Abstract

Thiazole antibiótico, tiostreptona foi recentemente identificado como inibidor do proteassoma. Investigou-se o potencial terapêutico da combinação de tiostreptona e bortezomib inibidor de proteassoma (Velcade) em várias linhas celulares tumorais humanas. Combinação de concentrações sub-letal de tiostreptona e bortezomib induzida potente da apoptose e inibição da formação de colónias a longo prazo em uma ampla variedade de linhas celulares de cancro humano. A relação sinérgica entre tiostreptona e bortezomib combinação também foi demonstrado quantitativamente calculando seus valores de índice de combinação que foram muito mais baixas do que 1 em todas as linhas celulares estudadas. A sinergia entre estes fármacos foi com base nas suas actividades inibidoras de proteassoma, porque a modificação tiostreptona, éster metílico tiostreptona, que não têm anel ácido quináldico intacta e não inibiu a actividade de proteassoma não conseguiram demonstrar qualquer sinergia em combinação com bortezomib.

Citação: Pandit B, Gartel AL (2011) tiazole Antibiótico Tioestreptona sinergia com bortezomib para induzir a apoptose em células cancerosas. PLoS ONE 6 (2): e17110. doi: 10.1371 /journal.pone.0017110

editor: Joseph Bauer, Fundação Bauer Research, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de setembro de 2010; Aceito: 20 de janeiro de 2011; Publicação: 18 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Pandit, Gartel. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelo National Institutes of Health concede 1RO1CA1294414 e 1R21CA134615 (AL Gartel). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

combinação de drogas /agentes direcionados recebeu um consenso como uma estratégia potencial viável para o tratamento de malignidade. O tratamento com um conjunto de agentes que têm como alvo mecanismo ou proteínas críticas para vários cancros celular chave estão a ser investigados contra uma variedade de tumores. Combinação de fármacos permite a sua utilização em concentrações subtóxicos e diminui a probabilidade de desenvolvimento de células cancerosas resistentes.

O proteassoma é um complexo de proteínas que proteínas alvo marcadas com ubiquitina para a degradação de uma forma dependente de ATP. Os avanços recentes na compreensão dos mecanismos de actividade de proteassoma conduziu ao desenvolvimento de inibidores de proteassoma como drogas eficazes contra o cancro humano [1]. Uma vez que certos tipos de cancro dependem de um proteassoma funcional para o crescimento, a inibição da actividade de proteassoma seria selectivamente matar esses tumores. Bortezomib (Velcade) é um dos primeiros inibidores de proteassoma que inibe classe proteassoma 26S por ligação aos terminais N treonina no local activo da região catalítica do proteassoma. Ele está aprovado para uso clínico em casos de recaída do mieloma múltiplo, mas demonstrou pouca ou nenhuma actividade para o tratamento de tumores sólidos como um agente único. No entanto, através da inibição da via do proteassoma e subsequente efeito de vias importantes, bortezomib demonstra relação sinérgica quando combinado com outras drogas anti-cancerosas e aumenta a eficácia da droga contra a malignidade.

Nos nossos estudos anteriores que demonstraram que tiazole antibióticos Siomycin a e tiostreptona induzir a apoptose em células cancerosas humanas [2], [3] e actuar como inibidores de proteassoma [4]. Tem sido demonstrado antes que a combinação dos dois inibidores de proteassoma lactacistina e MG132 sinergia contra células de cancro da próstata in vitro [5]. Além disso, a sinergia foi demonstrada através da combinação com bortezomib curcumina (que demonstra uma actividade inibidora proteossómica além de outros efeitos) contra células de mieloma múltiplo [6]. Da mesma forma, nós demonstramos que combinação de tiostreptona e bortezomib demonstraram uma forte sinergia contra o câncer de próstata [7]. Neste estudo confirmou-se que o co-tratamento de várias linhas de células tumorais de origem diferente com concentrações sub-letal de inibidores de proteassoma tiostreptona e bortezomib revela uma sinergia forte como demonstrado por indução de apoptose, valores do índice de combinação e ensaio clonogénico a longo prazo.

resultados e Discussão

Nós mostramos anteriormente que tiostreptona inibidor do proteassoma inibiu o crescimento de várias linhas celulares de cancro com IC

50 valores (1-5? M /L) e apoptose induzida [2 ], [3]. Bortezomib foi demonstrada para inibir a viabilidade das linhas de células de tumor com IC

50 valor de 10-100 nM /L. Para determinar se tiostreptona pode sinergia com bortezomib contra linhas de células humanas de câncer de origem diferente tratamos várias linhas celulares de cancro humano, quer com concentrações sub-apoptóticos de tiostreptona ou bortezomib sozinho ou com combinações dos dois por 24 horas e utilizada caspase-3 para servir como um indicador da morte celular por apoptose (Figura 1). Embora o tratamento com tiostreptona ou bortezomib sozinho induziu pouca ou nenhuma caspase-3 clivada nestas células, o tratamento com a combinação dos dois fármacos demonstraram potente da caspase-3 clivada no osteossarcoma U2OS-C3, MiaPaCa-2 pancreático, PA-1 de ovário, cólon HCT116 e MDA-MB-231 de cancro da mama (Figura 1), e níveis de apoptose inversamente correlacionada com a expressão FoxM1 (Figura S1). Desde que estabelecemos sinergia anterior entre bortezomib e tiostreptona em células de câncer de próstata [7], os nossos dados atuais sugerem que este efeito pode ter importância geral para o tratamento de câncer.

A. Osteossarcoma, U2OS-C3, B. MiaPaCa-2 pancreático, C. PA-1 ovário, D. HCT-116 do cólon, E. MDA-MB-231 de cancro da mama células foram tratadas com concentrações sub-apoptóticos de tiostreptona, bortezomib ou ambos como mostrado por 24 horas, os lisados ​​celulares totais foram extraídas e imunotransferidas com anticorpos para a caspase-3 clivada e β-actina.

para demonstrar adicionalmente que o tratamento com a combinação de tiostreptona e bortezomib induz apoptose sinérgica, que coradas estas células (DMSO tratados, tratados à tiostreptona, bortezomib tratados e tratados em conjunto com os dois fármacos) com anexina V-PE /7AAD e analisadas por citometria de fluxo a eles. Como mostrado na Figura 2A, o tratamento de HCT-116 células com 0,75 uM tiostreptona ou 10 nM bortezomib induziu apoptose de apenas 6,1% e 6,9% relativamente ao controlo, enquanto que o tratamento com ambos os fármacos nas mesmas doses causou 35,2% de células a sofrer apoptose . efeito sinérgico similar de combinação tiostreptona /bortezomib foi observada por coloração com anexina-VPP-7AAD nos cancros da mama MDA-MB231 e MiaPaCa-2 células de cancro do pâncreas (Figura 2B e C).

. HCT-116, cólon, B. MDA-MB-231, da mama e C. MiaPaCa-2, células de cancro do pâncreas tratados com concentrações sub-apoptóticos de tiostreptona, bortezomib e tiostreptona /combinação bortezomib durante 24 horas, coradas com AnnexinV-PE e 7-AAD e analisadas por citometria de fluxo.

Para validar quantitativamente a natureza sinérgica da interacção entre tiostreptona e bortezomib, examinámos a viabilidade celular após tratamentos com medicamentos individuais e combinados usando a Chou-Talalay median- método da equação efeito [8]. valores de CI inferiores a 1 indicam um efeito anti-proliferativo sinérgica, e os valores de intervalo de IC para os tratamentos combinados com tiostreptona /bortezomib em HCT-116, Mia-Paca-2, a MDA-MB231 e PA-1 Linhas celulares de cancro humano foram 0,1 para 0,8 (Figura 3A, B, C, D) para efeito fraccionada correspondente a 0,3 a 0,9, sugerindo um efeito sinérgico forte. Os efeitos a longo prazo do tratamento com a combinação de tiostreptona e bortezomib foram avaliadas pelo ensaio clonogénico. Descobrimos que a formação de colónias em HCT-116 do cólon e células MDA-MB 231 de cancro da mama tratadas com a combinação destas drogas por 24 horas foi suprimida com 5 a 10 vezes (Figura 4A e B).

índice de combinação gráfico para a combinação droga tiostreptona /bortezomib foi representada graficamente com CI no eixo y e efeito fraccionada (FI) no eixo-x. A percentagem de inibição da proliferação foi determinada após tratamento com um único agente ou combinação de tiostreptona /bortezomib. índice de combinação (IC) de valores dos dois agentes representada para HCT-116 (A), MiaPaCa-2 (B), MDA-MB231 (C) e PA-1, células do ovário (D).

A. ensaio clonogênica de HCT-116 células tratadas com DMSO ou tiostreptona combinação /bortezomib durante 24 horas, conforme detalhado; uma fotografia de placas de petri em um experimento representativo é mostrado. ensaio B. clonogênica de células MDA-MB231 tratadas com DMSO ou tiostreptona /combinações bortezomibe durante 24 horas.

Após a demonstração de sinergia entre tiostreptona e combinação de bortezomib, a importância da atividade inibitória proteossómica de tiostreptona utilizada na combinação foi investigada. A actividade da combinação de éster de metilo de tiostreptona (anel aberto análogo estrutural inactiva de tiostreptona) e bortezomib combinação foi comparada com a tiostreptona e bortezomib. Foi demonstrado anteriormente que um anel macrociclo ácido quináldico intacta em tiostreptona é necessária para a actividade inibidora de proteassoma, os antibióticos de tiazol [9]. Ausência de um anel ou na presença de um anel aberto rendeu a molécula inactiva [10]. Em contraste com a combinação de tiostreptona /bortezomib, bortezomib e éster de metilo de tiostreptona falharam em demonstrar a indução de apoptose, confirmando a importância da actividade inibidora de proteassoma de tiostreptona utilizado na combinação da droga (Figura 5). Alguns estudos têm demonstrado uma sinergia seguinte co-tratamento com inibidores de proteassoma, lactacistina e MG132 [5], bortezomibe e curcumina [6] contra o câncer. Neste estudo utilizando métodos diferentes que relatam que tiostreptona sinergiza com bortezomib após co-tratamento com concentrações sub-letais dos dois agentes, sugerindo que a combinação de dois inibidores de proteassoma para ser de valor potencial como uma estratégia geral contra o cancro.

tratamento com combinação de resultados tiostreptona /bortezomib na aparência da sub-L

0 pico que reduz a intensidade de fluorescência em células HCT-116, em oposição às células de controlo não tratadas devido à fragmentação da cromatina. A mudança do FI era comparável com o controlo positivo fornecido com o kit (Estaurosporina, dados não mostrados). éster Tioestreptona-metil com anel B aberto não afeta a intensidade de fluorescência em oposição a células não tratadas (controle).

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

U2OS-C3 osteossarcoma, cólon HCT116, ovário PA1 e MiaPaCa-2 células de cancro pancreático foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen). As células MDA-MB231 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen). Os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals) e 1% de penicilina-estreptomicina (GIBCO) e as células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2. As linhas celulares foram testadas quanto à contaminação por micoplasma usando o kit de detecção MycoAlert Mycoplasma (Lonza Rockland) e verificou-se ser negativo. Tiostreptona foi adquirido a partir de Sigma, bortezomib foi gentilmente fornecido por Millennium produtos farmacêuticos /Takeda. Abrir analógico anel de tiostreptona, éster metílico tiostreptona foi gentilmente fornecido pelos Drs. Walsh e Bowers (Universidade de Harvard).

Combinação ensaio de índice

ensaio de MTT foi realizado para medir a viabilidade das células após o tratamento com agentes únicos ou combinações de tiostreptona e bortezomib. Cada experiência envolveu o tratamento com várias concentrações de tiostreptona, bortezomib, combinação de tiostreptona e bortezomib e um tratamento sem fármaco. Além disso, as concentrações mais elevadas de tiostreptona, bortezomib e a combinação de fármacos foram testados na ausência de células e não demonstrou qualquer interferência com os reagentes do ensaio MTT.

3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, brometo de 5-difenil (MTT) foi obtido a partir de Sigma. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 1 x 10

4 por poço em 200 ul de meio de cultura completo e tratados com tiostreptona sozinho, bortezomib sozinho e da combinação de tiostreptona e bortezomib em placas de 96 poços de micro titulação. Após incubação durante 72 horas a 37 ° C numa incubadora humidificada, a 10 pL de MTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço, após o que a placa foi centrifugada brevemente. Após remoção cuidadosa do meio, 0,1 mL tamponadas DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvância foi registada num leitor de micro-placa no comprimento de onda de 540 nm. Nas nossas experiências, o IC

30, IC

50, IC

70, IC

80, e IC

90 valores (ou seja, a concentração de fármaco necessária para provocar 30%, 50% , 70%, 80%, e 90% de redução na viabilidade celular) foram escolhidos para comparação.

para avaliar o efeito do tratamento com a combinação de tiostreptona e bortezomib, o índice de combinação (IC) isobolograma método de Chou e Talalay foi utilizado [8]. Este método envolve traçando curvas de dose-efeito para cada agente e combinações em várias concentrações diluído usando a equação do efeito mediano e a equação do índice de combinação. os valores do índice de combinação de 1, 1, e 1 indicam um efeito aditivo, sinergismo, e antagonismo, respectivamente. Os valores do índice de combinação foram determinados em diferentes níveis de efeito, e os traçados isobologramas.

A detecção de apoptose

O kit de coloração AnnexinV-PE (Roche Diagnostic Corp.) foi usado para a detecção de apoptose corpos seguindo o protocolo do fornecedor. Este kit utiliza um protocolo de dupla coloração no qual as células mostram fluorescência de Anexina V (células apoptóticas) e fluorescência de 7AAD (células necróticas ou células apoptóticas tardias). Resumidamente as células tumorais foram cultivadas a uma densidade de 50% de confluência em placas de cultura de 100 mm e foram tratadas com várias concentrações dos fármacos em 24 horas. As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS, e foram processados ​​para marcação com annexinV-7AAD. As células marcadas foram analisadas por citometria de fluxo.

imunotransferência

células activamente em divisão foram semeadas numa placa de 100 mm a uma densidade de 7,5 x 10 5>

4P

2O

7, ortovanadato de sódio 1 mM, PMSF 0,2 mM suplementado com comprimido inibidor de protease (Roche Applied Sciences) e a concentração de proteína foi determinada usando o reagente de ensaio de proteína Bio-Rad. Cinquenta microgramas de os lisados ​​celulares foram separados por electroforese em mini-gel de SDS-poliacrilamida e transferido para membrana de PVDF. Immunoblotting foi realizada com anticorpos específicos para a caspase-3 (9664 sinalização celular), FoxM1 (tipo presente do laboratório do Dr. Costa) e β-actina (A5441, Sigma).

Nucleares detecção ID verde de condensação da cromatina

as células foram coradas utilizando

in vitro

apoptose kit de detecção (Cat # Enz-51021-K200 Enzo Life Sciences), de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente 3-4 × 10

5 células foram plaqueadas em placas de cultura de 60 mm e deixou-se crescer durante a noite. as células foram tratadas com as concentrações sub-letal de tiostreptona, bortezomib ou tiostreptona éster metílico ou combinação de tiostreptona e éster bortezomib e tiostreptona-metilo e bortezomib. Após incubação durante a noite de células drogas foram tripsinizadas e submetidas a análise de citometria de fluxo. A análise foi feita usando FL-1 canal de citometria de fluxo, com comprimento de onda de excitação de 488 nm. A estaurosporina, fornecido com o kit foi utilizado como um controlo positivo.

sobrevivência clonogénica ensaio

células HCT-116 e MDA-MB231 foram plaqueadas para placas de meio de 3 × 10

5 células confluência e tratadas com a combinação de tiostreptona e bortezomib durante 24 horas. As células foram então tripsinizadas, re-suspenso nos meios de comunicação e contadas. As células foram re-semeadas (750 células por placa de meio) e incubou-se durante 10 dias. o meio fresco foi adicionado no quinto dia. No décimo dia, o meio foi removido das placas e lavada uma vez com PBS gelado. As colónias foram coradas com 2 ml cada de 0,25% 1, 9-dimetil-metileno azul em 50% de etanol durante 45 minutos numa plataforma oscilante. Os pratos foram lavados três vezes com PBS e secas ao ar, e as colónias foram contadas.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada com o Microsoft Excel usando o Student

t

teste.

valores P

de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Informações de Apoio

Figura S1..

níveis relativos de FoxM1 pode afectar a sensibilidade ao tratamento com combinação tiostreptona /bortezomib em células cancerosas humanas. U2OS-C3 osteossarcoma e PaCa-2 células cancerígenas pancreáticas MIA foram tratadas com DMSO ou concentrações indicadas de tiostreptona e borteozomib em conjunto durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente para FoxM1, caspase-3 e β-actina como o controle de carregamento

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0017110.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Albert Bowers e Dr. Christopher Walsh por gentileza de éster metílico tiostreptona utilizada neste trabalho.