Abstract

Fundo

O câncer de próstata (PAC) é a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos. terapia de privação de andrógeno é inicialmente eficaz no tratamento PAC, mas CaP repete apesar níveis de castração de andrógenos circulantes. expressão continuada do receptor de andrógeno (AR) e seus ligantes tem sido associada ao crescimento CaP castração recorrente.

principal achado

Neste relatório, o ARΔ142-337 dominante negativo dependente do ligando (ARΔTR) foi expressa em modelos de células tumorais e CWR-R1 castração recorrente para elucidar o papel da sinalização da AR. Expressão de ARΔTR diminuição do crescimento do tumor CWR-R1 na presença e ausência de testosterona exógena (T) e melhorou a sobrevivência na presença de T. exógeno Houve evidência para selecção negativa de ARΔTR transgene em ratinhos t-tratados. espectrometria de massa revelou níveis de castração recorrente CaP dihidrotestosterona (DHT) são suficientes para ativar AR e ARΔTR. Na ausência de testosterona exógena, as células CWR-R1-ARΔTR e controle apresentaram perfis de andrógenos alterados que implicadas células capa epitelial como fonte de ligantes AR intratumorais.

Conclusão

O estudo fornece

in vivo

evidência de que a ativação da sinalização da AR por ligantes AR intratumorais é necessária para o crescimento CaP castração recorrente e que as células epiteliais CaP produzir andrógenos ativos suficientes para Cap recorrência durante a terapia de privação de andrógeno. Segmentação síntese de DHT intracrine T e deve fornecer um mecanismo para inibir a AR e crescimento de Cap castração recorrente

Citation:. Titus MA, Zeithaml B, Kantor B, Li X, Haack K, Moore DT, et al. (2012) dominante negativo receptor andrógeno Inibição da Intracrine crescimento andrógeno-dependentes da castração-recorrente do cancro da próstata. PLoS ONE 7 (1): e30192. doi: 10.1371 /journal.pone.0030192

editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de setembro de 2011; Aceite: 15 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Titus et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por PO1-CA77739 e 2RO1 DK058702-10 do Instituto Nacional do Câncer e Instituto Nacional do Câncer Cancer Center Suporte Grants CA016156 e CA034026 a Roswell Instituto Parque Câncer e da Universidade da Carolina do Norte, respectivamente, US Public Saúde Subsídios para Serviços HD16910 do Instituto Nacional de Saúde infantil e Desenvolvimento Humano, National Institutes of Health (NIH) e do Departamento de Defesa Prostate Cancer Research Program W81XWH-10-1-0273. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (CaP) é o câncer mais comum não-pele diagnosticados em homens americanos. Apesar de detecção precoce e tratamento melhorado, mais de 33.000 mortes são esperados em 2011 [1]. Durante décadas, a terapia de privação de andrógeno tem sido o tratamento preferencial para CaP localmente avançado ou metastático. terapia de privação de andrógeno é eficaz inicialmente, mas remissões são temporários. CaP que se repete responde mal à maioria dos tratamentos e quase todos os homens sucumbem à doença. Um papel molecular para o receptor de andrógeno (AR) na transição para CaP castração recorrente é suportado pela expressão contínua de AR [2] – [4] e genes regulados por andrógenos [5]

Muitos mecanismos. contribuir para a AR transativação apesar níveis de castração circulantes andrógenos testiculares (revisado por Feldman [6]). No entanto, outros estudos, incluindo o nosso próprio demonstraram que CaP castração recorrente mantém os níveis de tecido de dihidrotestosterona (DHT) suficiente para activar AR [4], [7] – [9]. testosterona tecido persistente (T) e DHT durante terapia de privação de androgénio pode derivar a partir de androgénios supra-renais, tais como a desidroepiandrosterona (DHEA) e androstenediona [7], de androstanodiol através da via secreto de síntese DHT [10], [11] e /ou

de novo

de produção a partir do colesterol [12]. No Tampão castração-recorrente, AR induz a expressão andrógeno-dependentes de antígeno específico da próstata e da protease transmembranar, serina 2-v-ets vírus da eritroblastose E26 homólogo oncogene, TMPRSS2:ERG [13]. Um relatório recente demonstrou que 70% dos homens com CaP castração recorrente respondeu a acetato de abiraterona, um citocromo P450 17α-hidroxilase /liase (CYP17A1) inibidor andrógeno biossíntese. A actividade antitumoral de acetato de abiraterona em estudos clínicos sugere que a inibição do citocromo P450 17α-hidroxilase /liase (CYP17A1) diminui AR sinalização activados por ligando no tampão castração recorrente [14].

células CWR-R1 utilizados em o presente estudo são provenientes de xenoenxerto CWR22 castração recorrente [15], expressar o mutante AR-H874Y [16] e proliferar num meio com privação de androgénio. AR é composta de um domínio NH

2-terminal de transactivação, um domínio de ligação de ADN central, e um domínio carboxilo-terminal de ligação ao ligando (LBD) [17]. AR é de comprimento completo em células CWR-R1 derivados do CWR22 de xenoenxerto de cancro da próstata humano, mas é susceptível a degradação proteolítica durante a extracção para um grande kDa forma ~ 80 [18]. AR atividade transcricional é mediada por funções de ativação no NH

2-terminal e LBD. Uma propriedade única de AR é que T ou DHT induzir uma

2 e carboxi-terminal (/C N) interação NH [19] mediada pela NH

2-terminal motivo FXXLF [20] que retarda a dissociação do ligando e degradação AR. Um papel de NH

domínio 2-terminal na regulação de genes [21] – [24], também tem sido relatado para a sinalização de AR não genómico [25]

No presente estudo, CWR-R1. as células foram manipuladas utilizando lentivírus para sobre-expressar o AR humano com uma deleção dos resíduos de activação NH

2-terminais 142-337, que resulta em um AR negativo dominante transcricionalmente inactivo. O mutante de supressão de AR humana ARΔ142-337 (ARΔTR) liga-se o ligando com uma afinidade elevada, mas é transcricionalmente inactiva na ausência ou na presença de androgénio [26]. O mecanismo da actividade dominante negativa é heterodimerização com AR endógeno para evitar a transactivação de genes alvo [27]. Os resultados sugerem que intratumoral T e síntese de DHT induz o crescimento do tumor dominante ARΔTR negativo inibição AR dependente CWR-R1. O perfil de andrógeno de tumores CWR-R1 ΔTR-transduzidas na ausência de T suportam a hipótese de que as células epiteliais CaP produzir ligantes AR num modelo murino com baixa de andrógeno adrenal indetectável.

Resultados

ARΔTR inibe transativação AR e proliferação celular CWR-R1

o efeito da síntese de andrógenos intracrine e inibição ARΔTR de Cap Growth AR ea castração recorrente endógena foi determinada em células CWR-R1 derivados do CaP CWR22 humana castração-recorrente xenotransplante. células CWR-R1 transduzidas com lentivírus expressando ARΔTR ou LacZ sob o controlo do promotor de CMV apresentou elevada expressão (Fig. 1). A eficácia de inibição ARΔTR de actividade transcricional AR foi determinada utilizando MMTV-Luc transfectado em células CWR-R1 transduzidas por lentivírus na ausência e na presença de 0,1 nM de DHT porque o gene repórter antigénio-luciferase específico da próstata é apenas fracamente activado por AR endógeno [10], [21], [28]. Adição de 0,1 células CWR-R1 nM de DHT-LacZ transduzidas aumento da actividade da luciferase por três vezes (Fig. 2). Sob as mesmas condições, a actividade de luciferase em células CWR-R1-ARΔTR transduzidas era baixa, com ou sem 0,1 nM de DHT, uma concentração de androgénio que maximamente estimula genes regulados de androgénio em células CWR-R1 [29]. Os resultados demonstram um efeito negativo dominante sobre a transactivação de ARΔTR AR endógena de MMTV-Luc na ausência e na presença de DHT.

análise de transferência de Western de lisados ​​de proteína CWR-R1 (20 ug) demonstraram que a RA endógeno (H

r 110 kDa, pistas 1-2) é detectado em ambos os ARΔTR e LacZ transduzidas células CWR-R1 usando anticorpo policlonal AR cabra. LacZ (H

r 60,5 kDa, pista 1) expressão é observado apenas nas células CWR-R1 LacZ-transduzidas utilizando anticorpos LacZ policlonal de coelho e expressão ARΔTR (H

r 84 kDa, a pista 2) é detectado usando cabra AR anticorpo policlonal de células CWR-R1-ARΔTR transduzidas. Endógena β-actina foi detectado utilizando o anticorpo monoclonal de ratinho β-actina AC-15 (H

r de 43 kDa, as pistas 1 e 2) e serviu como controlo de carga para ambos ARΔTR e células CWR-R1 LacZ transduzido.

células CWR-R1 foram transientemente transfectadas com o repórter luciferase e MMTV-testados quanto a actividade da luciferase na presença e ausência de DHT. Na presença de 0,1 nM de DHT, células CWR-R1 que expressam o transgene LacZ demonstraram um aumento na actividade repórter MMTV-luciferase em comparação com células de controlo sem DHT. Expressão de ARΔTR reduzida actividade repórter MMTV-luciferase na ausência ou na presença de 0,1 nM de DHT em comparação com células de controlo transduzidas de LacZ-. As colunas representam a actividade de luciferase média em unidades relativas de luz a partir de 3 expericias independentes; barras ± desvio padrão.

A inibição da transactivação por AR endógeno ARΔTR na ausência da adição de DHT levantou a possibilidade de que os ligandos endógenos de AR induzida ARΔTR dimerização [30] e heterodimerização entre ARΔTR e endógeno de comprimento completo AR [31]. A cromatografia líquida espectrometria de massa em tandem análise demonstrou 3,38 ± 0,26 fmol T /milhão de células (n = 4) e 1,84 ± 0,16 fmol DHT /milhão de células (n = 4) (Fig. 3). Uma vez que a dimerização AR e de ligação ao ADN de androgênio-dependente [30], os resultados sugeriram que a actividade inibidora ARΔTR pode servir como um indicador substituto da androgénios activos intracelulares.

DHT foi medida em células CWR-R1 cultivados sem suplementos media ou exógeno T utilizando espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida. cromatograma representativo de DHT (painel esquerdo, DHT pico a 7,26 min), utilizando 10 milhões de células CWR-R1 (n = 4). A concentração média de DHT foi de 1,84 ± 0,16 fmol /milhão de células CWR-R1. Controlo calibrador cromatograma de DHT padrão que mostra pico a 7,29 min (painel da direita).

O efeito de ARΔTR na expressão do gene dependente de androgénio NKX3.1 [32] foi avaliada adicionalmente para caracterizar a actividade inibidora de ARΔTR na sinalização AR. A adição de DHT diminuiu os níveis de proteína em células NKX3.1 CWR-R1-ARΔTR transduzidas (Fig. 4), mas aumentou NKX3.1 proteína em células de controlo CWR-R1-LacZ transduzidas. A adição de DHT aumento da proliferação celular CWR-R1-LacZ, mas não houve aumento na proliferação celular CWR-R1 ARΔTR transduzidas. Na ausência de células CWR-R1 DHT, ambos LacZ- e ARΔTR-transduzidas adicionados exibiram proliferação mínima (Fig. 5).

A análise de imunotransferência de lisados ​​de proteína de célula CWR-R1 (20 ug) determinada NKX3.1 a expressão da proteína, utilizando o anticorpo policlonal de cabra, na presença ou ausência de 1,0 nM de DHT. NKX3.1 (

r 35,5 kDa H) proteína foi aumentada em células CWR-R1-LacZ transduzidas com a adição de DHT (pistas 1 e 2). ARΔTR-transduzidas células CWR-R1 apresentaram a diminuição da expressão da proteína NKX3.1 na presença de DHT (pistas 3 e 4). Endógena β-actina (M

r 43 kDa) foi utilizado como controle de carga (pistas 1-4).

A proliferação celular foi determinada utilizando XTT

ensaio R e monitorização da absorvância a 490 /690 nm em triplicado do dia 1 ao dia 8 (média ± desvio padrão). células CWR-R1 expressando ARΔTR (diamante e preto linha sólida) ou LacZ (praça sólida e linha cinza) transgene na ausência de 0,1 nM DHT mostrou curvas de crescimento semelhantes (painel superior). crescimento celular CWR-R1 na presença de 0,1 nM de DHT, ARΔTR-transduzidos diminuíram em comparação com células de controlo CWR-R1-LacZ transduzidas (painel inferior).

ARΔTR inibe o crescimento do tumor CWR-R1

LacZ ou células ARΔTR-transduzidas foram injectadas em ratinhos nus para gerar tumores CWR-R1 para avaliar o impacto de ARΔTR sobre o crescimento tumoral e a sinalização AR endógeno. as taxas de crescimento tumoral foram alterados pela expressão ARΔTR. A modelagem mista análise estatística rigorosa, que considera as trajetórias de volume de tumor individuais demonstraram diferenças significativas entre os 4 grupos (Fig. 6). A taxa de crescimento de controlo LacZ diferiam com T exógeno (p = 0,04) (Fig. 6A e 6B), o que indica diferentes controlos eram necessários para os dois grupos experimentais ARΔTR. ARΔTR reduziu as taxas de crescimento do tumor em comparação com controlos, um efeito que foi semelhante sem (p = 0,01) ou com exógeno T (p = 0,0004) (Fig. 6C e 6D). Os resultados foram semelhantes quando o crescimento do tumor foi avaliado utilizando dois parâmetros adicionais. LacZ e LacZ + T controles diferiram por inclinação (p = 0,01) e tempo de duplicação (p = 0,02), o que confirmou a necessidade de controles diferentes para cada ARΔTR grupo experimental. T suplementos para otimizar a função ARΔTR diminuiu o crescimento do tumor em comparação com os controlos de inclinação (p = 0,004) e tempo de duplicação (p = 0,0007). Sem suplementos T, encosta o crescimento tumoral (p = 0,07) e o tempo de duplicação (p = 0,37) foram semelhantes. A inspecção dos trajectórias tumorais individuais e volumes tumorais reais sugeriu que o efeito do ARΔTR foi uma combinação de retardar a taxa de crescimento e retardar o aparecimento de crescimento de tumor, e que este efeito ocorreu mais frequentemente quando T exógeno é fornecido para melhorar o efeito de ARΔTR (Fig. 6E).

Os tumores foram medidos utilizando compassos de calibre digitais e volumes calculados a partir do dia 14 até o dia 160 após a inoculação de células CWR-R1. Os volumes dos tumores, LacZ (A, n = 22), LacZ + T (B, n = 21), ARΔTR (C, n = 21) ou ARΔTR + T (D, N = 21), são mostradas a partir do dia 21, quando o crescimento começou até ao dia 96 para além do qual apenas 1 rato em cada grupo permaneceu. modelagem mista análise estatística mostrou uma diferença estatisticamente significativa entre os 4 grupos. taxas de crescimento de tumor CWR-R1 ARΔTR-transduzidas foram reduzidas em comparação com LacZ controla na ausência (p = 0,01, painel A vs C) ou na presença (p = 0,0004, painel C vs. D) de T. (E) Previsto média os volumes dos tumores CWR-R1 (cm

3) foram representados graficamente contra o tempo da primeira colheita do tumor para o + T LacZ (quadrados abertos), de LacZ (losangos em branco), ARΔTR + T (círculos a cheio) e ARΔTR (círculos abertos) grupos . ARΔTR expressando CWR-R1 tumores (círculos) apresentam taxas de crescimento diminuíram em comparação com células de controlo CWR-R1 LacZ-transduzidas.

Mudanças induzidas-ARΔTR

na taxa de crescimento do tumor também afetou o tempo da eutanásia determinada pela o tamanho do tumor superior a 1,5 cm

3 (Fig 7, Kaplan-Meier;. A Tabela 1, a Log análise rank, p = 0,009). 95 intervalos% de confiança para o tempo médio para a eutanásia em dias eo intervalo para cada grupo foram LacZ (71, 68-84 dias), LacZ + T (63, 57-68 dias), ARΔTR (75, 68-89 dias) , e ARΔTR + T (89, 68-105 dias). ARΔTR aumentou o tempo médio para acolher a eutanásia por 36% na presença de t exógeno, mas teve pouco efeito sem exógeno T. O tempo médio para a eutanásia aumentou em 5%, na ausência de T exógena, a diferença de que não foi estatisticamente significativa.

Dia da eutanásia foi baseada em 1,5 cm

3 tamanho do tumor em ratos no LacZ + T (linha tracejada, n = 21), LacZ (linha pontilhada, n = 22), ARΔTR (linha sólida, n = 21) ou ARΔTR + T (linha tracejada, n = 21) grupos. O tempo médio de sobrevivência diferiram em grupos que receberam T exógena (linha tracejada vs. linha tracejada, p = 0,008), mas não em grupos sem T (linha sólida vs. linha pontilhada, p = 0,34).

selecção negativa de ARΔTR em tumores CWR-R1

o tempo semelhante para a eutanásia com base no tamanho do tumor entre os ratinhos CWR-R1-ARΔTR e LacZ na ausência de androgénio sugerem que as células ARΔTR seleccione contra a expressão ARΔTR . Para testar isto, o número de cópias do vector e expressão de proteína ARΔTR e LacZ foram determinados em tumores CWR-R1. ARΔTR LacZ ou números de cópias do vector e expressão de proteína foram determinadas em células transduzidas CWR-R1 antes da inoculação e no momento da colheita do tumor. ARΔTR ou LacZ número de cópias do vector por célula medido nas células CWR-R1-transduzidas antes da inoculação com base na amplificação por RCP do vírus da hepatite da marmota elemento regulador pós-transcricional era 5,46 e 4,53, respectivamente. Média (± desvio padrão) do número de cópias vector por célula para ARΔTR e LacZ-transduzidas tumores CWR-R1 no momento da colheita foi de 0,49 ± 0,58 para ARΔTR + T e 2,58 ± 1,68 para ARΔTR (p = 0,001) e 3,10 ± 1,77 para LacZ + T e 3,48 ± 1,45 para LacZ (P = 0,4) (Fig. 8).

número de cópias do vector por célula foi determinada por PCR quantitativa do vírus da hepatite da marmota elemento regulador pós-transcricional. A média do número de cópias do vector por célula é de 0,49 ± 0,58 para ARΔTR + T, 2,58 ± 1,68 para ARΔTR, 3,10 ± 1,77 para LacZ + T e 3,48 ± 1,45 para tumores LacZ. A diminuição estatisticamente significativa no número de cópias do vector por célula foi observada para ARΔTR + T vs tumores ARΔTR (p = 0,001), mas não LacZ + T vs. LacZ (p = 0,4) tumores.

Para caracterizar ainda mais o efeito de ARΔTR no número de cópias do vector, as proporções de número de cópias do vector por célula em células CWR-R1 foram calculados no momento da colheita do tumor e no momento antes da inoculação das células CWR-R1 para tumores ARΔTR e LacZ na presença e ausência de T. a análise estatística do número de cópias do vector mediano por razões de células tumorais para ARΔTR e vectores que expressam LacZ mostrou que a cassete de vector de expressão foi seleccionado contra ARΔTR (p = 0,006, Fig. 9A). Um resultado semelhante foi obtido estatística no número de cópias do vector mediano por proporção de células tumorais para ARΔTR e expressando LacZ vectores na presença de T (p 0,0001, figura 9B.). Em geral, as células CWR-R1 na presença ou ausência de T exógeno seleccionado contra o vector ARΔTR comparação com os controlos vector LacZ ARΔTR transduzidas.

As razões para (A) e ARΔTR LacZ, e (B) + ARΔTR T e LacZ + T foram calculados utilizando o número de cópias do vector medido no momento da colheita do tumor versus o número de cópias do vector medido antes da inoculação. Individual número de cópias do vector tumor por a relação de células de cada grupo é representado usando círculos abertos. O rácio do número de cópias vector mediana (círculo sólido) foi determinada em ARΔTR (0,43), LacZ (0,64), ARΔTR + T (0,05), e LacZ + T (0,6) tumores. O transgene foi seleccionado contra ARΔTR na ausência (p = 0,006) e na presença (p 0,0001) de t exógeno em comparação com LacZ controla

O ARΔTR mediana alterada e LacZ número de cópias do vector por célula tumoral. índices sugeridos diminuiu a expressão da proteína ARΔTR comparados aos controles LacZ. ARΔTR proteína ou LacZ colhidos tumores CWR-R1 com uma quantidade suficiente de tecido (79) para análise de tumores de AR endógeno e expressos foram analisados ​​em imunomarcações. A expressão da proteína AR e ARΔTR endógena foi demonstrada em pTK989-ARΔTR transduzidas células CWR-R1 antes da inoculação subcutânea. ARΔTR transduzidas tumores CWR-R1 na presença de T (Fig. 10A), expressa AR endógeno em todos os 22 tumores CWR-R1-ARΔTR + T, embora a proteína AR era indetectável para baixo em 3 amostras (amostras 21-23). Em contraste, a proteína ARΔTR era desprezível ou ausente em todos os tumores CWR-R1-ARΔTR na presença de suplementos de T.

análise por Western blot foi realizada utilizando lisados ​​de proteínas isoladas a partir de tumores CWR-R1 recolhidos no momento da tumoral colheita. A expressão tumor CWR-R1 da AR endógeno (M

r 110 kDa), e traduzidas ARΔTR (ARΔ142-337, M

r 84 kDa) e LacZ (M

r 60,5 kDa) proteína foram avaliados. (A) imuno de AR e ARΔTR na presença de T (número de tumores 2-23) ou (B) ausência de T (números de tumor 24-29, 31-35, 38, 39, 43 e 44). (C) imuno de LacZ (M

r 60,5 kDa) proteína com T (números tumorais 47-68) ou sem T (números tumorais 69-91) e no controle de vetores vazios (números tumorais 92-95). LacZ foi expressa em todos, mas um de 42 tumores CWR-R1. proteína LacZ expressa em pTK1027 transduzidas células CWR-R1 antes da inoculação subcutânea em camundongos foi usado para controle. As células HEK-293T foram utilizados como controlos negativo e o controlo de carga para imunoblots LacZ foi glicose 6-fosfato desidrogenase (GADPH, H

r de 36 kDa).

Na ausência de suplementação t, proteína AR persistiu em 10 de 15 tumores CWR-R1-ARΔTR (números tumorais 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 39, 43 e 44), e AR endógeno não foi detectada em 5 tumores que também não expressar ARΔTR (amostras 24-27 e 33) (Fig. 10B). CWR-R1-ARΔTR tumores 32 e 35, sem o suplemento T expressa AR, mas não ARΔTR. ARΔTR foi co-expresso em 8 tumores CWR-R1 (números tumorais 28, 29, 31, 34, 38, 39, 43 e 44).

Em contraste, a proteína LacZ foi expressa em todos os tumores, exceto tumor 72 na ausência e na presença de t (Fig. 10C). Vazios tumores controle de vetores CWR-R1 com T (amostras 92 e 93) e sem T (amostras 94 e 95) e células 293T não expressar a proteína LacZ ou ARΔTR. A expressão consistente de proteína LacZ corresponde com o número de cópias do vector calculado em tumores LacZ-transduzidas.

Os resultados sugerem selecção negativa de ARΔTR não está limitada a tumores CWR-R1-ARΔTR propagados em ratinhos com T. suplementar em ARΔTR tumores -transduced sem suplementar T, ARΔTR selecção foi menos possivelmente devido à baixa T soro e /ou alterados biossíntese intracrine T.

síntese intracrine de andrógenos ativo no tampão castração recorrente

a ausência de CYP17A1 nas glândulas supra-renais de rato [33] fornece um modelo para testar se CaP castração recorrente produz andrógenos intracrine. Geração dos tumores CWR-R1-ARΔTR proporcionou a oportunidade de investigar um efeito de AR sinalização em biossíntese de androgénio intracrine activo. O crescimento do tumor semelhante CWR-R1-ARΔTR, tempos de duplicação do tumor e com e sem pistas T, e as medições de DHT em células CWR-R1 sugeriu que os tumores CWR-R1 produzido androgénios activos na ausência de circular T.

Para identificar possíveis diferenças nos perfis de andrógenos entre tumores LacZ CWR-R1-ARΔTR e, T, DHT, androstenediona e androsterona foram medidos através de espectrometria de massa de cromatografia líquida tandem. níveis teciduais de 0,32 nM de DHT (P = 0,59) e 0,05 nM de androsterona (p = 0,23), medido no momento da colheita do tumor foram semelhantes em ARΔTR e tumores LacZ-transduzidas (Tabela 2) e suficiente para activar endógena AR e ARΔTR (ver

in vitro

resultados; a Fig. 2). Além disso, 3,25 nM T em LacZ tumores foi semelhante aos níveis de T em Cap castração recorrente [4], [9] que foi suficiente para ativar endógena AR-H874Y [29]. No entanto, em tumores CWR-R1-ARΔTR, os níveis de T foram ~ 4-vezes menos do que os tumores de LacZ, o que sugeriu alterações na biossíntese T pela AR negativo dominante. Diminuição da biossíntese T em tumores CWR-R1-ARΔTR transduzidas correlacionados com a acumulação de ~ 1 nM androstenediona, um precursor androgénio a T. Em contraste, os tumores CWR-R1-lacZ continha 1,05 nM de androstenediona. Quantificação de precursores reduziu-5a e andrógenos insaturada em ARΔTR e LacZ-transduzidas tumores CWR-R1 sugeriu intracrine biossíntese de andrógenos contribuiu para AR-dependentes Cap Growth castração recorrente.

Discussão

estudos neste relatório foram baseados na premissa de que uma forma dominante negativa de AR com uma deleção do NH

2-terminal do domínio de transactivação requer androgénio para a dimerização [30] e inibição da actividade de transcrição de AR de comprimento completo [27] . Demonstrámos que a expressão estável de ARΔTR negativo dominante inibe a actividade de transcrição endógena AR-H874Y e retarda ou atrasa o crescimento do tumor CWR-R1 na ausência e presença de actividade ARΔTR negativos para T. suplementar Color também foi indicado pela diminuição da proteína NKX3.1 ea atividade repórter luciferase na presença de DHT.

os resultados do estudo revelaram duas conclusões importantes adicionais. Em primeiro lugar, não era essencialmente 100% de selecção negativa contra a forma dominante negativa de AR durante o crescimento do tumor CWR-R1-castração recorrente na presença de T. Isto contrasta suplementar de retenção de cerca de 100% do controlo do gene de LacZ. Ambos ARΔTR dominante negativo e LacZ foram integrados no genoma de lentivírus usando expressão e selecção de células antes da inoculação das células e o crescimento do tumor. Em segundo lugar, a cerca de 50% a exclusão de AR negativo dominante ocorreu nos tumores CWR-R1-ARΔTR propagadas na ausência de suplementação de T. Estes resultados, juntamente com as medições de espectrometria de massa de T e DHT em células cultivadas CWR-R1, fornecem evidência para a síntese intracrine andrógenos dos ativos necessários para a sinalização AR no PAC. perda seletiva de um AR negativo dominante demonstra a versatilidade genética de células CaP castração recorrente para maximizar a sinalização AR.

síntese Intracrine de andrógenos em Cap castração recorrente

A inibição da actividade da luciferase em CWR- R1 células por ARΔTR negativo dominante na ausência de exógena t sugerido a síntese intracelular de T. Isto foi suportada por medições de espectrometria de massa de T e DHT em células CWR-R1. Nossos resultados estão de acordo com evidências anteriores de que as células LNCaP sedentos de andrógenos sintetizar andrógenos de

14C-acetato de colesterol marcado [34]. células CaP alterar o metabolismo e processamento para suportar a biossíntese de andrógenos [35] colesterol. Intracrine biossíntese de androstenodiona, DHEA e T também foi demonstrada em CWR-R1 e células PC-3, e implicada actividade CYP17A1 CaP em células positivas e negativas ar [36]. Em amostras clínicas, colesterol e enzimas biossintéticas de andrógenos foram regulados positivamente em Cap castração recorrente [12], [37], [38].

os tumores CWR-R1-LacZ, os níveis de T e DHT intratumorais foram suficientes para activar AR-H874Y e promover o crescimento do tumor. os níveis de DHT intratumoral em ARΔTR e tumores LacZ-transduzidas foram semelhantes. No entanto, em tumores de xenoenxerto CWR-R1-ARΔTR transduzidas, os níveis de T eram mais baixos e os níveis de androstenediona foram maiores do que os tumores CWR-R1-LacZ. Níveis mais baixos T no tumor CWR-R1-ARΔTR sugeriu que ARΔTR negativo dominante seleccionado contra células que expressam aldo-ceto redutase 1C3, uma enzima que reduz a androstenediona em T no tampão castração recorrente, ou aumentou a oxidação de T para androstenodiona pelo NAD

+ dependentes [39]. Diminuição da conversão da androstenediona em T mudaria o perfil do ligando intracelular em direção a ativação do mutante AR-H874Y a partir do tipo selvagem AR LBD em ARΔTR. Intracrine metabolismo do colesterol em androgénios activos poderiam explicar a sensibilidade inicial de CaP castração recorrente ao tratamento com acetato de abiraterona [14].

AR-H874Y endógeno para células CWR-R1 mantém a alta afinidade T e DHT de ligação semelhante ao do tipo selvagem AR. No entanto, a mutação H874Y estabiliza a estrutura do núcleo LBD de modo que T é tão eficaz como DHT na promoção de actividade de transcrição [29]. A estrutura efeitos de estabilização H874Y são suficientes para superar os efeitos prejudiciais da perda de mutações de função que causam andrógeno insensibilidade [40]. A potência equivalente de T e DHT com AR-H874Y sugere que a síntese intracrine de T iria promover o crescimento do tumor CWR-R1 LacZ transduzidas. conversão intracelular de androstenodiona em T pode ter um efeito substancial sobre transcricional AR-H874Y relativamente ao tipo selvagem AR [29]. O aumento da expressão de receptores de esteróides coativadores P160 no tampão castração recorrente [41], [42] contribuiu para a hipersensibilização.

rácios T:DHT em LacZ- e ARΔTR-transduzidas tumores CWR-R1 eram semelhantes aos castração recorrente PAC [4], [9], [43]. Estudos anteriores, usando amostras clínicas demonstraram diminuição da 5α-redutase-2 mRNA isozima [44] e proteína [45] expressão em Cap castração recorrente que foi parcialmente devido à perda do factor de célula do estroma secretada sinalização [44], [46]. tumores CWR-R1 também pode ter diminuído a actividade 5α-redutase-2. Os níveis de DHT semelhantes em tumores LacZ e ARΔTR indicam que DHT biossíntese depende androstenediona em vez de T, uma vez que a androstenediona é um melhor substrato para 5α-redutase-1 do que T [47]. A mudança em direção a conversão da androstenediona em androstanedione [45] pela 5α-redutase-1 e ainda mais o metabolismo em DHT pela membrana NADPH vinculados dependentes 17β-hidroxiesteróide desidrogenase-15 [48] pode explicar por que os homens com CaP castração-recorrentes e os níveis de androstenediona altos da linha de base sobreviveram mais tempo quando tratados com cetoconazole [49]. DHT níveis permanecem semelhantes, embora os rácios T:androstenedione em tumores LacZ e ARΔTR foram invertidos. Os baixos níveis de DHT e semelhantes (~ 10

-11) medido em LacZ e ARΔTR transduzidas tumores CWR-R1 pode ser a concentração intra-tumoral óptima para a proliferação de células CWR-R1 [42] e AR-H874Y ADN coordenado licenciamento replicação [ ,,,0],50].

selecção negativa para melhorar a actividade do AR

efeitos inibidores do crescimento de ARΔTR foram complicadas pelo facto de que o transgene ARΔTR foi seleccionado negativamente contra o crescimento do tumor durante CWR-R1 mais eficientemente no presença de suplementar T. Expressão do transgene ARΔTR foi perdido em todos os 22 tumores ARΔTR + T por o tempo de colheita, enquanto que o transgene ARΔTR foi mantida em ~ 50% dos tumores na ausência de T. o volume médio do tumor suplementar era maior do que os tumores ARΔTR + T, que podem ser associados com uma passagem parcial de T para a biossíntese de androstenodiona por estes tumores. Embora o tempo de selecção negativa contra o transgene ARΔTR não foi rigorosamente testado, estudos preliminares sugeriram perda do transgene ocorreu aproximadamente 10 dias após a inoculação de células de tumor no dia 23.

selecção negativa do transgene ARΔTR foi suportada pela diminuição do número de cópias do genoma vector em ambos ARΔTR e LacZ-transduzidas tumores CWR-R1 na ausência ou na presença de T. exógeno perda da expressão do transgene foi demonstrado que ocorrem 10 a 15 dias depois que as células de carcinoma embrionárias lentivirais transduzidas [51]. O atraso no crescimento do tumor ARΔTR + T selecção suportada contra o transgene após 10 dias no modelo de CWR-R1. Pode-se argumentar que a perda do transgene resultou da fuga vector de variegation e /ou eventos de extinção. Por outro lado, o gene aleatório ou deleção cromossómica e silenciamento do transgene [51] não eram suportadas, como havia quase completa retenção de controle do transgene LacZ nos tumores CWR-R1.

Estudos recentes têm demonstrado que a CWR -R1 células, bem como os xenoenxertos de CWR22 CaP parentais, contêm de replicação de retrovírus competentes idênticos ao xenotr�ico leucemia de murino relacionada com o vírus (XMRV) encontrados em células CaP humanos [52], [53]. XMRV evoluiu por recombinação entre dois retrovirus endógenos em ratinhos nus carregando os xenoenxertos de CWR22 [52], [53].