Abstract

O inibidor dependente da ciclina quinase 3 (

CDKN3

) gene, envolvidos na mitose, é regulada em câncer cervical (CC). Nós investigamos

CDKN3

mRNA como um biomarcador sobrevivência e alvo terapêutico potencial para CC.

CDKN3

mRNA foi medida em 134 CC e 25 controles por PCR quantitativa. Um estudo sobrevida em 5 anos foi realizado em 121 destes pacientes CC. Além disso,

CDKN3

siRNAs espec�icos foram usadas para investigar se

CDKN3

está envolvida na proliferação, migração e invasão em linhas celulares derivadas de CC (SiHa, CaSki, HeLa).

CDKN3

ARNm era em média 6,4 vezes maior nos tumores do que nos controlos (p = 8 x 10

-6, de Mann-Whitney). Um total de 68,2% dos pacientes CC sobre expressando

CDKN3

gene (dobre mudança ≥ 17) morreram dentro de dois anos após o diagnóstico, independente do tipo de palco e HPV clínica (Taxa de Risco = 5,0, IC 95%: 2,5 -10, p = 3,3 x 10

-6, Cox de riscos proporcionais de regressão). Em contraste, apenas 19,2% dos pacientes com expressão

CDKN3

menor morreu no mesmo período. Em inactivação in vitro do

CDKN3

diminuiu a proliferação celular, em média, de 67%, ainda que não teve nenhum efeito sobre a migração e invasão celular.

CDKN3

mRNA pode ser um bom biomarcador sobrevivência e alvo terapêutico potencial no CC

Citation:. Barrón EV, Roman-Bassaure E, Sánchez-Sandoval AL, Espinosa AM, Guardado-Estrada M, Medina I, et al. (2015)

CDKN3

mRNA como um biomarcador para a sobrevivência e Terapêutica Target em câncer cervical. PLoS ONE 10 (9): e0137397. doi: 10.1371 /journal.pone.0137397

editor: Zhi-Ming Zheng, Instituto Nacional de Saúde-National Cancer Institute, United States |

Recebido: 18 de dezembro de 2014; Aceito: 17 de agosto de 2015; Publicação: 15 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Barrón et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT, www.conacyt.mx), conceder números 8135 /A1, 24341 (a JB ), Universidade Nacional do México (www.unam.mx), número de concessão SDI.PTID.05.2 (a JB) e Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT, www.conacyt.mx), bolsa de estudos (a EVB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : CC, o cancro do colo do útero; HPV, vírus do papiloma humano; CDKN3, ciclina-dependente inibidor da quinase 3; FIGO, Fédération Internationale de Obstetrícia Ginecologia; GAPDH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; RT-qPCR, por PCR de transcrição-quantitativa retro; FC, mudança Fold; ROC, Receiver Operator Characteristic; MW, teste de Mann-Whitney; HR, Hazard relação

Introdução

O câncer cervical (CC) é o quarto tipo de câncer mais comum em mulheres em todo o mundo [1]. A cada ano, 530.000 novos casos são relatados, tornando-se a principal causa de morte por câncer em mulheres de países em desenvolvimento [2, 3]. O papilomavírus humano (HPV) está presente em quase 100% dos pacientes CCs e é considerada a principal causa para o desenvolvimento de CC. No mundo inteiro, o HPV 16 é o tipo mais frequentemente detectada viral em CC, encontradas em aproximadamente 50% dos casos, seguido de HPV 18 (15%) [4, 5]. As vacinas actualmente utilizadas são muito eficazes na prevenção de infecções por HPV dos tipos 16 e 18. Eles também impedir o desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial de alto grau associados com estes vírus [6, 7]. No entanto, uma vez que estas vacinas oferecem proteção contra apenas alguns vírus ea duração da resposta imune é desconhecida, recomenda-se que as mulheres vacinadas continuam a ser inscritos em programas de detecção precoce para CC [8, 9]. Em muitos países, estas vacinas foram incorporadas em programas de vacinação para meninas com idade entre 9-12 anos [10, 11]. Apesar de a implantação da vacina, a história natural da doença indica que um impacto sobre a incidência do cancro do colo do útero não será visto por décadas. [10, 12]. Além disso, de acordo com a distribuição de tipos de HPV 16 e 18 entre os vários grupos de idade, cerca de metade das mulheres com mais de 50 anos com CC que não pode ser protegido por tais vacinas preventivas [13]. Portanto, é necessário melhorar os procedimentos para a detecção e tratamento de CC precoce.

O tratamento corrente para CC inclui cirurgia, quimioterapia, terapia de radiação, ou uma combinação destas terapias, dependendo do estágio clínico da doença. Embora o sucesso destes métodos convencionais depende do estágio clínico da doença, em geral, a sobrevivência do paciente diminui com o estágio da doença [14]. Enquanto estava lá são direcionados terapias para muitos tipos de câncer [15], não há terapias-alvo específicos contra o CC. oncoproteínas mutadas, especialmente proteínas quinases, são os alvos da maioria dos medicamentos contra o câncer-alvo específico [16]. Além disso, alguns medicamentos específicos proteínas alvo normais regulados positivamente em tumores, tais como HER2 /neu no cancro da mama [17, 18]. Identificação de alvos moleculares regulada em CC, que são essenciais para o crescimento do tumor e ausente no colo do útero saudável, é o primeiro passo para o desenvolvimento de drogas-alvo específicos para o tratamento de CC.

A inibição da mitose é um bem conhecido estratégia de luta contra o cancro [19, 20]. As drogas que inibem o processo de divisão celular são geralmente eficazes como agentes anti-cancerígenos. Os taxanos e alcalóides de vinca, os quais inibem a formação do fuso mitótico, são exemplos bem conhecidos destas drogas. No entanto, a sua eficácia é limitada porque eles também afetam a rede de microtúbulos de células que não se dividem afetando funções endoteliais e produzir efeitos neurotóxicos.

Em um trabalho anterior, foi demonstrado que o gene “dependente da ciclina inibidor da quinase 3 “(

CDKN3

), que está envolvida na mitose, é regulada positivamente em comparação com CC que, no epitélio cervical normal. Além disso, numa análise de sobrevida de 3,5 anos preliminar, incluindo uma pequena amostra de pacientes CC (n = 42) positivo para HPV16, os níveis de

CDKN3 alta expressão

foram encontrados associados a uma sobrevida do paciente mais curto [21 ]. Estes dados sugerem que

CDKN3

podem estar envolvidos na progressão do tumor, pelo menos em CC positivo para HPV16. Não se sabe se a sobre-expressão de

CDKN3

também está associada a uma diminuição de sobrevida em pacientes CC positivas para outros fins que HPV16 HPVs.

Para demonstrar conclusivamente se a superexpressão de

CDKN3

está associada com menor tempo de sobrevida em pacientes CC, uma análise de sobrevida em 5 anos foi realizado em uma amostra maior (n = 121). Isto incluiu um grupo de pacientes positivos para HPV16 com excepção HPV e um grupo maior de pacientes HPV16-positiva. Além disso, para investigar se

CDKN3

está envolvido no processo de carcinogénese, analisamos o efeito de inibição de

CDKN3

expressão do gene na proliferação, migração e invasão de linhas celulares derivadas de HPV16 -positivas (SiHa e CaSki) e HPV18-positivas (HeLa) CCs.

Métodos

A seleção dos pacientes, desenho do estudo, e endpoints

Os sujeitos do estudo incluiu 134 pacientes diagnosticados com CC no Departamento de Oncologia e 25 mulheres, com o epitélio cervical (controles experimentais) normais avaliadas no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital Geral de México na Cidade do México. As amostras CC eram um subconjunto selecionado de um total de 462 pacientes com CC que foram recrutados com os seguintes critérios de inclusão: diagnóstico clínico de CC invasiva no Departamento de Oncologia, sem tratamentos anteriores, e natural e residente no México com uma ascendência mexicana voltar duas gerações. Os pacientes que preencheram os critérios de inclusão foram posteriormente recrutados durante os períodos de novembro de 2003 a abril de 2005 e janeiro de 2006 a julho de 2007, e representou cerca de 80% dos pacientes diagnosticados com CC durante este período. Os critérios de selecção para o subconjunto CC foram baseados na disponibilidade de ARN de alta qualidade a partir de biópsia do tumor extraído fresco, com células do tumor mais de 70% na análise morfológica e o tipo viral positividade de tumores. Com base na qualidade do ARN, a maioria dos casos (88%) foram seleccionadas durante o segundo período de recrutamento. CCs incluiu 90 amostras positivas para HPV16 (42 reportados anteriormente [21], que foram atualizados com os dados de 5 anos de sobrevivência, e 48 novas amostras analisadas por este relatório) e 44 positivos para outros tipos de HPV: 18, 31, 33, 35 , 45, 51, 52, 53, 58, 59 e 68. As mulheres incluídas neste relatório foram comparáveis ​​aos excluídos com base na idade (média = 50 anos), raça /etnia, histologia e estágio do tumor. A frequência de tipos de HPV neste subconjunto não era comparável à frequência em toda a amostra [13], uma vez que uma proporção mais elevada de tumores HPV16-positivas foram seleccionados. Os tumores de pacientes CC foram encenadas de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia Obstetrícia (FIGO) [22]. Duas amostras de biópsia foram retirados dos tumores durante os exames de colposcopia. Uma amostra foi dividida em duas partes iguais: uma parte foi fixada em formalina tamponada para análise morfológica e o outro, em conjunto com a segunda amostra de biópsia, foi congelados instantaneamente em gelo seco e armazenadas a -80 ° C até à análise. amostras cervicais de controlo foram obtidos a partir de pacientes submetidos a histerectomia devido a miomatose. A raça e idade média (49 anos) desses pacientes foi semelhante à dos pacientes com CC. Eles foram previamente diagnosticados com um colo normal por citologia e colposcopia. Imediatamente após receber um fragmento do colo do útero da sala de cirurgia, dissecamos os epitélios exocervical sob um microscópio estereoscópico para evitar células estromais. Apenas quatro amostras (16%) foram positivos para o HPV, mas os sinais eram fracos. O endpoint primário foi a sobrevida global em 5 anos. O protocolo do estudo foi aprovado pelas Comissões Científica e de Ética do Hospital Geral de Mexico (número de aprovação DIC /03/311/04/051) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da sua inclusão.

DNA e RNA isolamento

ADN foi purificado a partir de amostras de biópsia, utilizando um ADN genómico PureLink Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e mantida a -20 ° C até à análise. O ARN total foi isolado a partir de metade da biópsia dividido utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade do ARN foi confirmado com electroforese em gel de agarose, como foi demonstrado pela presença de ARN ribossómico intacto, com a banda 28S duas vezes tão intensa quanto a banda 18S.

A detecção e tipagem do HPV

a detecção do HPV foi realizada por PCR usando primers universais localizadas em genes HPV L1

MY09

/

MY11

,

GP5 +

/

6+

, e

L1C1

, como descrito anteriormente [23-25]. O

gene HBB

foi usado como um controlo interno para avaliar a qualidade do DNA. Os tipos de HPV foram identificados por sequenciação das bandas amplificadas usando o método do ciclo de sequenciação fluorescente (Big Dye Terminator Pronto Kit de Reacção; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). A análise de sequência foi realizada utilizando um sistema ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Cada banda sequenciado foram analisados ​​com a ferramenta seqüência FASTA semelhança [13, 26]. A identidade percentual média de tipos de HPV detectado era de 98,7% quando comparada com as sequências de referência.

Medição de

CDKN3

expressão génica utilizando quantitativo em tempo real da transcrição de reacção em cadeia da polimerase inversa (qRT-PCR)

a transcrição reversa do RNA total foi realizada utilizando o kit High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems) num volume total de 20 uL. A mistura incluía 2 mg de RNA, 2 uL de tampão 10 × RT, 0,8 ul de dNTPs 100 mM, 2 ul de 10 × RT aleatórios iniciadores, 1 mL de MultiScribe

TM transcriptase inversa (5 U /uL), e 1 ul de inibidor de RNase (2 U /mL). As reacções foram incubadas a 37 ° C durante 120 minutos, e, em seguida, armazenada a -20 ° C.

CDKN3

expressão do gene foi medida em 134 CC e 25 amostras de controlo epitélio cervical saudáveis ​​por PCR de transcrição-quantitativa reversa (RT-qPCR) utilizando sondas TaqMan.

GAPDH

foi utilizado como controle interno. foram utilizados TaqMan ensaios de expressão gênica (

CDKN3

, Hs00193192_m1;

GAPDH

, Hs02758991_g1; Applied Biosystems). As experiências foram realizadas em triplicado num volume final de 20? L, dos quais 200 ng de ADNc molde, 10 mL de 2 × TaqMan Universal Master Mix de PCR (Applied Biosystems), 1 mL de 20 × TaqMan Gene Expression Assay, e 7 mL de livre de RNase água. O programa de ciclos foi executado num rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Austrália), o qual foi definido como se segue: um passo de activação inicial de PCR a 50 ° C durante 2 minutos seguido de 95 ° C durante 10 min, em seguida 40 ciclos de ponto de fusão a 95 ° C durante 15 s e emparelhamento /extensão a 60 ° C durante 1 min. Medição da expressão do gene foi com base nas curvas padrão relativos construídos a partir de um pool de 10 vezes diluído em série dos cDNAs de CC entre 500 e de 0,05 ng. A expressão de

gene CDKN3

foi normalizada em cada amostra de tumor e de controlo para a intensidade da referência interna (

GAPDH

) usando um método anteriormente descrito [21]. Os valores de intensidade medidos foram normalizados em ng /mL. Um teste de normalidade (Shapiro-Wilk) foi realizado com o teste para uma distribuição normal dos dados de expressão de genes. A expressão dobra-mudança foi calculada dividindo a intensidade normalizada mediana de cada amostra de tumor pela intensidade mediana normalizada das amostras de controlo. A significância estatística entre as médias de tumores e controles foi calculado com o Mann-Whitney (MW) teste não-paramétrico.

Identificação

CDKN3

RNA variantes usando RT-PCR e sequenciamento de DNA

CDKN3

variantes de ARN foram determinadas no cDNA de 45 tumores, 22 epitélio cervical normal, e três linhas de células (CaSki, HeLa e SiHa) utilizando RT-PCR. Os iniciadores utilizados para o RT-PCR foram previamente descrito [27] ou concebidas de acordo com as variantes sequências publicada [28] (S1 Tabela). Os produtos de PCR foram analisados ​​utilizando electroforese em gel de agarose e sequenciados utilizando o método de sequenciação fluorescente ciclo-(Big Dye Terminator Pronto Kit de Reacção; Applied Biosystems). A análise de sequência foi realizada utilizando um sistema ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As sequências foram analisados ​​com a ferramenta seqüência FASTA semelhança [13, 26], software SeqScape (Applied Biosystems) e ferramenta de alinhamento ClustalW2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).

a análise de sobrevida

de acordo com o estadiamento FIGO pacientes com câncer cervical receberam tratamento individualizado com base nas diretrizes de tratamento para o cancro do colo do útero da American cancer Society (S2 Tabela). Após o término do tratamento, cada doente foi clinicamente avaliado a cada 1, 3 ou 6 meses por um oncologista experiente. Os dados clínicos do estudo de follow-up foi obtido a partir de prontuário dos pacientes. Além disso, um assistente social realizada telefonemas e visitas domiciliares aos pacientes a cada 6 meses durante o estudo. Apenas 121 dos 134 pacientes exploradas com qRT-PCR foram incluídos no estudo de acompanhamento, e incluiu 83 amostras positivas para HPV16 e 38 amostras positivas para outros tipos de HPV, incluindo HPV18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59 e 68. a análise de sobrevida foi realizada em todos os pacientes que receberam tratamento e foram acompanhados pelo menos 10 meses. Os que estão marcados com um asterisco na Tabela S2 não receberam tratamento (n = 8) ou foram perdidas durante o seguimento nos primeiros 10 meses (n = 5). O tempo médio seguinte dos 121 pacientes foi de 64 meses após o diagnóstico inicial. Status vivo foi registrado no último acompanhamento, a morte foi causada por tumor primário de câncer cervical, exceto o caso marcado com um asterisco duplo em S2 Table (R221), e os casos desconhecidos foram encaminhados para aqueles pacientes que perderam o controle de seu estado antes 60 meses de follow-up (R251, R278, R289 e R379). Estes casos perdidos eo paciente falecido de outros do que o cancro do colo do útero (R221) causas foram designados como censurado. Censurado e pacientes falecidos foram acompanhados pelo número de meses indicados na Tabela S2. Os pacientes foram considerados perdidos quando não compareceu às consultas médicas para o controle da doença, não foram encontrados em visitas domiciliares ou não responder a chamadas telefônicas. A causa da morte de todos os pacientes durante o seguimento foi confirmado pelo registro médico e a certidão de óbito. A associação de FIGO, tipo de HPV e

expressão CDKN3

com a sobrevivência foi investigado por análise de sobrevivência (veja abaixo na seção de análise estatística).

As linhas celulares

O CC linhas de células positivas para HPV16 (CaSki, SiHa) e HPV18 (HeLa) foram fornecidos pelo Dr. JC Gomora do Departamento de Biofísica da IFC-UNAM, México City. As células foram cultivadas com meio de modificação (Gibco® DMEM gato: 12100-038, Life Technologies, Grand Island, NY) de Dulbecco de Eagle suplementado com soro fetal de bovino (Gibco® gato: 16000-044, Life Technologies) e antibiótico-antimicótico a solução ( Cat Gibco®: 15240-062, Life Technologies) a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. As linhas celulares foram autenticado por curto de repetição em tandem de perfis antes das experiências (dados não apresentados).

A transfecção de siRNAs

As experiências foram repetidas duas vezes em triplicado. Um total de 2 x 10

5 as células foram semeadas em cada poço de uma placa de doze poços e cultivadas a 60-80% de confluência antes da transfecção. As células foram transfectadas com uma mistura de três siRNAs específicos contra o

CDKN3

(

CDKN3

siRNA, SC-43877) siRNAs ou de controlo que contêm três sequências mexidos que não vai levar à degradação específica de qualquer sabe mRNA celular (ARNsi de controlo-a, SC-37007), utilizando o siRNA Transfection Reagent (SC-29528) de acordo com as instruções do fabricante (todos os regentes a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA). Diferentes concentrações de ARNsi foram exploradas (80, 100, e 120 nM) para investigar a concentração apropriada para inibir

CDKN3

ARNm em linhas de células, incubando as células 48 h após a transfecção. O

CDKN3

nível de expressão do gene foi medido por RT-qPCR como descrito acima.

Imunofluorescência coloração

CDKN3 expressão da proteína foi determinada em três linhas de células transfectadas com o específico

CDKN3

ou siRNAs mexidos por imunofluorescência. As células transfectadas foram cultivadas em lamelas directamente depositados em poços da placa. As células em cultura 96 ​​h após a transfecção foram fixadas em etanol absoluto durante 20 min a -20 ° C. Em seguida, uma solução contendo 5% de albumina de soro bovino em PBS e 0,05% de Triton X-100 para a permeabilização de células e incubou-se durante 30 min. (Cat. 118702; Abcam Biochemicals, Cambridge, MA) o anticorpo policlonal de coelho contra CDKN3 primária, obtida a partir de Abcam, foi diluído 1: 200 em 5% de albumina de soro bovino em PBS e 0,05% de Triton X-100. Um volume total de 20 uL foram adicionados a cada lamela, que foram incubadas durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. Após lavagem com PBS, os complexos antigénio-anticorpo foram detectados por incubação das lamelas de cobertura com 20? L de anti-anticorpo de coelho secundário conjugado com FITC (1: 100; Zymax

TM, Life Technologies Jackson Lab) 2 horas à temperatura ambiente. os núcleos das células foram contrastadas com DAPI [4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole, Dicloridrato] (1: 1000; Invitrogen). Os ensaios foram realizados em triplicado. Como já relatados anteriormente [21], em lâminas de tecido do epitélio cervical normal, este sistema de detecção CDKN3, envolvendo anticorpos primários e secundários, não deu qualquer sinal (dados não mostrados). Do mesmo modo, em experiências linha celular utilizada para testar a especificidade do sistema, em que o anticorpo primário não foi incluído, o sistema de detecção não deu qualquer sinal (S1 figura). Estes dados indicam que o nosso sistema é específico para a detecção de proteína CDKN3. As imagens foram vistas em 60 × ampliação usando um confocal Olympus microscópio de fluorescência (Olympus FV1000, Center Valley, PA) e imagens digitais foram adquiridas com uma câmara CCD. A intensidade da fluorescência verde foi quantificado em 140 campos de cada experimento usando software ImageJ [29].

imuno-histoquímica (IH)

A expressão da proteína de CDKN3 foi determinada em 37 CC (22 e 15 positivos para HPV16 e outros HPVs, respectivamente) e 21 amostras de controlo, utilizando imuno-histoquímica (IH). Cinco micromatrizes de tecidos (TMA) foram construídas com cada uma contendo 10-12 CC e 4-5 controlos. O ensaio foi realizado como anteriormente descrito [21]. Em resumo, a TMA foram desparafinados em xileno e re-hidratadas em seguida, sequencialmente, com concentrações crescentes de álcool. O anticorpo primário contra CDKN3 (SC-475, 1: 100) foi obtida a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). complexos foram detectadas utilizando o método da peroxidase avidina-biotina, com 3,3′-diaminobenzidina-tetrahydrocloride como um substrato cromogénico antigénio-anticorpo (Cat. KO679 LSAB + sys /HRP; Dako Cytomation-Carpinteria, CA, EUA) e as secções foram contrastadas com hematoxilina. Os ensaios foram realizados em triplicado. A localização celular da imunorreacção foi identificado, ea intensidade foi marcado 0-4, onde 0 não indicou nenhuma coloração e 4 a coloração mais intensa.

Western blot

expressão da proteína foi determinada utilizando CDKN3 western blotting nas três linhas de células transfectadas com o ARNsi CDKN3 específico ou mexidos. As proteínas foram obtidos no ensaio radioimunoprecipita�o (RIPA) de reagente de lise (Cat: 89900, Life Technologies). O teor de proteína de cada ligado foi determinado utilizando um ensaio de Bradford proteína (Cat: B6916, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) com albumina de soro bovino (BSA) como padrão. Uma amostra de 50 ug de cada lisado foi resolvido em 12% de gel de poliacrilamida desnaturante (com gel de poliacrilamida a 5% de empilhamento) e transferidas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose. salina Após bloqueio com 5% de leite em pó desnatado em Tris mais Tween (TBST) a membrana foi incubada com um anticorpo policlonal de coelho anti-humano CDKN3 (SC-475 Santa Cruz Biotechnology, Inc.) e um anticorpo anti-humano monoclonal de rato de actina (a anticorpo anti-actina monoclonal foi gentilmente doada pelo Manuel Hernámdez, Ph.D, CINVESTAV) durante a noite a 4 ° C. A membrana foi então incubada com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários (GE Healthcare Bio-Sciences) durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem com TBST, as proteínas imunorreactivas foram desenvolvidos usando o kit de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare Bio-Sciences).

ensaio Proliferação

Os experimentos foram repetidos duas vezes em triplicado. As células transfectadas quer com os siRNAs específicos contra o

CDKN3

siRNAs de ARNm ou de controlo foram semeadas em cada poço de placas de vinte e quatro poços e colhidas às 24, 48, 72, e 96 h após a transfecção. A proliferação celular foi medida com um método colorimétrico baseado na conversão de sais de tetrazólio a formazano pela actividade de desidrogenase em mitocôndria activa (Vybrant

® MTT Assay Kit de Proliferação Celular, V-13154, Life Technologies). Resumidamente, após a substituição do meio de cultura com 400 uL de meio de cultura fresco (Gibco ® DMEM sem vermelho de fenol, Life Technologies), 20 uL de MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio ) solução foram adicionados em cada poço, incluindo os controlos negativos sem células. As células foram incubadas a 37 ° C durante 3 h, então todos os meios de cultura foram removidos e substituídos com 350μl de sulfóxido de dimetilo (DMSO), misturado suavemente, e incuba-se a 37 ° C durante 10 min. As placas foram lidas com um espectrofotómetro a 560 nm (BioPhotometer Eppendorf). O crescimento celular resulta uma tendência exponencial previsto pela equação y

T = y

0 * E

RX, em que y

t = absorvância no tempo específico, x = tempo de incubação em horas, y

0 = a absorvância constante no tempo = 0, e R = taxa de crescimento. Celular tempo de duplicação (Td) foi calculado de acordo com dois métodos diferentes: 1) a fórmula: Td = (t

2-t

1) x [log2 /(log y

y t2-log

t1)], em que y

T1 representa a absorvância a t

1 (24 h), Y

t2 representa a absorvância a t

2 (96 h), e 2) a fórmula Td = ln (2) /R. O efeito sobre a taxa de duplicação foi calculada pela divisão do tempo de duplicação das células transfectadas com ARNsi específicos contra o

CDKN3

por o tempo de duplicação das células transfectadas com ARNsi mexidos.

invasão e migração ensaios

Os experimentos foram repetidos duas vezes em triplicado. ensaio de invasão foi feito em um-24 poços transpoço câmara (BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasão Chamber # 354480; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As células em suspensão em 250 uL de meio isento de soro (5,0 x 10

4 células) foram adicionadas a filtros revestidos com Matrigel em poços em triplicado. No compartimento inferior das câmaras 500 uL de meio de bovino fetal de soro condicionado foi usado como atractivo quimioterapia. Após 48 h de incubação a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora, as células que invadiram através dos filtros foram recolhidos a partir do compartimento inferior e coradas com MTT ensaio colorimétrico descrito acima. O ensaio de migração foi realizada com um procedimento semelhante. As células foram carregados em transpo� inserções de membrana de policarbonato (BD BioCoat Controle ™ Insere 24 poços, Cat # 354578; Becton Dickinson) em poços em triplicado. As placas foram incubadas durante 22 h a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. As células que tinham migrado para o compartimento inferior das câmaras foram recolhidas e coradas com MTT ensaio colorimétrico descrito acima.

A análise estatística

A significância estatística de diferenças na

CDKN3

expressão entre os tumores de controlo e foi calculado com o teste de Mann-Whitney (MW) de teste não-paramétrico. Receiver Operator análise Característica (ROC) foi realizada e foi usado índice de Youden [21] para selecionar os melhores pontos de corte para distinguir os tumores de morte e pacientes vivos nos conjuntos de treinamento selecionados ao acaso, usando os valores de expressão FC

gene CDKN3

obtido por RT-qPCR. Em resumo, com todo o conjunto da amostra, 500 conjuntos de treinamento de 60 amostras foram criados aleatoriamente. Para categorizar os

CDKN3

dados de expressão gênica quantificados por qRT-PCR, a análise ROC foi realizada em cada conjunto de treinamento. Esta análise foi feita para definir um ponto de corte para a expressão do gene que esses valores representados com a maior sensibilidade e especificidade para a diferenciação entre os pacientes que faleceram e sobreviventes. O conjunto da amostra inteira foi então analisada com o cut-off média, calculada a partir dos valores dos 500 conjuntos de treinamento. As amostras com

CDKN3

expressão do gene valores iguais ou acima do cut-off foram definidos como 1 e aqueles com valores abaixo do cut-off foram definidos como 0.

O tempo de sobrevida global acumulada foi calculado pelo método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. Estadiamento FIGO,

CDKN3

tipo expressão gênica e HPV foram incluídos em modelos de regressão de riscos proporcionais de uni e multivariada de Cox. A significância estatística entre as diferenças médias em linhas de células experimentos foi calculada com o teste t. Todos os testes foram 2 lados, e valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise dos dados foi realizada utilizando Sigma Stat e SPSS ver. 17 software.

Resultados

CDKN3

expressão genética no cancro do colo do útero

Os diagramas de caixa (Fig 1A) mostram claramente que

CDKN3

expressão foi significativamente mais elevada em CC do que no tecido saudável do colo do útero (FC = 6,4, P = 8 x 10

-6, teste MW). Além disso, quando as amostras de câncer foram agrupados de acordo com o status HPV16, uma diferença de expressão, em comparação com o grupo controle, foi mantido em ambos positivos para HPV16 CC (FC = 6,6; p = 8 x 10

-5, MW) e CC positivo para outros tipos de HPV (FC = 5; p = 8 x 10

-6, MW) (Fig 1A). Embora

CDKN3

expressão foi encontrado para ser regulados negativamente (FC 1) ou o valor FC foi igual ou inferior a 1,5 em 10,4% (n = 14) de tumores, principalmente de tumores positivos para os tipos de HPV com excepção HPV16 (p 0,05, teste do qui-quadrado; Fig 1B), estes dados suportam a conclusão de que

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expressão foi aumentado em mais independente CC do tipo de HPV

a expressão. de dependente de ciclina inibidor de quinase 3 (

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) foi medido por RT-qPCR em 25 amostras de cérvix saudáveis ​​normais e cancerosas 134 (CC) amostras cervicais positivos para o papilomavírus humano (HPV) 16 (n = 90) ou para outros tipos de HPV (n = 44), incluindo 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53, 58, 59, e 68. (a) Intensidade da expressão de genes, expressos em valores de log2, em diagramas de caixa . Os limites superiores e inferiores das caixas representam os percentis 75 e 25a, respectivamente. As linhas pretas e pontilhadas dentro das caixas representam os valores médios e médios, respectivamente, e os bigodes representam os valores máximos que se encontram dentro de 1,5x o intervalo interquartil a partir do final da caixa e mínimo. Os valores fora desta faixa são representados por círculos pretos. A mudança de dobragem (FC) foi calculado dividindo-se a mediana de cada grupo CC por a mediana do grupo de controlo. As diferenças estatísticas entre grupos foram calculados utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney. (B) Freqüência (%) distribuição de

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FCs, os quais foram calculados em cada tumor, considerando a mediana do grupo de controle.

Associação de

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expressão genética, estadiamento clínico e tipo viral com a sobrevivência

Nós investigamos se a regulação positiva de

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foi associada com a diminuição do tempo de sobrevivência em 121 pacientes CC, e se quaisquer efeitos sobre a sobrevivência eram dependentes de estágio clínico e tipo de HPV. Para estabelecer uma linha de separação entre os pacientes vivos e mortos e o valor potencial de

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expressão como um marcador para a sobrevivência, a FC média de corte foi calculada usando as curvas ROC (ver Materiais e Métodos). O ponto de corte média obtida foi de FC = 17. Das 121 amostras, 83 foram positivas para HPV 16 e 38 para outros tipos de HPV (S2 ​​tabela). O tempo médio de acompanhamento foi de 64 meses a partir do diagnóstico inicial. estágios clínicos (FIGO) dos 121 pacientes foram IA1 (n = 1), IB1 (n = 35), IB2 (n = 29), IIA (n = 7), IIB (n = 35), III-B (n = 9 ), e IV (n = 5). A sobrevida global de todos os pacientes foi de 71,9% e para estágios clínicos da FIGO IA1 /IB1, IB2, IIA, IIB, IIIB e IV foram 94,4%, 79,3%, 57,1%, 57,1%, 55,6% e 20%, respectivamente. Essas diferenças foram estatisticamente significantes (p = 1,2 x 10

-6, teste log-rank, S2A Fig).

Os pacientes com alta expressão de

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gene (FC ≥ 17