (

P

-trend = 0,02).

Conclusões

tamanho do corpo, especialmente a adiposidade central, pode aumentar o risco de ambos CIMP e tumores não CIMP. A gordura corporal em tenra idade podem diferencialmente risco influência. A atividade física parece diminuir o risco de CRC independentemente destes subtipos moleculares

Citation:. Hughes LAE, Simons CCJM, van den Brandt PA, Goldbohm RA, de Goeij AF, de bruine AP, et al. (2011) Tamanho de corpo, actividade física e risco de câncer colorretal com ou sem o CpG Ilha Methylator Fenótipo (CIMP). PLoS ONE 6 (4): e18571. doi: 10.1371 /journal.pone.0018571

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 15 de fevereiro de 2011; Aceito: 04 de março de 2011; Publicação: 05 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Hughes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi financiado pelo World Cancer Research Fund (WCRF), conceder # 2007/54 para Matty P. Weijenberg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

é bem aceito que os indicadores de balanço energético influenciar o risco de câncer colorretal (CRC). Um alto índice de massa corporal (IMC), circunferência da cintura e adulto atingido altura são fatores de risco claros para CRC, enquanto que a atividade física tem se mostrado protetora [1]. Embora CRC é um dos cancros melhor descrita em termos de eventos genéticos e epigenéticos envolvidos [2] – [5], pouco se sabe sobre como as medidas de antropometria e atividade física estão associados a diferentes subgrupos moleculares da doença. Elucidar potenciais diferenças de risco entre os subtipos moleculares de CRC pode conduzir a uma melhor compreensão do CRC, tratamento e prevenção. Isto é especialmente importante como a prevalência mundial de sobrepeso e obesidade continua a aumentar.

Uma característica distinta de instabilidade epigenética no CRC é o CpG ilha methylator fenótipo (CIMP), caracterizada por numerosos promotor CpG ilha hipermetilado suppressor- tumor e genes de reparação do ADN [6] – [9]. Este por sua vez está associado com o silenciamento transcricional da expressão de genes [10]. Poucos estudos investigaram associações entre os indicadores de balanço energético e estado CIMP, e aqueles que, considerados apenas o IMC como um indicador do tamanho do corpo. Em um cenário de caso-controle, Slattery

et al.

Relatado uma associação entre um IMC elevado e CIMP baixo, mas não CIMP tumores de cólon elevados [11], e nenhuma associação entre o estado de IMC e CIMP em tumores do reto [12 ]. vigorosa atividade física foi associada com ambos os tumores de baixo cólon CIMP alta e CIMP, mas não tumores do reto [11], [12]. Postula-se que a metilação do DNA é uma consequência da inflamação [13], [14]. adiposidade central também está associada com a inflamação crónica [15]. Portanto, considerando a circunferência da cintura como um fator de risco para CIMP além de IMC é importante. Além disso, a metilação é pensado para ser um evento precoce na CRC [16], de modo que, considerando a altura e BMI em uma idade jovem também pode ser informativo como estas variáveis ​​são indicativos de

in utero Comprar e exposição da primeira infância [17] .

Usando o estudo prospectivo de coorte Holanda sobre dieta e câncer (NLCS), foi investigada a associação entre IMC, tamanho da roupa (como um proxy para a circunferência da cintura) e atividade física e risco de desenvolver um tumor caracterizado por CIMP . Além disso, na tentativa de elucidar se tempo de exposição é importante para modular esse risco, nós também investigou as associações de acordo com o IMC aos 20 anos, a mudança IMC e altura alcançada-adulto.

Resultados

basais e moleculares características estão descritas na Tabela 1. Proporcionalmente, casos CIMP CRC eram mais propensos a ser do sexo feminino, tem um tumor no cólon proximal, e ser mais velhos do que os casos não-CIMP.

as associações entre medidas de antropometria, atividade física e risco CRC acordo com o estatuto CIMP são apresentados na Tabela 2. Após o ajuste para idade e sexo, IMC modelada por 5 kg /m

2 aumento foi estatisticamente significativamente associada com CIMP tumores (HR: 1,29, IC 95%: 1,01-1,66), e uma relação estatisticamente significativa dose-resposta foi observada na modelagem quartis do IMC (

P

-trend = 0,02). No entanto, quando os modelos foram mutuamente ajustados para o tamanho das calças /saia, estas associações foram grandemente atenuada. IMC foi também positivamente, embora não estatisticamente significativa, associada com tumores não-CIMP. Estes também foram atenuados quando mutuamente ajustados para o tamanho das calças /saia. As horas para CIMP e tumores não CIMP não diferiram significativamente entre si (

P

-heterogeneity = 0,78). IMC aos 20 anos modelada por 5 kg /m

2 aumento foi associado com um risco aumentado de ambos os subtipos, mas RHs não atingiu significância estatística. Quando o IMC aos 20 anos foi modelado em quartis, foi observada uma tendência estatisticamente significativa para os tumores CIMP (

P

= 0,03). Esta tendência tornou-se marginalmente significante quando o modelo foi ajustado para o tamanho das calças /saia (

P

-trend = 0,07). O teste para heterogeneidade entre os subtipos de tumor foi estatisticamente significativa em relação ao IMC aos 20 anos, mesmo após o ajuste para o tamanho das calças /saia (

P

-heterogeneity = 0,01). Não houve observações significativas foram observadas no que diz respeito à mudança IMC

tamanho de calças /saia, modelada por 2 aumento o tamanho da unidade, foi associado ao CIMP (HR:. CI 1,20, 95%: 1,05-1,37 ) e tumores não CIMP (HR: CI 1,14, 95%: 1,05-1,24) após ajuste multivariado, e essas associações se manteve mesmo quando os modelos foram mutuamente ajustados para IMC. Quando o tamanho das calças /saia foi considerado em quartis aproximados, o teste de tendência foi significativa para CIMP (p = 0,02) e borderline significativas para tumores não-CIMP (

= 0,06

P), embora estes foram atenuados quando os modelos foram ajustadas mutuamente para o IMC. Associações observadas para CIMP e tumores não CIMP não foram estatisticamente significativamente diferentes uns dos outros (

P

-heterogeneity = 0,61).

Altura, modelada por 5 cm aumento foi associado ao CIMP ( RH: CI 1,16, 95%: 1,01-1,33) e não-CIMP (RH: tumores após ajuste multivariado 1,00-1,21): 1,10 Cl, 95%. A limítrofe estatisticamente significativa tendência foi observada para o risco de tumores não CIMP quando a altura foi considerado em quartis (mais alto versus o quartil mais baixo HR: CI 1,45, 95%: 1,03-2,06;

P

= 0,06) (p heterogeneidade = 0,98). Estas associações foram atenuadas quando o modelo foi mutuamente ajustada para o peso corporal.

Com baixa atividade física como categoria de referência, não houve associação dose-resposta inversa entre atividade física e tumores CIMP, embora o HR para física intermediária actividade foi estatisticamente significativa (HR: CI 0,50, 95%: 0,30-0,82) (Tabela 3). Uma associação inversa foi observada de maneira dose-resposta para tumores não CIMP (intermediário atividade física HR: 0,80, 95% CI: 0,61-1,04; atividade física de alta HR: 0,69, 95% CI: 0,47-0,96;

P

-trend = 0,02), no entanto, as associações com CIMP e tumores não CIMP não diferiram significativamente entre si (

P

-heterogeneity = 0,33).

as associações de um índice de metilação do tumor em relação a factores de risco antropométricos e actividade física são apresentados na Tabela 4. não houve nenhum padrão claro no que diz respeito ao grau de metilação, no entanto, quando modelada por duas unidade de aumento de tamanho, o tamanho das calças /saia foi associada de uma maneira dose-resposta com tumores que apresentam o maior nível de metilação (4-7 genes de RH metilado: 1,29, 95% CI: 1,06-1,58;

P

-trend = 0,08)

Discussão

Estes dados sugerem que a gordura corporal adulto e altura podem aumentar o risco de CRC, mas não são diferencialmente associado com CIMP e tumores não CIMP. Ao contrário, o IMC aos 20 anos de idade pode ser um fator de risco mais forte para tumores CIMP +. atividade física linha de base parece diminuir o risco de CRC, independentemente do status CIMP.

A grande força deste estudo é que nós investigamos associações em um cenário prospectivo de coorte. O NLCS tem apuração quase completa do câncer colorretal e muito pouca perda de follow-up. Embora o número de total de CRC, após 7,3 anos de follow-up no NLCS foi substancial, o número de casos com o fenótipo CIMP era pequeno. Com poder limitado para detectar associações, é possível que alguns achados surgiu por acaso. Outra limitação potencial deste estudo é que as variáveis ​​antropométricas foram obtidas por auto-relato. No entanto, há muitos exemplos na literatura que mostram que este método é um instrumento válido e confiável para avaliar o peso corporal e altura em estudos de coorte [18] – [21].

Para o nosso conhecimento, as associações entre indicadores de balanço energético e estado CIMP de tumores colorretais foram relatados apenas por Slattery

et al.

em um caso-controle de ajuste [11], [12]. Além do desenho do estudo, existem diferenças entre nossos estudos que devem ser levadas em conta quando se comparam resultados.

O NLCS utilizado o painel Weisenberger de genes para definir CIMP (

CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3

e

SOCS1

), enquanto o estudo de Slattery

et al.

, utilizou o painel clássico (

MINT1, MINT2, MINT31, p16 e hMLH1

) , bem como diferentes pontos de corte para definir CIMP em tumores [22], [23]. A definição “certo” de CIMP ainda é um tema muito debatido, como é o painel gene ideal eo método adequado para a detecção de metilação [12], [24]. Enquanto o painel de Weisenberger foi validado, diferentes marcadores de metilação pode ser mais ou menos informativa no que diz respeito ao estudo exposições diferentes. A prevalência de CIMP na população NLCS é maior do que no estudo de Slattery

et ai. (27% vs 11%) [12]. No entanto, uma diferença em modelos de iniciadores e condições de PCR pode alterar substancialmente a sensibilidade e a especificidade de um marcador particular para a detecção de CIMP em CRC [25]. Portanto, é provável que as diferenças na prevalência não é devido aos diferentes métodos em si, mas sim uma diferença na escolha dos iniciadores. O MSP análises que têm sido realizados nos NLCS ter um sinal de detecção de alta e, posteriormente, foi observada uma maior prevalência de CIMP. No presente estudo, buscou-se esclarecer as nossas observações através da construção de um índice de metilação com diferentes pontos de corte, que incluiu sete genes comumente metilado no CRC.

No presente estudo, consideramos cólon e reto tumores em conjunto para aumentar poder estatístico. Uma análise de sensibilidade revelou que este não viés nossos achados (dados não mostrados). Além disso, sugerimos que ideia de combinar sub-localizações de tumores pode ser aceitável quando se estuda endpoints moleculares, porque isso pode ajudar a explicar as diferenças na etiologia de acordo com a sub-localização.

Foi observado que o IMC, foi associado ao tumor CIMP e não CIMP tumores; no entanto, após o ajuste para o tamanho da roupa, essas associações desapareceram. Isto está em contraste com os dados de caso-coorte sugerindo que o IMC está associada apenas com CIMP negativo tumores do cólon e não com tumores rectais [11], [12]. Em nosso estudo, o tamanho das calças /saia parece ser um preditor forte e independente de ambos os subtipos de tumor, mesmo após o ajuste para o IMC. Isso é lógico, porque a circunferência da cintura, um indicador de adiposidade central, é um preditor mais forte do CRC do que o IMC [1], [26]. Quando considerados associações de acordo com um índice de metilação, não observamos associações claras em relação ao IMC e grau de metilação do promotor, no entanto, nós observamos que o tamanho das calças /saia estava associado com o mais alto nível de metilação. Que observamos associações entre calças tamanho /saia e ambos CIMP e os tumores não-CIMP sugere que a adiposidade central pode influenciar o risco de CRC, tanto através de uma metilação e uma via não-metilação.

Embora muito poucos estudos têm considerado associações entre IMC e CIMP, um número ter considerado endpoints na mesma via que CIMP. O câncer colorretal tem subconjuntos moleculares distintos, que evoluem através de vias diferentes [16]. O caminho para um adenocarcinoma serrilhada parece assumir uma das duas rotas principais: a via serrilhada tradicional ou a via serrilhada sessile [27]. A via serrilhada séssil é caracterizada por um elevado grau de CIMP,

BRAF V600E

mutações, e, finalmente, se desenvolve em instabilidade microssatélite (MSI) [27]. MSI pode servir como um marcador para CIMP ou outros eventos moleculares no CRC [28], portanto, pode ser informativo para considerar os resultados do presente estudo no contexto dessa pesquisa. Dois estudos de caso-controle têm relatado que o IMC aparece associado estáveis ​​microssatélites tumores (MSS), e menos com tumores MSI [29], [30]. Nem estudo relatou associações de acordo com a circunferência da cintura. Em uma recente análise agrupada de NLCS e os dados do estudo de coorte Melbourne Collaborative, observamos associações similares, embora o teste para heterogeneidade entre os subtipos de tumor não foi estatisticamente significativa (Hughes

et al.

, Submetido).

Há evidências que sugerem que as exposições iniciais de vida influenciar mecanismos epigenéticos associadas ao risco de doenças do adulto [31], [32]. Portanto, nós também investigou as associações entre IMC aos 20 anos, a mudança IMC, altura e estado CIMP. Altura é um marcador de uma experiência fetal e infantil agregada, e pode ser considerada uma medida proxy para importantes exposições nutricionais, que afetam vários eixos hormonais e metabólicas [17]. Nos NLCS, temos observado que a infância ea restrição energética na adolescência está associada a uma diminuição do risco de CRC mais tarde na vida [33], [34], que é apoiado por outros estudos populacionais com base [35] – [37]. Nós também informou recentemente que a exposição a restrição energética grave durante a infância e adolescência foi associada a um baixo risco de desenvolver um tumor CIMP [32]. Além disso, dados agrupados sugerem que indivíduos mais altos estão em maior risco de desenvolver um tumor MSI (Hughes

et al

. Submetido). De acordo com o estudo, a altura não é diferencialmente associado com o risco de tumores, no entanto, foi observada uma heterogeneidade significativa em relação ao IMC na idade de 20 e de tumor subtipos. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que o tamanho do corpo podem influenciar diferencialmente estatuto CIMP durante diferentes períodos da vida, potencialmente afetando mais tarde risco CRC. A associação entre o IMC aos 20 anos e tumores CIMP era mais forte do que com tumores não-CIMP, que está de acordo com achados anteriores de restrição energética grave durante a infância e adolescência. Embora o nosso método de bootstrapping é bastante conservador, não observamos uma associação clara com relação ao IMC aos 20 anos eo índice de metilação e, portanto, não se pode descartar que a associação diferencial com estatuto CIMP é uma descoberta casual. A hipótese de que o tempo de exposição pode influenciar mecanismos epigenéticos requer uma investigação mais aprofundada.

Isso não observamos quaisquer associações claras entre a mudança IMC eo risco de tumores foi surpreendente. Isto pode indicar que alterações metabólicas em gordura podem ser mais importantes para a modulação risco ao longo do tempo, em vez de IMC. Alternativamente, considerando homens e mulheres juntos pode ter atenuado estas observações. Campbell

et al.

Relatar que o ganho de peso adulto foi associada com CRC em homens, mas não em mulheres, e apenas em relação aos indivíduos que ganharam mais de 21 kg desde 20 [29] idade. Finalmente, considerando apenas dois pontos de tempo pode não ser indicativo de verdadeira mudança IMC.

Nossas descobertas em relação à atividade física apoiar aqueles de Slattery

et al.

[11], e sugerem que a alta níveis de exercícios diários estão associados com um risco diminuído de ambos CIMP e tumores não-CIMP. Observações com relação ao nosso índice de metilação sugerem que a atividade física pode ser mais protetor de tumores com o aumento da metilação, mas mais pesquisas são necessárias antes que as conclusões podem ser tiradas.

A evidência preliminar sugere que os marcadores moleculares podem ser usados ​​para classificar câncer colorretal em subtipos distintos, que têm implicações para a etiologia e prevenção [28]. Menos tumores surgem a partir da via serrilhada sésseis em comparação com a via tradicional adenoma [27], [38]. Como o excesso de peso ea obesidade são fatores de risco importantes para CRC, existe a possibilidade de que estas condições podem diferencialmente risco influência através de vias e outros do que aquilo que aqui investigados mecanismos moleculares. Mais pesquisas são necessárias para esclarecer a associação entre indicadores de balanço energético e mecanismos epigenéticos que levam a CRC; de preferência em um cenário prospectivo de coorte, com muitos casos [39]. Além disso, como o campo da epidemiologia molecular patológica [40] continua a evoluir, métodos e definições de endpoints moleculares padronização deve ser abordado. Isto torna-se especialmente importante à medida que mais oportunidades para pooling surgem dados.

Em conclusão, os nossos resultados sugerem que as medidas de antropometria refletindo um tamanho grande corpo aumentam o risco de ambos CIMP e os tumores não-CIMP, e que a gordura corporal em tenra idade podem diferencialmente risco influência. A actividade física aparece para diminuir o risco de CRC independentemente destes subtipos moleculares. Nossas observações reiteram a importância de um peso corporal saudável em relação à prevenção geral CRC.

Materiais e Métodos

populações estudo e concepção

O NLCS é um estudo prospectivo de coorte que foi iniciado em 1986 para investigar a associação entre a dieta eo desenvolvimento de câncer. Ele inclui 58,279 homens e 62,573 mulheres entre as idades de 55-69 anos no início do estudo, que completaram um questionário de frequência alimentar auto-administrado, envolvendo 150 itens de alimentos, bem como perguntas sobre hábitos alimentares, estilo de vida, saúde e demografia. registros municipais de toda a Holanda foram usadas para constituir uma base de amostragem eficiente. O NLCS usa um caso – abordagem de coorte para o processamento e análise de dados; assuntos de caso foram derivadas de toda a coorte, e o número de pessoas-anos em risco de toda a coorte foi estimado a partir de uma sub coorte de 5000 homens e mulheres que foram amostrados aleatoriamente a partir da coorte completa na linha de base. Todos os membros da coorte sub que relataram câncer prevalente (excluindo o cancro de pele) no início do estudo foram excluídos da análise, deixando 4654. Mais detalhes da concepção NLCS foram descritos [41] – [43].

casos incidentes CRC foram identificado por ligação recorde anual para nove registos oncológicos regionais e uma base de dados nacional patologia (PALGA) [44]. A integralidade do câncer de follow-up é quase 100% [45]. Parafina material tumoral incorporado a partir de pacientes com CCR foi recuperado, conforme descrito anteriormente [46]. No total, 734 pacientes com CCR incidentes foram identificados a partir de um período de acompanhamento de 7,3 anos após o início do estudo, excluindo-se os 2 primeiros anos de follow-up, dos quais um relatório PALGA da lesão, bem como DNA suficiente estava disponível [46].

o protocolo do estudo foi aprovado pelos Comitês do Hospital Universitário de Maastricht e TNO Nutrition Ética médica. Sobre o recrutamento, os participantes foram informados por escrito dos detalhes do estudo e seus objetivos. De acordo com os regulamentos da época, consentimento informado por escrito foi obtida quando os participantes devolveram o questionário de base concluída. material tumoral foi recolhido após aprovação pelos conselhos de ética em pesquisa da Universidade de Maastricht, o Registro Nacional do Câncer, e PALGA.

Apuração de fatores de risco

As variáveis ​​antropométricas.

Altura ( cm), peso corporal (kg) e peso corporal na idade de 20 (kg) foram auto-relatados no questionário inicial. A partir dessas variáveis, IMC e IMC aos 20 anos, e mudança IMC foram posteriormente calculado. No início do estudo, os indivíduos também foram solicitados a relatar a sua parte inferior do corpo (calças ou saia) tamanho da roupa de sua grife de roupas (tamanhos holandês). o tamanho das calças /saia tem demonstrado ser uma medida de substituição adequada para a circunferência da cintura na predição do risco de câncer no NLCS, e detalhes de como tamanho da roupa corresponde a medidas de cintura em homens e mulheres nesta população holandesa foi publicado [47]. IMC, IMC aos 20 anos, saia /tamanho da calça, e altura foram categorizados em quartis específicas do sexo aproximados. Como no NLCS anterior análises, mudança IMC foi categorizado como: 0 kg /m

2, 0-4 kg /m

2, 4-8 kg /m

2, e 8 kg /m

2 [48].

a atividade física.

no que diz respeito à atividade física e risco de CRC na população NLCS, atividade física ocupacional parece ser mais importante para os homens e de lazer atividade física para mulheres para predizer o risco (Simons

et al.

, submetido). Portanto, nós utilizamos essas duas variáveis ​​para criar categorias específicas do sexo de ‘baixo’ ‘intermediária’ e ‘alta’ atividade física.

Atividade física

ocupacional foi obtido a partir de dados sobre os participantes “história ocupacional. Usando informações sobre o tipo de trabalho ea duração, o gasto de energia e sentado tempo foi calculada para o trabalho retido mais longa e última. O gasto energético foi baseado em um sistema de classificação desenvolvido pela Hettinger

et al

[49] e distingue entre o trabalho de baixa, moderada e alta atividade que corresponde a um gasto energético de . 8, 8-12 e 12 kJ /min. Homens foram classificados na categoria “baixo” se a sua atividade física ocupacional foi 8 kj /minuto, “intermediário” se eles se enquadravam na categoria 8-12 kJ /minuto, e de alta se a sua atividade física ocupacional foi 12 kJ /minuto.

atividade física não ocupacional da linha de base foi calculada com base em duas questões. A primeira pergunta (open-ended) era “Quantos minutos você gasta em média por dia pé ou de bicicleta para o trabalho, para ir às compras ou para tirar o seu cão? O tempo declarado gasto por dia foi categorizada em ≤10, 10-30, 30-60 e 60 minutos por dia. A segunda pergunta era “Como muitas horas de seu tempo de lazer você gasta em média por semana em 1) ciclismo Recreativa, Andar, 2) jardinagem /biscates e 3) esportes, ginástica?” Respondendo possibilidades nunca foi, 1 hora por semana, 1-2 horas por semana e 2 horas por semana. O tempo gasto com essas actividades e os minutos gastos por dia em pé ou de bicicleta para o trabalho, para ir às compras ou para tirar o cão foram somados para se obter uma medida geral de atividade física não ocupacional linha de base, com as categorias 30, 30-60, 60-90 e 90 minutos por dia. actividade física baixa foi definida como 30 minutos /dia, como intermediário 30-90 minutos /dia, e alta como 90 minutos /dia

promotor Análise de metilação

CIMP no tumor. tecidos de casos de CRC foi definida por CpG promotor ilha hipermetilação de pelo menos 3 dos 5 marcadores de metilação (

CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3

e

SOCS1

), como proposto por Weisenberger

et ai.

[9] foram determinados por uma modificação de bissulfito de 500 ng de ADN genómico utilizando um kit disponível comercialmente (Zymo Research), e subsequente metilação de PCR específica (MSP) [50], [51]. Nós escolhemos usar MSP como um método porque é eficaz, específica e não exige equipamento específico. Tem sido demonstrado que os resultados a partir de MSP estão em conformidade com outras tecnologias, tais como MethyLight [52]. Além disso, o estado de metilação de dois outros genes,

APC

e

MLH1

, foram determinados e nós adicionamos-los para os marcadores CIMP para criar um índice de metilação de sete genes.

Para facilitar a análise de MSP no ADN recuperado a partir de tecidos fixados com formalina, embebidos em parafina, o ADN foi primeiro amplificado com os iniciadores de flanqueamento de PCR que amplificam o ADN modificado com bissulfito, mas não amplificam preferencialmente ADN metilado ou não metilado. O fragmento resultante foi utilizado como um molde para a reacção de MSP. Todos os PCRs foram realizadas com controles para alelos não metilados (DNA de linfócitos normais), alelos metilados [tratados DNA de linfócitos normais

in vitro

com

Sss

I metiltransferase (New England Biolabs, Ipswich, MA )] e um controlo sem DNA. Dez microlitros de cada reacção de MSP foi directamente carregado para não desnaturante 6% de géis de poliacrilamida corados com brometo de etídio e visualizados sob iluminação UV. As análises de MSP foram bem sucedidos para 81%, 79%, 79%, 90%, 83%, 93%, 93% e para fora dos 734 casos de

CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3, SOCS1

,

MLH1

, e

APC

respectivamente.

análise estatística

Os dados foram analisados ​​com Stata (versão 10, StataCorp, College Station, TX, EUA). Cox análise de riscos proporcionais usando a abordagem caso a coorte foi usado para obter taxas de risco (HR) e intervalos de 95% de confiança (IC) para a associação entre as medidas de antropometria e atividade física e CRC caracterizadas por estatuto CIMP. Para melhorar o poder estatístico, considerou-se homens e mulheres juntos. Os testes para a modificação de efeito por sexo não foram estatisticamente significativos. A suposição de riscos proporcionais foi testada usando os resíduos de Schoenfeld escalados e inspeção visual das curvas de perigo. Para levar em conta a variação adicional introduzida por amostragem a subcoorte de toda a coorte, os erros padrão foram estimados usando a opção robusta. A significância estatística foi testado ao nível de 0,05.

Para todas as variáveis ​​antropométricas em questão, foram considerados três modelos. O primeiro foi ajustado apenas para idade e sexo. O segundo foi adicionalmente ajustada para as variáveis ​​identificadas como sendo associada tanto CRC e balanço energético da literatura anterior. Estes história incluída família de CRC (sim /não), tabagismo (nunca fumante, ex-fumante, fumante atual), status socioeconômico (nível de ensino: primário, secundário, superior alto escola, escola vocacional mais alta, ou universidade ), o consumo total de energia (kcal /dia), a ingestão de álcool (0, 0,1-4, 5-14, 15-29, ≥30 g /dia), atividade física (baixo, médio, alto, como descrito anteriormente), e consumo de carne vermelha, frutas, legumes e grãos (g /dia). Finalmente, os modelos foram mutuamente ajustados para outras variáveis ​​antropométricas. Modelos, incluindo IMC e IMC aos 20 anos foram mutuamente ajustados para o tamanho da saia /calça, mudança IMC foi ajustado para o IMC aos 20 anos, o tamanho das calças /saia foi ajustado para o IMC e altura foi ajustado para o peso corporal.

modelamos atividade física ajustados para idade e sexo, e, adicionalmente, ajustados para calças /size saia, história familiar de CRC (sim /não), tabagismo (nunca fumante, ex-fumante, fumante atual), status socioeconômico (nível de educação: escola primária, escola secundária, escola secundária de escola vocacional mais alta, ou universidade), o consumo total de energia (kcal /dia), a ingestão de álcool (0, 0,1-4, 5-14, 15-29, ≥30 g /dia ), tamanho da roupa, e o consumo de carne vermelha, frutas, verduras e fibras (g /dia).

Para avaliar a forma como as medidas de antropometria e atividade física foram associados com o grau de metilação do promotor nos tumores CRC , foi utilizado o índice de metilação acima mencionada para categorizar casos em um dos três grupos: ‘0-1 genes metilados’, ‘2-3 genes metilados’, ou ‘4-7 genes metilados’. Dos 734 casos, 556 tinham informações suficientes para ser classificados em uma das três categorias. Modelos, incluindo variáveis ​​antropométricas foram ajustados para idade, sexo, e mutuamente ajustados para outras variáveis ​​antropométricas, como descrito anteriormente, e o modelo para a atividade física foi ajustado para idade e sexo.

Os testes de heterogeneidade foram feitos para avaliar as diferenças entre subtipos de tumores (por exemplo,

CIMP vs. não-CIMP

) utilizando o procedimento riscos competir no STATA. No entanto, a SE para a diferença entre as taxas de log-risco deste procedimento pressupõe a independência de ambas as taxas de risco estimadas, o que levaria à sobrestimação que SE e, portanto, superestimar os valores

P Compra de sua diferença. Portanto, estes

valores P Comprar e os intervalos de confiança associados foram estimados com base em um método de bootstrapping que foi desenvolvido para o desenho de caso-coorte, conforme descrito anteriormente [53]. Cada análise de bootstrap foi baseada em 1000 repetições.

Reconhecimentos

Estamos em dívida com os participantes deste estudo e agradecer aos registos oncológicos (IKA, IKL, IKMN, IKN, IKO, IKr, IKST , IKW, IKZ e VIKC) e Países Baixos Nationwide Registry Patologia (PALGA). Agradecemos também a S van de Crommert e J Nelissen para a sua assistência com a entrada de dados e gestão de dados; A Volovics e A Kester para o conselho estatística; L Schouten, C de Zwart, M Moll, W van Dijk, M Jansen, e A Pisters de assistência; e H van Montfort, T van Moergastel, L van den Bosch, e R Schmeitz de assistência de programação; K Wouters, S Hulsmans, e A Spiertz de assistência laboratório.