Sumário
proteína FHIT é perdido ou reduzido em uma grande fração dos tumores humanos, e sua restauração desencadeia a apoptose e suprime a formação de tumores ou progressão em modelos pré-clínicos. Aqui, descrevemos a identificação de candidatos FHIT-interagindo proteínas com localização citosólica e plasma membrana. Entre estes, anexina 4 (ANXA4) foi validado por co-imunoprecipitação e microscopia confocal como um parceiro deste novo complexo de proteína FHIT. Aqui nós relatamos que a superexpressão de FHIT impede Anexina A4 translocação do citossol para a membrana plasmática em células de câncer de pulmão A549 tratadas com paclitaxel. Além disso, a administração de paclitaxel em combinação com Ad
FHIT
age sinergicamente para aumentar a taxa de apoptose de células tumorais tanto
in vitro
in vivo
experimentos Comprar e.
citação: Gaudio E, F Paduano, Spizzo R, Ngankeu A, Zanesi N, Gaspari M, et al. (2013) FHIT Delocalizes Anexina A4 a partir de plasma membrana para citosol e sensibiliza células do cancro do pulmão de Paclitaxel. PLoS ONE 8 (11): e78610. doi: 10.1371 /journal.pone.0078610
editor: Srikumar P. Chellappan, universidade de Catanzaro, Estados Unidos da América
Recebido: 26 Março, 2013; Aceito: 14 de setembro de 2013; Publicação: 06 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Gaudio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela AIRC (Associazione Italiana Ricerca Câncer) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) CA152758 concessão (CMC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o
gene FHIT
, abrangendo
FRA3B
, o sítio frágil comum mais ativo no cromossomo 3p14.2 [1], [2] é um membro da tríade histidina (HIT) família de proteínas, abrangendo um grupo de nucleótidos de ligação e hidrólise de proteínas com histidina motivos tríade, representada em todos os organismos [3].
FHIT
codifica uma proteína supressora de tumor cuja perda está implicado num grande fracção de cancros; Na verdade, a sua eliminação ou perda de expressão foi avaliado em cabeça e pescoço [4], [5], gastrointestinal [6], cervical [7], do pulmão [8], da mama [9], [10], e hematopoiéticas tumores [11]. O papel de FHIT na tumorigénese foi confirmada em ratinhos, em que
FHIT
ablação genética resultou no aumento da susceptibilidade a um amplo espectro de tumores espontâneos [12], [13]. Além disso, a supressão de um ou ambos
FHIT
alelos em camundongos sensibilidade ao agente cancerígeno N-nitrosometilbenzilamina (RNM) melhoradas, com a maioria
FHIT
– /- Comprar e
FHIT
+/- ratos desenvolver tumores do estômago (adenomas, os papilomas e carcinomas invasivos) após uma dose de RNM em comparação com controles do tipo selvagem [12], [14] que se desenvolveu muito poucos. Curiosamente,
FHIT
foi também utilizada com sucesso como um gene terapêutico em linhas celulares de cancro, onde provoca a apoptose, e vários modelos pré-clínicos de
FHIT
câncer -null, incluindo pulmão, esôfago, pâncreas, mama e leucemia [15] – [20]. No entanto, os relatórios relativos aos mecanismos de função supressora FHIT ter sido mais escasso e mais recente. FHIT codifica um polifosfato diadenosina (Apna) hidrolase que cliva substratos tais como diadenosina
P
1,
P
3 trifosfato (ApppA) e diadenosina 5 ‘, 5’ ‘ ‘-
P
1,
P
4-tetra fosfato (AppppA) para AMP além de outro nucleótido [21], [22]. Através de expressão adenoviral de
FHIT
alelos mutantes, nós demonstramos que a ligação FHIT-substrato é limitante para a supressão do tumor, enquanto que a sua actividade catalítica não é necessária para a capacidade para desencadear a apoptose FHIT [23]; Além disso, mostrámos que o altamente conservada FHIT tirosina 114 (Y114), que pode ser fosforilada por Src [24], é necessário para desencadear a apoptose mediada por FHIT dependente de caspase [25]. Mais recentemente, usando uma abordagem proteômica, identificamos um complexo de proteínas FHIT incluindo Hsp60 e Hsp10, que pode mediar tanto a estabilidade FHIT e sua localização mitocondrial; uma vez na mitocôndria, FHIT liga-se e estabiliza ferredoxina redutase (Fdxr), levando a modulação da produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), um passo inicial na apoptose induzida por FHIT [26]. A evidência de FHIT localização mitocondrial também levou à descoberta de que ela aumenta a acumulação de Ca2 + para o organelo, de acordo com o seu papel na apoptose sob condições adequadas [27].
A ampla distribuição subcelular de FHIT nos encorajou para continuar a busca de parceiros de proteína romance FHIT para lançar mais luz sobre o seu papel na supressão do tumor. Aqui, demonstramos que FHIT interage com Anexina 4; esta interacção pode bloquear a translocação de anexina 4 do citossol para a membrana do plasma, durante o tratamento de células de cancro do pulmão com paclitaxel. Como consequência, exógena
FHIT
restauração no
FHIT
células cancerosas -null age sinergicamente com paclitaxel no desencadeamento de apoptose
in vitro
e tumor de regressão
in vivo
. Tomados em conjunto nossos resultados sugerem que FHIT restauração poderia ter um papel na superação resistência aos medicamentos e que combinação com paclitaxel lata representa uma abordagem válida para a terapia do cancro.
Resultados
O isolamento de complexos de proteínas da célula FHIT membranas
Em nossa abordagem proteômica anterior, nós isolamos um complexo de proteínas FHIT solúvel de células cancerosas A549 [26]. Usando uma abordagem ligeiramente modificado, visando a identificação de proteínas FHIT-interagindo nas membranas das células, foi utilizado um adenovírus recombinante transportando um
cDNA FHIT
modificada na sua extremidade 3 ‘com uma sequência que codifica um marcador de histidina e seis epitopo ( ad
FHIT-
His6), como descrito anteriormente [26]. Resumidamente, células de cancro do pulmão A549 foram infectadas quer com Ad
FHIT
(utilizado como um controlo) ou Ad
FHIT-
His6 no MOI50 e tratou-se com ditiobis [succinimidilpropionato] (DSP), um cruzamento ligante que atravessa membranas e correções de proteínas no complexo em células vivas. As células foram lisadas e a fracção enriquecida de membrana isolada; proteína recombinante FHIT-His6, juntamente com os seus parceiros de proteína candidatos foi isolado com grânulos de níquel ávido para o epitopo marcador His6. As proteínas purificadas foram tratados com ditiotreitol (DTT) para clivar o DSP e dissociar o complexo, e digeridas por tripsina; componentes de proteína foram identificados por espectrometria de massa líquido /cromatografia em tandem (LC-MS /MS). Após a identificação de proteínas através de pesquisas de banco de dados, de controlo de dados de LC-MS /MS foi realizada para avaliar a presença exclusiva de picos de massa pertencentes a proteínas parceiras candidato em amostras a partir de células infectadas com Ad
FHIT-
His6. As proteínas identificadas são apresentadas na Tabela 1.
FHIT proteína interage com Anexina 4
Foi anteriormente demonstrado que a ausência de proteína em células cancerosas FHIT resultou em resistência ao paclitaxel [28] ; Anexina 4, uma proteína com tanto membrana plasmática e localização citoplasmática, tem sido relatada a ser sobre-expressa em muitas células cancerosas; Em particular, foi demonstrado que a Anexina 4 sobre-expressão contribui para as células cancerosas resistentes a paclitaxel [29]. Assim, para lançar luz sobre os mecanismos de resistência aos medicamentos em
FHIT
células cancerosas -minus, decidimos focar anexina 4 entre os candidatos, os parceiros FHIT recém-identificados. Anexina 4 pertence a um super-família de cálcio intimamente relacionados e proteínas de ligação à membrana que participam numa variedade de funções celulares, incluindo o tráfico de vesículas, a divisão celular, a apoptose, a sinalização de cálcio e de regulação do crescimento. Tem sido proposto que alguns alterações na expressão durante a tumorigénese anexina pode resultar na resistência aos agentes quimioterapêuticos e que anexinas individuais podem provar ser alvos terapêuticos [30] – [35]. A Anexina 4 (ANX4) gene codifica uma proteína (ou seja, ANX4 ou A4) expressa quase exclusivamente em células epiteliais [31] e sobre-expressa durante o tratamento com paclitaxel e em linhas celulares de paclitaxel-resistente; transfecção de ADNc ANX4 em 293 células T resultou num aumento de três vezes na resistência ao paclitaxel [29], [36]. A correlação entre a presença de anexina 1 (ANX1) e MDR (multi resistência aos medicamentos) proteínas em células de cancro da mama, desde a primeira evidência direta para um papel de uma anexina na resistência a múltiplas drogas [37].
Para avaliar FHIT e anexina 4 interacção, foi realizada uma experiência de co-imunoprecipitação utilizando lisados de proteína preparadas como descrito acima (Figura 1, a e B). FHIT e anexina 4 colocalização foi investigada por microscopia confocal. Como mostrado na Figura 1E, tanto FHIT Anexina e 4 mostram principalmente uma co-localização subcelular citoplasmática.
. células de câncer de pulmão A549 foram infectadas com Ad
FHIT
tipo -wild ou Ad
FHIT-
His6 na MOI50; 48 h após a infecção, as células foram tratadas com o DSP e lisadas com Mem-per eucariótica Membrana kit de extracção de proteína para fornecer totais lisados enriquecidos na fracção de membrana. Total de lisados foram imunoprecipitados com grânulos de níquel. Os imunoprecipitados foram analisados por imunotransferência (IB) com anticorpos anti-anexina A4 anti-FHIT e. B. As células A549 foram transfectadas transitoriamente com um plasmídeo de expressão de mamífero que codifica
Annexin4-
V5 (8 ug). 48 h após a transfecção, as células foram tratadas com o DSP e os lisados totais foram imunoprecipitados (IP) com o anticorpo anti-V5. Os imunoprecipitados foram sondadas por imunotransferência (IB) com anti-FHIT e anti-anexina 4 anticorpos. CD. As células HEK293 foram falsamente tretated ou tretaed com paclitaxel durante 24 horas (800 nm) e lisadas. lisados de proteínas totais foram Immunoprecipited com IgG, FHIT e anexina 4 anticorpos, como indicado. A detecção de anexina endógena 4 e FHIT foi executado sem o uso de DSP reticulante.
Tal como mostrado na Figura 1A e 1B, e anexina FHIT 4 interacção foi detectada principalmente em extractos citossólicos. Nós ainda realizada experiências de co-imunoprecipitação em FHIT endógena e anexina 4 proteínas em células HEK293 e demonstramos a interacção entre estas proteínas também na ausência do DSP agente de reticulação, com ou sem paclitaxel (Figuras 1C e 1D). A imunoprecipitação realizada com o anticorpo FHIT seguido de uma imunotransferência realizada com um anti-soro Anexina 4, foi claramente sugestivo de um complexo endógeno FHIT Anexina-4 em cells.The intacta de maneira directa os IPs entre proteínas endógenas foram claramente indicativa da interacção (IP : FHIT e IB: anexina 4). Infelizmente, devido a dificuldades técnicas, devido à co-migração de IgG e proteína FHIT, a abordagem inversa, que é a imunoprecipitação de proteína endógena anexina 4 seguido por detecção FHIT, foi unsuccessuful.
FHIT blocos superexpressão anexina 4 translocação do citossol para a membrana plasmática
FHIT e anexina 4 a expressão da proteína foi avaliada num painel de linhas celulares de cancro (Figura S1), expressão FHIT é perdida na maioria das linhas celulares investigadas. Para lançar luzes sobre o significado do complexo de proteínas FHIT-anexina 4, realizamos nossos experimentos em dois deles, A549 e Calu-2, que mostram a expressão FHIT ligeira ou não, respectivamente. Para melhor definir a localização subcelular da proteína complexa FHIT-anexina 4, foram realizados experimentos de fracionamento celulares. Como mostrado nas Figuras 2A e 2C, anexina basal 4 é distribuída tanto no citosol e membrana de plasma. O tratamento do cancro do pulmão A549 e Calu-2 células com paclitaxel a depleção induzida citosólica de anexina 4 que foram submetidos a uma translocação aparentemente completa para o lado interior da membrana plasmática. FHIT superexpressão bloqueado Anexina 4 translocação do citosol para a membrana plasmática, observada depois da administração de paclitaxel. Para mostrar que os efeitos foram especificamente dirigido pelo FHIT-Anexina 4 interacção, uma experiência semelhante foi realizada considerando a localização subcelular de Anexina 1 e MDR (proteína de resistência a múltiplas drogas), que estão ambos envolvidos na resistência à quimioterapia [37] , [38]. Tal como mostrado nas Figuras 2B e 2D, nem I nem anexina MDR localizações subcelulares foram influenciados por FHIT superexpressão. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a proteína FHIT interfere especificamente com Anexina 4 translocação do citossol para a membrana do plasma, observado em A549 tratadas com paclitaxel e células Calu-2.
A-C. As células A549 e câncer de pulmão Calu-2 foram infectadas com Ad
GFP
ou Ad
FHIT Restaurant at MOI50; 48 h mais tarde, as células foram falsamente tratadas ou tratadas com paclitaxel (800 nM) durante um adicional de 24 h. As proteínas das fracções citosólicas e de membrana foram separadas num gel de poliacrilamida, transferidas para filtro de nitrocelulose, e sondados com anticorpo Anexina 4. GAPDH e E-caderina foram usadas para normalizar a carga de proteína de proteínas citosólicas e de membrana de plasma, respectivamente. B-D. células de câncer de pulmão A549 e Calu-2 foram infectadas com Ad
GFP
ou Ad
FHIT
tipo -wild; 48 h mais tarde, as células foram tratadas com paclitaxel (800 nM) durante um adicional de 24 h. As proteínas das fracções citosólicas e de membrana foram separadas num gel de poliacrilamida, transferidas para filtro de nitrocelulose, e sondados com Anexina 1 e MDR (proteína de resistência a múltiplas drogas) anticorpos. GAPDH e E-caderina foram usadas para normalizar a carga de proteína de proteínas citosólicas e de membrana de plasma, respectivamente.
Anexina 4 depleção combinado com a sobre-expressão e FHIT sinergicamente o tratamento com paclitaxel induz a inibição da proliferação e desencadeia a apoptose de células de cancro do pulmão
para investigar o papel do bloco FHIT-mediada de anexina 4 translocação do citossol para a membrana de plasma no mecanismo de resistência à droga, foi realizada curvas de crescimento da célula sob condições diferentes. Como mostrado na Figura 3A e 3B para A549 e Calu-2 células de cancro do pulmão, o número de células foi reduzido em Ad
FHIT-
células infectadas, em comparação com os controlos; uma inibição do crescimento celular ligeiramente mais forte foi observada em células tratadas com paclitaxel. Finalmente, de acordo com relatórios anteriores [26], observou-se um efeito sinérgico na inibição taxa de proliferação em células A549 tratadas com paclitaxel mais Ad
FHIT
. Em uma experiência representativa ilustrada na Figura 3C, citometria de fluxo foi usada para investigar perturbações do ciclo celular em células A549 infectadas com Ad
FHIT
, com (800 nM durante 24 horas) ou sem tratamento com paclitaxel; As células A549 infectadas com Ad
FHIT
mostrou um pico sub-G1 foi detectável (13%), de acordo com os nossos achados anteriores [26]; um efeito semelhante foi obtido após a administração de paclitaxel 800 nM. Um efeito sinérgico foi detectada depois de combinar Ad
FHIT
e tratamento paclitaxel (25% da fração de sub-G1).
A-B. As células A549 e Calu-2 foram falsamente infectadas, Ad
GFP
ou Ad
FHIT
células infectadas em MOI10 durante 24 h, depois tratada com ou sem 800 nM paclitaxel por mais 6 horas e contou . Os gráficos de barras mostram a média ± D.P. para os valores a partir de três experiências diferentes (* P 0,05). O methos Chou-Talalay foi aplicada para calcular a natureza das combinações (CI 1, sinergismo). células C. A549 eram ou mock-infectados ou infectados com Ad
GFP
ou Ad
FHIT
, ou para a esquerda não tratada ou tratada com 800 Nm paclitaxel, e depois analisados por citometria de fluxo.
Estes dados sugerem que a restauração da função FHIT para células malignas FHIT-negativas, em combinação com paclitaxel, pode representar uma abordagem potencial novo para o tratamento de pacientes afectados por cancro do pulmão. Na verdade, reduzindo o limiar de sensibilidade para com a administração do fármaco em anexina 4 mediada por tumores quimiorresistentes, FHIT restauração poderia representar uma abordagem intrigante para obter um melhor resultado pacientes.
Para determinar se a interação entre FHIT e anexina 4 pode ter um papel na inibição do crescimento celular mediada por apoptose e FHIT, anexina 4 foi silenciada com pequenos ARN interferentes (siRNAs) concebidos para bloquear a expressão da proteína anexina 4. Como mostrado na Figura 4A, os níveis de expressão da proteína anexina 4 foram significativamente reduzidos após a Anexina 4 siRNAs transfecção, na ausência ou na presença de paclitaxel. Consistente com estudos anteriores [36], as células transfectadas por simulação e de células transfectadas com ARNsi mexidos mostrou Anexina 4 regulação positiva de proteínas após a administração do paclitaxel em comparação com os controlos, ao passo que não foram observadas alterações em amostras A549 Anexina 4-empobrecido, quer na ausência ou na presença de paclitaxel. A combinação do tratamento com paclitaxel com Anexina 4 depleção teve um efeito sinérgico na inibição da proliferação celular, com o número de células sendo significativamente mais baixos em comparação com o tratamento com paclitaxel ou anexina ARNsi 4-específico por si só (Figura 4B). Não se observou qualquer efeito sobre a proliferação após transfecção com siRNAs mexidos. Nós também testamos taxa de proliferação de células A549 depois de anexina 4 silenciamento ou infecção com Ad-
FHIT Restaurant at MOI25 ou tratamentos combinados (Figura 4C). Anexina 4 exaustão e FHIT superexpressão causou uma redução significativa no número de células em comparação com os controlos; uma redução ainda mais dramática no número de células foi observada pela adição de paclitaxel, indicando um efeito sinérgico.
. As células A549 foram falsamente transfectadas ou transfectadas com ARNsi Anexina 4 (50 nm) ou siRNAs mexidos (50 nM) durante 72 h. Células lisados foram imunotransferidas com anticorpos anexina 4 e GAPDH. B. As células A549 foram falsamente transfectadas ou transfectadas com ARNsi Anexina 4 (50 nm) ou mexidos siRNA (50 nM), infectadas com Ad
FHIT
em MOI25 durante 72 h, e, em seguida, deixada sem tratamento ou tratada com paclitaxel ( 800 nm). As células foram contadas primeiro em 12 h após tratamento com paclitaxel. Os gráficos de barras mostram a média ± D.P. para os valores a partir de 3 experiências (* P 0,05). O methos Chou-Talalay foi aplicada para calcular a natureza das combinações (CI 1, sinergismo). C. As células A549 foram falsamente transfectadas ou transfectadas com Anexina 4 siRNA (50 nM) ou siRNAs mexidos (50 nM) durante 72 h, em seguida, não tratados ou tratados com paclitaxel. As células foram contadas 12 horas após a primeiro tratamento com paclitaxel. Os gráficos de barras mostram a média ± D.P. para os valores a partir de 3 experiências (* P 0,05). O methos Chou-Talalay foi aplicada para calcular a natureza das combinações (CI 1, sinergismo). As células A549 D., tratado como descrito em B e C, foram analisadas pelo ensaio de TUNEL.
Um ensaio TUNEL confirmou que todas as populações sub-G1 descritos na Figura 3C foram predominantemente composta de células em apoptose (Figura 4D). Além disso, também os efeitos sobre a inibição da proliferação celular, foi observada uma resultados de um ensaio de TUNEL; na verdade, a apoptose atingiu seu maior grau nas células anexina 4-empobrecido infectadas com Ad
FHIT Comprar e tratados com paclitaxel (Figura 4D).
FHIT /anexina 4 interação além de regressão do tumor paclitaxel induzido em um modelo pré-clínico de câncer de pulmão
Para investigar os efeitos da interação FHIT /anexina A4
in vivo
com ou sem paclitaxel em um modelo pré-clínico de câncer de pulmão, foi realizado um experimento em 11 grupos de Os ratinhos (n = 5 ratinhos /grupo). Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio aprovou este estudo. Três grupos foram injectados por via subcutânea com 1 × 10
7 células A549. Quando os tumores atingiu 15 mm de diâmetro, os ratinhos foram falsamente tratados, tratados com DMSO ou tratada com uma única administração IV de 40 mg /kg de paclitaxel; Os ratinhos foram monitorizados numa base regular. Três dias mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram avaliados em peso. Os tumores dos ratinhos tratados com paclitaxel demonstraram uma redução de 50% em comparação com os controlos. Este breve ponto no tempo nos permitiu ampliar os efeitos de ambos os tretaments individuais e suas combinações, como em pontos temporais mais longos os efeitos do tratamento FHIT seria coberto por paclitaxel. Dois grupos de camundongos foram injetados com 1 × 10
7 células A549 pré-infectados com Ad
GFP
ou Ad
FHIT Restaurant at MOI50, e mais dois grupos foram injetados com 1 × 10 células
7 A549 pré-infectados com Ad
FHIT
a baixa multiplicidade de infecção (MOI5); um dos últimos grupos foi também tratada com paclitaxel, tal como descrito acima. O peso do tumor mostrou redução de 83% em relação ao grupo controle em camundongos injetados com Ad
FHIT
MOI50 células pré-infectados, versus redução de 27% em camundongos injetados com Ad
FHIT
MOI5; Curiosamente, Ad
FHIT
xenotransplantes MOI5 tratados com paclitaxel mostrou regressão do tumor a 7% dos tumores de controlo, indicando um efeito sinérgico de FHIT e paclitaxel.
Para completar o painel, dois grupos de ratos foram injectados com células anexina 4-esgotado (um dos quais foi tratado com paclitaxel, tal como descrito acima) e mais dois grupos de células com anexina 4-empobrecido pré-infectadas com Ad
FHIT
MOI5 (uma tratada com paclitaxel). Anexina 4-empobrecido células mostraram um ligeiro, mas não significativo a redução do tumor em comparação com os controlos, enquanto que uma redução mais elevado foi observado em xenoenxertos de Anexina 4-empobrecido tratados com paclitaxel contra xenoenxertos tratados com paclitaxel sozinho (70% e 50%, respectivamente). Por fim, praticamente não há tumores foram detectados em ratinhos portadores de xenoenxertos com anexina knocked-down 4 pré-infectados com Ad
FHIT
MOI5 mais paclitaxel. Os resultados destas experiências são apresentados na Figura 5A e 5B. Tomados em conjunto, estes dados sublinham a importância da interação FHIT /anexina 4
in vivo
e destacar o valor da terapia genética FHIT combinados e quimioterapia em modelos de cancro pré-clínicos.
A. ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com 1 × 10
7 células A549. Alguns grupos (n = 5 ratinhos /grupo) foram injectados com células tratadas com mock, outras células transfectadas com Anexina 4 siRNA ou infectadas com Ad
FHIT
(MOI5 ou MOI50) ou combinações de ambos. Quando os tumores atingiu 15 mm de diâmetro, os ratinhos foram falsamente tratados, tratados com DMSO ou tratada com uma única administração IV de 40 mg /kg de paclitaxel; Os ratinhos foram monitorizados numa base regular. Três dias após a PTX, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram avaliados em peso. Os gráficos de barras mostram a média ± D.P. para os valores a partir de 5 ratinhos (* P 0,05). O methos Chou-Talalay foi aplicada para calcular a natureza das combinações (CI 1, sinergismo). volumes B. tumorais são relatados ao longo do tempo.
Discussão
A perda da expressão FHIT durante tumorigênese foi relatado para a maioria dos tipos de cancro humano. O seu papel em doenças malignas é sublinhada pelo facto de que a perda FHIT é um evento precoce em tumores, como relatado por lesões pré-cancerosas de pulmão. Além disso, o sucesso
FHIT
terapia genética em uma série de modelos pré-clínicos de câncer humano torna proteína FHIT um bom candidato para a busca de terapias inovadoras [1]. Apesar dos esforços para esclarecer como proteína FHIT funciona, definindo mecanismos específicos através dos quais FHIT modula funções supressoras de tumor apoptóticos e outros tem sido um desafio. Isto foi devido principalmente ao fato de que, até poucos anos atrás, FHIT não tinha parceiros proteína confirmada identificadas por estudos convencionais que visam o isolamento de complexos de proteína-proteína. Nós relataram o isolamento de proteínas que interagem FHIT-se por uma abordagem proteómica [26]; a investigação levou ao isolamento e caracterização de um complexo de proteínas FHIT solúvel contendo Hsp10 /Hsp60 e redutase ferredoxina (Fdxr), entre outras proteínas mitocondriais. Nesse estudo, nós demonstramos que o complexo Hsp10 /Hsp60 estava envolvido na translocação de proteína FHIT para dentro da mitocôndria, onde a sua interação com Fdxr estava envolvido na modulação da produção de espécies reativas de oxigênio, o mais antigo passo na apoptose FHIT mediada. Esta abordagem, visando a identificação de complexos de proteína, sugeriu estudos de acompanhamento para identificar outros interagentes FHIT e suas vias de sinalização funcionais. Em estudos de fraccionamento subcelular, FHIT proteína foi detectada em todos os compartimentos da célula, mas núcleo [26]. Deste modo, foram isoladas complexos proteicos FHIT novos a partir de lisados de proteína A549 enriquecidas em membranas celulares. Esta abordagem produziu uma lista de candidatos, os parceiros FHIT, alguns dos quais foram também identificados em nossa análise anterior [26]. Entre estes novos candidatos, anexina A4 (ANXA4) tinha sido relatado para desempenhar um papel na resistência à droga, com a sua expressão aumentada em clones resistentes ao paclitaxel [36], uma droga utilizada no tratamento de doentes com cancro. Como demonstramos no passado que se FHIT está envolvido em superar a resistência paclitaxel [26], [27], decidimos explorar esta correlação potencial em mais detalhes.
A interação entre FHIT e resposta à quimioterapia tem sido já examinada por Andriani et al [41]. Em particular, a expressão FHIT resultou em sensibilidade reduzida ao etoposido, doxorrubicina, e topotecano. Esta característica foi associada com a regulação negativa induzida pelo FHIT das topoisomerases de ADN I e II. Em contraste, a expressão FHIT produziu um ligeiro aumento na sensibilidade ao cisplatino, como demonstrado por ensaios de formação de colónias [41].
A inactivação de ambos os genes FHIT TP53 e é frequentemente observada em cancros do pulmão de células não-pequenas primárias ( NSCLC) e linhas de células e pode contribuir para a resistência a estímulos apoptóticos induzidos por várias drogas anti-tumor [42]. Neste estudo, demonstramos que a administração paclitaxel induz tanto Anexina A4 aumento da regulação e modificação de sua distribuição intracelular; Na verdade, após o tratamento com paclitaxel, anexina A4 move do citossol para a membrana celular. Curiosamente, FHIT superexpressão em células de câncer de pulmão FHIT-negativas impede anexina A4 translocação do citossol para a membrana celular; Além disso, o tratamento simultâneo de células de cancro A549 com Ad
FHIT
e paclitaxel é muito mais eficaz para desencadear a apoptose de células cancerosas em comparação com os controlos; foram obtidos resultados semelhantes com a administração do paclitaxel em células A549 anexina A4-empobrecido. Estes dados sugerem que tanto a anexina A4 sobre-expressão e a sua membrana de plasma localização subcelular em células de cancro de paclitaxel-resistente não é um efeito espectador, mas sim desempenha um papel activo no mecanismo de resistência à droga; novas investigações da função da anexina A4 na membrana celular pode lançar luz sobre os complexos mecanismos de resistência aos medicamentos em pacientes com câncer. Estes
in vitro
resultados encontrados mais apoio em um modelo pré-clínico de câncer de pulmão; De fato, tanto
FHIT
terapia genética e A4 anexina esgotamento agido sinergicamente com paclitaxel em induzir a regressão do tumor em ratos em comparação com os controles; Esta combinação pode ser de interesse útil no tratamento de doentes com cancro de pulmão. Em conclusão, a investigação anterior e recente sublinha a perda FHIT, uma característica comum em cancro humano, como um marcador de mau prognóstico em pacientes com câncer, o que sugere que os tumores FHIT-negativos são propensos ao desenvolvimento de resistência aos medicamentos.
Materiais e métodos
Declaração de Ética
os ratos foram mantidos e experimentos com animais realizados sob as diretrizes institucionais estabelecidas para o Biotério no The Ohio State University. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Ohio. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio (IACUC número de protocolo: 2010A00000146; data de aprovação 2011/08/15). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia com pentobarbital de sódio, e todos foram feitos esforços para minimizar o sofrimento.
Cultura de células e transfecção experiências
As células A549 foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% CO
2 no meio de crescimento apropriado com suplementos adicionados como recomendado. As células HEK-293 foram utilizados para a geração e amplificação de adenovírus recombinante [18]. As transfecções de anexina 4 pequenos ARN interferentes (piscina inteligente, Dharmacon) foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen).
imunotransferência e fraccionamento análise
proteínas totais foram extraídas com Nonidet P40 (NP-40 ) tampão de lise; proteínas citosólicas e membrana plasmática foram extraídos utilizando o sistema de fraccionamento de células FractionPREP (Biovision). Total de lisados com proteínas da membrana plasmática enriquecidas, usados tanto para espectrometria de massa e imunoprecipita�es análises, foram obtidos utilizando Mem-PER eucariótica membrana Kit extração de proteínas (Pierce).
Para immunoblotting, proteínas (50 mg) foram separados em poliacrilamida geles e transferidas para membranas de filtro de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em leite em pó a 5% sem gordura, incubadas com anti-Anexina primário 4, GAPDH, e anticorpos de E-caderina (Santa Cruz Biotechnology), detectados pelos anticorpos secundários apropriados, e revelados por quimioluminescência aumentada (ECL; Amersham Inc .).
Interacção proteína Análise
experiências de co-imunoprecipitação, com ou sem ditiobis- [succinimidilpropionato] (DSP), um agente de reticulação a partir de Pierce, foram realizados por incubação de 1 mg de um total de os lisados de proteína (fracção contendo membrana plasmática enriquecidas) quer com Nin-TA esferas de níquel agarose magnética (Qiagen) ou com anti-V5 anticorpo conjugado com pérolas de Sepharose, durante a noite a 4 ° C; Após lavagem, as esferas foram fervidas em 1 x tampão de amostra SDS e as proteínas separadas em géis de poliacrilamida 4-20% (Bio-Rad).
Imunofluorescência
células A549, pré-infectadas com Ad
FHIT
, foram fixadas em 4% de PFA (paraformaldeyde) durante 10 min, 4 min permeabilizadas com Triton a 0,05% e analisadas por microscopia confocal. Anexina endógena 4 foi detectada com um anticorpo primário a partir de BD; anticorpo secundário (594 nm) foi de Molecular Probes.
In vitro taxa de crescimento avaliação
As células A549 foram semeadas a 1 × 10
5 células por prato de diâmetro de 60 mm e zombar infectados ou infectados com Ad
GFP
ou Ad
FHIT Restaurant at MOI (multiplicidade de infecção) 50 e tratada com 800 nm paclitaxel. As células foram monitorados e contou a vinte e quatro h intervalos após a infecção. Paclitaxel (LC-Laboratories) foi dissolvido em DMSO como uma solução estoque 1 mM.
Geração de vectores de adenovírus recombinantes
Os adenovírus transportando
FHIT
ou
FHIT-
His6 ADNc (Ad
FHIT
e Ad
FHIT-
His6, respectivamente), sob o controlo transcricional de um promotor de citomegalovírus foram gerados por recombinação homóloga em células HEK-293 como previamente descrito [26] . O anúncio
GFP
vector foi utilizada como controle.
Protein Digestão
complexos de proteínas imunoprecipitadas foram digeridos com tripsina de grau de sequenciação da Promega usando o filtro de placas Multiscreen Solvinert de Millipore (Bedford ).