Sumário

cancro do pulmão de pequenas células Humano (SCLC) é altamente agressivo, e rapidamente desenvolve resistência à terapia. células SCLC são geralmente insensíveis aos glicocorticóides, devido à expressão do receptor de glucocorticóides auditivos (GR). Isto é importante porque temos mostrado anteriormente que a expressão de um transgene GR induz a morte celular

in-vitro

, e inibe o crescimento do tumor

in-vivo

. No entanto, o mecanismo subjacente para a perda de expressão de GR é desconhecido. A linha de células de SCLC, DMS79, tem baixa expressão de GR, em comparação com as linhas celulares não-SCLC e células epiteliais brônquicas normais. expressão retroviral GR nas células causados ​​DMS79 activação da via apoptótica como evidenciado pela indução marcada da actividade da caspase-3. a análise de metilação do promotor de GR revelados alguns metilação na 1D, 1E e promotores do gene GR, no entanto, o promotor constitutivamente activa 1C ubíqua foi fortemente metilada. No promotor 1C, houve um aumento altamente significativo na metilação do DNA em um painel de 14 linhas de células SCLC humanas em comparação com um painel de GR misturado expressando e não expressando as linhas celulares, e para as células mononucleares do sangue periférico. Além disso, dentro do painel de linhas celulares SCLC houve uma significativa correlação negativa observada entre a metilação do promotor 1C, e expressão da proteína GR. Reversão de metilação do gene GR com a inibição DNA metiltransferase causaram aumento mRNA GR e expressão da proteína em SCLC, mas não células não SCLC. Isto resultou em um aumento da sensibilidade Gc, diminuição da expressão de Bcl-2 e aumentou a actividade da caspase-3 em células SCLC. Estes dados sugerem que a metilação do ADN diminui a expressão do gene GR nas células SCLC humanas, de um modo semelhante ao usado para genes supressores de tumor convencionais

citação:. Kay P, Schlossmacher L, L Matthews, Sommer P, D Singh, Branco Um, et ai. (2011) Perda de glicocorticóides Receptor Expressão de DNA metilação Previne glicocorticóides induzida apoptose in Human pequenas células do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 6 (10): e24839. doi: 10.1371 /journal.pone.0024839

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Dezembro, 2010; Aceito: 22 de agosto de 2011; Publicação: 03 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Kay et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Investigação Biomédica NIHR Manchester e da Universidade de associação Manchester Alumni. PK e GS recebeu um prêmio studentship BBSRC (https://www.bbsrc.ac.uk). GS também tem uma bolsa de estudo dotados Barbara Mawer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Alterações no estado epigenético de genes são importantes em muitas doenças humanas, mas particularmente no câncer [1]. Alguns destes são mediados por alterações na expressão e actividade de DNA metiltransferases, DMNT1, DNMT3A DNMT3B e [2], [3]. As células cancerosas caracteristicamente têm hipermetilado ilhas CpG associados com genes supressores de tumor [1], e DNMT1 é relatado para ser sobre-expressos em pacientes com câncer de pulmão que fumam [4]. Estudos recentes identificaram que um agente cancerígeno fumo do tabaco, nitrosamina 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) 1-butanona (também conhecido como cetona nicotina nitrosamina derivado; NNK) não só induz a mutações do gene, mas também aumenta a hipermetilação de múltiplos promotores de gene supressor de tumor, incluindo ciclina dependente 2A inibidor de cinase (p16INK4a), morte associada proteína cinase 1 (DAPK1), e o receptor de ácido retinóico b (R a R b) [4]. O tabagismo é o principal fator de risco para o carcinoma de pulmão de pequenas células humanas, e fumar é em si associado com a metilação de mais de 20 genes supressores de tumor [5], [6].

Muitos fatores podem afetar a sensibilidade de glucocorticóides, incluindo genética variação no locus do gene GR, e expressão de proteínas que interagem [7] – [10]. Nós temos mostrado previamente que as linhas de células SCLC humanos são resistentes a glucocorticóides (GC) hormônios e drogas e que esta resistência é devido à expressão GR prejudicada [11], [12]. Restauração da expressão de GR nas células por transfecção, transdução virai ou é suficiente para restaurar a sensibilidade Gc [12]. No entanto, mais importante ainda, a restauração de expressão de GR também é suficiente para induzir a apoptose de células de SCLC, tanto in vitro [13], e também num modelo de xenoenxerto [14]. Isto levanta a possibilidade de que GR é um novo gene supressor de tumor de SCLC, e que a perda de expressão de GR está implicada na patogénese SCLC.

O gene GR (NR3C1) é, um factor de transcrição activado ligando expresso ubiquamente, uma membro da superfamília de receptores nucleares. Há um gene de cópia única no cromossoma 5, mas a sua estrutura é complexa e relativamente pouco se sabe sobre a transcrição é regulada a partir dele [15]. A transcrição é controlada por promotores 9, cada um associado com um local de início da transcrição alternativo. Sete destes promotores são agrupados em uma ilha CpG, uma característica comum dos genes housekeeping [16]. Todas as transcrições gerar autêntica proteína GR de comprimento completo como o local de início da tradução está localizado no exon comum 2.

O GR é ativado por hormônios Gc do córtex adrenal, sob um controlo apertado do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Este eixo está sob controle de gabarito no hipocampo e hipotálamo, através da activação da proteína GR expressa nestes sites. Variabilidade em ratos tom eixo HPA tem sido atribuída a mudanças na expressão de GR do hipocampo, regulada por metilação alterada do promotor GR rato exão 1-7 [17]. Esta situa-se, como no ser humano, na ilha CpG a montante. Estudos mais recentes têm examinado estado de metilação de um número de promotores alternativos GR humanos em células mononucleares do sangue periférico [16]. Estes estudos revelaram extenso, e metilação variável.

hipocampo e hipotálamo GR desempenha um papel fundamental no controlo de realimentação negativa do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. Expressão alterada GR no cérebro resulta em re-configuração do tom deste eixo neuroendócrino e isso está associado com a metilação alterado de fator de crescimento neural inducible-A (NGFI-A, ou Krox, EGR1) local de ligação no promotor exão rato 1,7 , o promotor homólogo ao exão 1F humano [17] – [19]. Esta alteração controlada metilação no GR expressão resulta em consequências para todo o organismo, regulando a produção de glicocorticóides adrenal.

Neste estudo examinou o padrão de metilação do promotor GR em células SCLC humanas, e mostrou que a reversão do metil marcas de aumento da expressão de proteínas GR, e função. Além disso, foi identificada uma correlação negativa entre GR 1C metilação do promotor e expressão da proteína GR através de um painel de linhas celulares SCLC humanas e células de controle humanos.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e manutenção

células de carcinoma humano A549 epiteliais do pulmão, HEK-293 células de rim embrionário humano, células de carcinoma cervical humano HeLa e células de osteosarcoma humano U20S (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, Reino Unido) foram cultivadas em DMEM (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) (Invitrogen).

não-pequenas linhas de câncer de pulmão de células NCI-H358 e -H727 (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, Reino Unido) e NCI-H23, -H441 , -H1299 (American Type Culture Collection, EUA) foram crescidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com FCS a 10% e HEPES 10 mM, tal como recomendado pelo fornecedor.

de pequenas células do cancro do pulmão (SCLC) linhas celulares usadas neste estudo foram linhas celulares, os 10’COR ‘Cor L24, L27 Cor, Cor L31, L32 Cor, Cor L42, L47 Cor, Cor l51, L88 Cor, Cor L99 e L103 Cor. Também foram DMS 79, DMS 153, HC12 e HX 148. Todas estas linhas celulares foram derivadas de pacientes com SCLC patologicamente confirmada usadas [20], [21], com a excepção de Co L32, que foi derivado de um paciente com pouco diferenciado carcinoma escamoso do pulmão. Esta linha celular que no entanto apresentam as características de SCLC [21]. Todas as linhas de células SCLC foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com FCS a 10% e HEPES 10 mM, como previamente descrito [12].

células mononucleares de sangue periférico humano foram obtidos a partir de dadores saudáveis ​​locais, de acordo com a aprovação LREC 09 /H1013 /6.

epitélio brônquico humano normal foi colhida a partir de amostras de ressecção pulmonar após a cirurgia para câncer de pulmão, com total, consentimento informado do doente.

Tratamentos

Quando apropriado, as células foram tratadas com o veículo ou 100 nM de dexametasona (Sigma-Aldrich) durante 24 horas a 37 ° C, 5% de C0

2 antes da lise. Em algumas experiências, as células foram incubadas com 5 ^ M ou veículo 5’Azadeoxycytidine (Sigma-Aldrich) durante 72 horas ou 5 dias. Após o tratamento com 5’Azadeoxycytidine algumas células foram tratadas durante mais 72 horas com 100 nM de dexametasona.

A análise de imunotransferência

As células foram lisadas usando 1 × tampão RIPA (Tris base 100 mM, 150 mM de NaCl, 1% Igepal, 2,5% de desoxicolato de sódio, EDTA 1 mM) .Esta tampão também continha os inibidores de proteases (Roche). Após centrifugação durante 30 min a 10.000

g

os sobrenadantes foram colhidos e analisados ​​quanto ao teor de proteína utilizando um ensaio de Bradford (Bio-Rad). As amostras foram então diluídas em tampão de carga [M 0,125 TrisCl (pH 6,8), 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 20% de glicerol, 0,2% β-mercaptoetanol, 0,001% bromophenolblue]. Os extractos celulares (50 ug) foram então analisadas por SDS-PAGE e Western blotting tal como descrito [22], [23]. Os anticorpos primários utilizados foram o monoclonal de rato anti-hGR (Clone 41, 1:2500), que se liga na região N-terminal de GR (BD Biosciences), anticorpo policlonal de coelho anti-hGR (P-20, 1:500) criado contra um mapeamento peptídico na extremidade C-terminal de GRα (Santa Cruz) e o rato monoclonais α-tubulina (1:5000) (Sigma-Aldrich). Os anticorpos secundários utilizados foram a peroxidase de rábano conjugado com anti-rato (1:5000) e anti-coelho (1:5000) (GE Healthcare). Para quantificar os níveis de proteína, a análise densitométrica foi realizado. As manchas foram digitalizados e a densitometria de cada banda foi analisada utilizando software ImageJ. O controlo de carga interno (αTubulin) também foi quantificada e os resultados foram normalizados contra estes leituras. Esta análise foi realizada em 3 manchas separadas para cada experiência e a média calculada.

Gene Repórter Assays

As células foram co-transf ectadas com 2 ug de um construto TAT3-luciferase [13] e 0,5? g de um

Renilla

constructo de luciferase pCMV- (para corrigir a eficiência de transfecção), utilizando Fugene 6 (Roche). Em alguns casos, as células também foram transfectadas com 1 ug de um vector de expressão de GR (pFUNC1-GR-EYFP) [13]. As células foram tratadas com DEX como descrito antes ensaios de luciferase foram efectuados utilizando o Sistema de Ensaio Repórter de Luciferase duplo (Promega), como previamente descrito [8].

infecções retrovirais

pFUNC1-EYFP ou pFUNC1 -GR-EYFP foram transfectados em células HEK293 para a produção retroviral usando Fugene HD (Roche, Reino Unido), como um reagente de transfecção numa proporção 03:02 reagent:DNA. A infecção de partículas retrovirais para células DMS 79 foi realizada como descrito antes. após a infecção, as células foram cultivadas em meio de crescimento normal contendo soro durante 72 horas.

caspase-3 clivada ensaio

DMS 79 células que expressam GR-EYFP ou EYFP foram aplicados a poli-L-lisina revestidos lamelas e fixada com formaldeído a 4%. As células foram permeabilizadas com PBS /0,2% de Triton- × 100. Após lavagem, as células foram bloqueadas em PBS /0,1% de soro de burro de Tween-20 + 5%. Anti-caspase-3 activa Pab (Promega, UK) diluído em tampão de bloqueio 1:250 foi adicionado às células e incubado durante a noite. incubação do anticorpo secundário foi realizada no escuro usando Alexa Fluor 546 de burro anti-IgG de coelho (Invitrogen, UK) diluído em PBS 1:500. As lamelas foram montadas usando Prolongar ouro com DAPI (Invitrogen, UK).

As imagens foram coletadas em um microscópio vertical Olympus BX51 usando um 60 × /1,40 UPlanApo objetiva e capturado usando uma câmera CoolSnap ES (fotométricos) através MetaVue software (Molecular Devices). conjuntos de filtros passa-banda específicas para DAPI, FITC e vermelho Texas foram usadas para prevenir a sangrar através de um canal para o outro. As imagens foram processadas e analisadas utilizando o ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij).

A sequenciação de bissulfito de sódio

O ADN genómico foi extraído de várias das linhas celulares utilizadas no neste estudo, alguns dos quais tinham sido tratados com 5 ‘Azadeoxycytidine (ver resultados) utilizando o kit de sangue e tecido DNeasy (Qiagen). DNA genómico purificado foi então convertido bissulfito utilizando o Kit Epitect bissulfito (Qiagen). Este ADN foi então convertido usado como um modelo na reacção de PCR para amplificar regiões específicas do promotor GR. regiões promotoras GR amplificado (e) os iniciadores utilizados foram os seguintes:

Promotor

1C (prospectivas 5′-AGGTGGATCCGGAAGGAGGTAGYGAGAAAAGAAATT-3 ‘; 5′-reversa AGGTGAATTCACACRAACTCRCAAAATAAAAAAAA-3’).

Promotor

1D (forwarder 5′-AGGTGGATCCTTTTATAAAAATTTTTTTGGTTGAGG-3 ‘; reversa 5’- AGGTGAATTCCCCCCTACTCTAACATCTTAAAAA).

Promotor

1E (forwarder 5′-AGGTGGATCCTTAGAGTTATAAAAATTATAATTTGTGT-3.. ‘; reversa 5′-AGGTGAATTCATACAAACAACTTTAAAATACCAAC-3’)

Todos os iniciadores foram fornecidos pela MWG-Eurofins

a PCR foi realizada utilizando Immolase polimerase (Bioline) , seguindo as instruções do fabricante. As condições de amplificação foram como se segue: 95 ° C durante 10 minutos, 30 ciclos, a 95 ° C durante 30 segundos, a 56 ° C durante 45 segundos, e a 72 ° C durante 30 segundos, o que foi seguido por uma extensão final de 72 ° C durante 10 minutos.

produtos de PCR foram sujeitos a electroforese num gel de poli-acrilamida e purificado utilizando um kit de extracção em gel (Qiagen). As ligações foram, em seguida, levada a cabo utilizando estes fragmentos de PCR utilizando o sistema de vector pGEM-T-Easy (Promega), seguindo as instruções do fabricante. Após a transformação em bactérias competentes JM-109 (Promega), as colónias foram colhidas e incubadas durante a noite em caldo LB a 37 ° C. Mini-preps (Qiagen) foram efectuados sobre estes suspensões de células, seguido de uma digestão de restrição usando EcoRI (Roche) para confirmar a presença do inserto correcto. Os plasmídeos contendo a inserção foram então enviados para a sequenciação, utilizando um iniciador SP16 na Instalação de sequenciação de DNA, Universidade de Manchester. Um estudo inicial foi realizado para analisar a metilação potencial e os efeitos de 5’Azadeoxycytidine, utilizando ADN proveniente de células DMS 79. Neste caso, um clone foi analisado para cada condição (cada um promotor regulável, não tratado ou tratado com 5’Azadeoxycytidine). Um estudo mais aprofundado foi realizado para analisar a metilação do promotor 1C, com um painel de linhas de células SCLC. Neste caso, 3 clones foram analisados ​​por linha celular.

Estatísticas

Toda a análise estatística foi realizada usando SPSS para Windows versão 16. análise estatística adicional foi realizado para comparar os níveis de metilação pelo Dr. Steve Roberts, da Universidade de Manchester; utilizando um modelo de regressão linear. A equação utilizada para esta análise foi a seguinte:

Resultados

A expressão de GR é prejudicada na linha de células SCLC humana, DMS79

proteína

GR foi medida na célula hSCLC linha, DMS79 e comparados com duas células sensíveis linhas Gc, HeLa e A549, e duas células resistentes linhas Gc, U2OS e HEK293. A linha de células SCLC DMS79 expressa níveis baixos de proteína GR, semelhante para as células U2OS e, claramente, muito menos do que a células HeLa e A549 (Fig. 1a). A comparação com um painel de linhas de células SCLC não indica que a expressão de GR é menor nas células SCLC (Fig. 1b). GR proteína foi encontrada para ser expressa no epitélio bronquial humano normal, colhido a partir de tecido de pulmão de ressecção de cancro do pulmão (Fig. 1C).

(A) análise de transferência de Western de GR, e a expressão da proteína tubulina em U20S, HEK, células HeLa, A549 e DMS 79 células. Blot representativa de 3 experiências separadas. (B) Comparação da expressão da proteína GR entre SCLC, e linhas de células SCLC não-(NS). A quantificação da expressão de GR relativamente a tubulina é apresentado como média +/- E.P.M. (N = 3) com * indica P 0,05, teste t de Student para amostras independentes. (C) Comparação da expressão da proteína de GR no epitélio bronquial humano normal (NBE) em relação à linha de células SCLC não-(A549), e um painel de linhas de células SCLC humanas. A quantificação da expressão de GR relativamente a tubulina é apresentada. A média de n = 2. (D) Análise de expressão de proteína GR utilizando um anticorpo pan-GR criados contra o terminal N GR (N-terminal), e um anticorpo específico GR GRalpha criado contra o terminal C (C-term).

GR migrou como duas espécies principais, ea abundância relativa parecia diferente entre tipos de células (Fig. 1a, b). Isso pode refletir splicing alternativo para a isoforma GRβ, ou uso de tradução alternativa local de início [22] – [24]. Para caracterizar ainda mais a espécie, imunoblots foram repetidos utilizando um anticorpo específico para o terminal C, que reconhece especificamente GRα (Fig. 1d). O padrão de bandas semelhante ao observado com os dois anticorpos indica ambas as proteínas compartilham um domínio do terminal C comum, sugerindo que a diversidade de proteínas encontra-se com o uso de tradução alternativa local de início.

Restauração de expressão GR induz a apoptose

em células DMS79 expressão de um transgene GR-EYFP por infecção retroviral resultou num aumento da proteína GR-EYFP (Fig. 2a) e a apoptose tal como evidenciado por um aumento da caspase-3 clivada nas células SCLC que expressam o GR-EYFP (Fig. 2b). Nestes estudos, apenas uma minoria de células transduzidas são efectivamente, por conseguinte, a fraca abundância de proteínas de fusão expressas na piscina de células. Além disso, a expressão do transgene a apoptose induzida, reduzindo ainda mais a concentração de GR-EYFP em lisados ​​de células agrupados [13], [14].

células (A) DMS 79 foram infectadas quer com GR-EYFP ou EYFP retrovírus e proteína GR avaliada às 72 horas. células (B) DM79 tratados como acima foram fixados para imuno-histoquímica para detectar a caspase-3 clivada. As células foram coradas para a caspase-3 activado e, em seguida, analisadas para a co-localização com qualquer GR-EYFP ou EYFP. Percentagem de células positivas para a caspase-3 clivada e EYFP ou GR-EYFP. As contagens de células derivadas a partir de 3 infecções independentes e representada como percentagem de caspase-3 para EYFP positivo positivo como média +/- E.P.M. (N = 3) com *** indica p 0,001, teste t de Student para amostras independentes

Padrão de metilação do promotor de GR em células SCLC

A diminuição da expressão de GR. células SCLC podem resultar de alteração na metilação do promotor de GR, ou de um mecanismo indirecto. Portanto estado de metilação dos promotores de GR nas células DMS79 foi examinada por sequenciamento de bissulfito. Nós não detectar qualquer metilação do DNA nos promotores 1B e 1F. O 1D e 1E promotor cada um tinha apenas um único metil CpG, marcado com uma caixa aberta (Fig. 3a, b). Em contraste, o promotor 1C teve quatro CpGs de metilo (Fig. 3C). Os CpGs metilados observados estão localizados em locais de ligação do factor de transcrição potencial, (CpGs 6, 44 e 52), ou se encontram perto um tal site (CPG 69) (Fig. 3C).

bissulfito sequenciamento foi realizado em ADN genómico extraído a partir de 79 células incubadas com DMS 5’Azadeoxycytidine durante 5 dias (não tratadas como controlo). A sequência original (obtido a partir do browser GENOMA) foi comparada com a tratada com bissulfito a partir de ADN de controlo e amostras tratadas com 5’Azadeoxycytidine. Ousado, caixas abertas destacar CpGs metilados específicos, que mostraram reversão de metilação após 5’Azadeoxycytidine incubação. O potencial fator de transcrição locais em estreita proximidade com os locais metilados de ligação são indicados por sombreamento cinza para o sítio de ligação SP1 e sombreamento cinza escuro para o sítio de ligação C /EBP. metilação (A) de CpG na região promotora do GR 1D em células DMS 79. CpGs individuais são numeradas e nas capitais. (B) a metilação de CpG em uma região do promotor a partir de DMS 1E GR 79 de ADN genómico. CpGs individuais são numeradas e nas capitais. (C) O ADN genómico a partir de uma região do promotor a partir de células 1C GR DMS 79. CpGs individuais são numeradas e nas capitais. O texto em itálico indica o início de 1C exão.

linhas de células SCLC aumentaram metilação do promotor de GR 1C

Para determinar se as mudanças observadas na metilação do promotor GR foram encontrados em outro ser humano CPPC linhas celulares, um painel de 14 hSCLC linhas celulares com diferentes expressão GR foram comparadas com duas linhas de células que expressam GR, células mononucleares do sangue periférico (A549 e HeLa) um expressando sem linha de células, (U2OS), e como uma comparação de células primárias (Fig. 4a, b). As contas representam dinucleótidos CpG da posição 1 para a posição 69. É facilmente perceptível que há metilação frequente nas duas últimas esferas do lado direito, que representam CpG 68 e 69. Este está presente em todo o painel de células SCLC, e também é visto nas células de controlo. No entanto, também há um aumento acentuado na metilação nas posições 1-67 em todo o painel de SCLC, sem qualquer agregação notável. Em contraste, há muito pouco metilação CpG visto nas posições 1-67 no painel de células de controlo (Fig. 4a, b).

O ADN genómico foi extraído de linhas de células de controlo específica (A), incluindo o sangue periférico primário leucócitos mononucleares a partir de um dador saudável e (B) 14 linhas celulares hSCLC. Após a conversão de bissulfito região do promotor de 1C foi amplificado por PCR. 3 clones por linhagem de células foram então sequenciados. A metilação no painel de linhas de células SCLC e linhas de células de controlo é apresentado como “grânulos”. Cada grânulo individual representa um único CpG no promotor GR 1C em ordem numérica da esquerda para a direita. contas brancas indicam CpGs não metiladas, enquanto grânulos pretos indicam CpGs metilados. Todos os 3 clones são exibidos para cada linha de células analisadas.

A regressão logística foi utilizado para comparar a metilação entre o painel SCLC, e todas as células de controlo (Tabela 1). Este revelou que houve uma diferença significativa entre os grupos com metilação na CpG 69 individualmente; e com CpG 68 e 69 em combinação, e em toda a região promotor inteiro. Também foi observada uma diferença significativa entre os grupos para todos os CpGs excluindo 68 e 69 (Tabela 1).

metilação do promotor GR está correlacionada com a expressão GR

Em todas as linhas de células hSCLC lá era uma grande variedade de expressão de GR, embora em todos os casos GR foi menos abundante do que no HeLa e linhas celulares de controlo A549 (Fig. 5a, b). Há também uma variação marcada na abundância das duas espécies proteicas GR através das linhas celulares examinadas, mas para esta análise de ambas as isoformas de proteínas de GR foram consideradas em conjunto. A relação entre a metilação do promotor de GR 1C e expressão da proteína de GR foi examinada através de todo o painel de linhas celulares hSCLC. Houve uma correlação significativa entre o número de CpG metilados, ea expressão da proteína GR dentro do painel de linhas celulares hSCLC; r

2 = 0,54 e p = 0,01 (Fig. 5c).

(A) blot Representante ocidental para GR e tubulina em 10 linhas de células SCLC, bem como linhas celulares de controlo HEK (rim embrionário humano ), U2OS (osteossarcoma), HeLa (carcinoma cervical) e A549 carcinoma (pulmão de células não pequenas). (B) A densitometria foi levada a cabo em 5 manchas separadas para quantificar os níveis de expressão de GR relativos à tubulina. Gráfico mostra a média, expressão GR corrigida ± S.E.M. (C) Relação entre a metilação do promotor de GR 1C e expressão de GR num painel de linhas celulares de cancro do pulmão humano. metilação global (percentagem) em 1C promotor foi plotada contra a expressão GR, com erro padrão, para cada linha de células. A linha de regressão foi significativamente diferente de zero (P = 0,01), e a qualidade do ajuste foi de r

2 = 0,54.

Restauração de expressão GR pela reversão de metilação do DNA

Se a perda de expressão de GR nas células DMS79 resultou da metilação do DNA, talvez consequente a carcinogénese, expressão GR seria previsto a aumentar após a reversão de metilação. Após 72 horas de tratamento com 5’Azadeoxycytidine, os níveis de ARNm GR aumentou drasticamente em células DMS79 quando em comparação com células HEK e A549 em que não há alterações na expressão foram observados (Fig. 6A). Além disso, após 72 horas, ou depois de 5 dias de incubação com 5’Azadeoxycytidine, havia um aumento notável na proteína GR (Fig. 6b). Em contraste com o aumento na expressão de GR visto em DMS79, houve menor expressão em células U2OS, possivelmente devido à toxicidade (Fig. 6b).

expressão (A) mRNA de GR normalizadas para GAPDH em resposta a 72 horas tratamento com 5’azadeoxycytidine (5’Aza) em DMS 79 células, células HEK deficiente GR, e as células que expressam A549 GR. linhas celulares deficientes (B) Dois GR, DMS 79 e U2OS, foram tratados com 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) durante 72 horas e 5 dias (células não tratadas como controlo). Os lisados ​​foram então analisadas por western blot para a expressão de GR. Para as células DMS 79, a expressão GR foi normalizado contra tubulina α, e plotados como a expressão média GR além S.E.M. (N = 3). * Indica P 0,01 comparado com o controlo tratado com veículo. (C) Um painel de linhas de células SCLC humanas (painel superior) foi comparado com um painel de linhas de células SCLC não-(painel inferior) para a resposta da proteína de GR a incubação com 5’Azadeoxycytidine (5’Aza).

o efeito de 5’Azadeoxycytidine foi então comparados em linhagens de células e linhas de células SCLC não SCLC humano para determinar se a regulação da expressão de GR por metilação foi difundida no cancro do pulmão. Três das quatro linhas de células SCLC demonstraram um aumento de expressão de GR 5’Azadeoxycytidine após o tratamento, em comparação com apenas uma das quatro linhas de células SCLC não (Fig. 6c).

O aumento na expressão de GR visto em DMS79 células está previsto para restaurar a sensibilidade GC para estas células. Com efeito, não foi aumentada Gc transactivação de um gene repórter simples (Fig. 7a). A magnitude de indução Gc era consideravelmente menor do que o observado com a sobre-expressão de GR, mas esta última não resultar em concentrações GR supra- fisiológicas em células alvo (Fig. 7a).

(a) Tratamento de células com DMS 79 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) restaura a sensibilidade Gc. DMS 79 células tratadas com 5’Aza durante 72 horas foram transfectadas com a construção repórter TAT3-luciferase. As células foram então incubadas durante a noite com ou sem 100 nM de dexametasona. Gráfico mostra a variação média vezes (DEX tratada /não tratada), (unidades relativas de luz), (triplicado) mais o S.E.M. (* = P 0,05). DMS células 79 foram também co-transfectadas com pFUNC1 GR-EYFP (como controlo positivo) e a construção repórter da luciferase-TAT3. As células foram então incubadas durante a noite com ou sem 100 nM de dexametasona. Gráfico mostra a variação média vezes (dex tratada /não tratada) mais o S.E.M. Todos os resultados foram normalizados contra um controlo de Renilla. Os resultados são representativos de 3 experiências separadas. (B) de Bcl-2 para a expressão de ARNm de GAPDH normalizada em resposta a 72 horas de tratamento com 5’Azadeoxycytidine (5 ‘AZA) em células HEK DMS79 e. (C) O tratamento de células com Aza e, em seguida, dexametasona resulta em apoptose. Imagem representativa de células SCLC (CORL47) e células não-SCLC (NCI-H358) tratados com Aza como descrito acima. As células foram então tratadas com dexametasona, durante 72 h, fixadas e coradas para a caspase-3 activa. (D) A desmetilação conduz ao aumento acentuado no GC apoptose mediada em células de SCLC em comparação com células não-SCLC. Apoptose medida por activação da caspase-3 e depois 5’Aza dexametasona como descrito acima. barras cinzentas representam células tratadas com dexametasona, barras pretas para células tratadas com 5’Aza e, em seguida, com dexametasona. Cada linha celular foi incubada em triplicado e 100 células contadas para avaliar% coloração positiva. Teste t de Student independente * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p . 0,001

O aumento da expressão de GR em resposta ao tratamento com 5’Azadeoxycytidine resultou em supressão do gene de Bcl-2 pró-sobrevivência em ambos HEK, células e DMS79 (Fig. 7b). Há também foi aumentada clivado a activação da caspase-3 nas células de SCLC, mas não as células não-SCLC (Fig 7c . 7d). É importante notar que, após 5 dias de incubação com 5’Azadeoxycytidine houve indução de morte celular, possivelmente devido à reaquisição da expressão de GR, ou de regulação de outros genes de sobrevivência.

Discussão

epigenética distúrbios estão implicados em muitas doenças de humanos, incluindo o cancro. O fumo do cigarro é o principal agente de promoção ambiental SCLC e, recentemente, um carcinogéneo fumo do cigarro, NNK, tem sido mostrado que exerce um efeito específico que promovem a expressão DNMT1, e actividade [4]. Por conseguinte, esta substância cancerígena pode actuar através da indução de alterações epigenética em genes importantes envolvidos na patogénese do cancro.

Demonstrámos previamente que o receptor de glucocorticóides é efectivamente um gene supressor do tumor de SCLC, cuja expressão é inibida [12] . Nós estendemos a análise neste estudo com mais provas de que a expressão de GR é inferior em um painel de células SCLC em comparação com células não-SCLC ou células epiteliais brônquicas normais. Reaquisição de expressão GR, e sensibilidade de glucocorticóides em células SCLC

in vitro

, ou em tumores de xenoenxerto resulta em apoptose [13], [14]. GR é expresso na maioria das células e tecidos, e exerce efeitos pleiotrópicos nas células. No entanto, pouco se sabe sobre como a expressão do gene GR é regulamentada, já que tem uma estrutura promotor extraordinariamente complexa. Estudos mais recentes em células mononucleares do sangue periférico primários definidos padrões altamente individuais de promotor de GR metilação [16]. Este trabalho também mapeada potencial, e comprovada factor de transcrição aos sítios dentro dos promotores de ligação, a maioria dos quais continham locais CpG que podem ser metilados. Isto sugeriu que a metilação diferencial do promotor de GR humano é um mecanismo para controlar a utilização do promotor e assim a expressão do gene GR.

Três GR promotores foram analisados ​​na linha celular de índice, DMS79, e todos os três continham locais CpG metilados . Uma análise adicional foi realizada sobre o promotor 1C como tem sido mostrado a ser expressa ubiquamente em todos os tecidos testados, incluindo pulmonar [15]. Houve um aumento óbvio e muito significativa em CpG metilação através de um painel de linhas celulares hSCLC em comparação com a linha de células A549 não SCLC. É importante notar que não houve aumento nas duas linhas celulares que não expressam controlo (U2OS e HEK293), indicando que a metilação do promotor 1C não é necessária para limitar a expressão de GR, mas que outros mecanismos podem ser aplicadas para regular a expressão de GR em diferentes tipos de células. Uma comparação mais ampla entre as células e um painel hSCLC heterogénea de GR expressar, e linhas celulares que não expressam também encontrado um aumento altamente significativo em locais CpG metilados nas células hSCLC.