da arte abstracta

Fundo

Os resultados de pesquisas anteriores mostraram que o tipo II cGMP proteína quinase dependente (PKG II) poderia bloquear a activação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e, consequentemente, inibem a proliferação e a MAPK /transdução de sinal mediada por ERK relacionado da linha celular de cancro gástrico BGC-823, sugerindo que PKG II pode inibir outras vias de transdução de sinal desencadeada-EGFR e afins actividades biológicas de células de cancro gástrico. Este artigo foi concebido para investigar a inibição potencial da PKG II sobre a atividade de migração EGF /induzida pelo EGFR e as vias de transdução de sinal relacionados.

Metodologia /Principais Achados

Em linha de células de câncer gástrico AGS, expressão e actividade de PKG II foram aumentados através da infecção de células com adenovirus construção que codifica PKG II cDNA (Ad-PKG II) e tratando as células com cGMP análogo 8-pCPT-cGMP. A fosforilação de proteínas foi detectado por Western Blotting Ras e proteínas G pequenas e Rac1 activas foi medido pelo método de “puxar para baixo”. actividade de migração celular foi detectado com equipamento de trans-poço. Vinculativo entre PKG II e EGFR foi detectado com Co-IP. Os resultados mostraram EGF estimulou a migração de células AGS e o efeito estava relacionado com PLCγ1 e vias de transdução de sinal mediada por ERK. PKG II actividade de migração induzida por EGF inibida e bloqueada a transdução do sinal iniciada-EGF de PLCγ1 e MAPK /ERK-vias mediadas através da prevenção Tyr 992 induzida por EGF e Tyr 1068 fosforilação do EGFR. PKG II preso com EGFR e causou treonina dele.

Conclusão /Significado

Nossos resultados confirmam sistemicamente a inibição da PKG II sobre a migração induzida por EGF e transdução de sinal relacionado de PLCγ1 e MAPK /vias de ERK mediada, indicando que PKG II tem uma inibição fargoing na transdução de sinal /EGFR relacionados com EGF e atividades biológicas de células cancerosas gástricas através de fosforilação de EGFR e bloqueia a ativação do mesmo

Citation:. Jiang L, Lan T , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu, M. et al. (2013) PKG II Inibe EGF EGFR-Induced Migração /de células de câncer gástrico. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10.1371 /journal.pone.0061674

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de setembro de 2012; Aceito: 12 de março de 2013; Publicação: 16 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China, No.81272755, No.31040002, No.81001100 e No.31100974; A Grant Inovação da Universidade de Jiangsu. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Tipo II proteínas cinases dependentes de cGMP (PKG II) é uma serina /treonina-cinase e os dados de investigação que se acumulam indicou que esta cinase tinha um papel importante na regulação das actividades celulares biológicas, tais como a proliferação e apoptose, especialmente em células tumorais . Em 2004, Cook

et al, achou que PKG II poderia induzir a apoptose de células estromais prostáticas humanas cultivadas [1]. Em 2009, Swartling

et ai relataram que PKG II inibiu a proliferação de células de neuroglioma humano e a inibição foi relacionada com a diminuição da expressão do factor de transcrição Sox9 e a fosforilação da Akt [2]. Em 2011, Fallahian

et al, achou que cGMP poderia induzir a apoptose de células de cancro da mama e este efeito foi relacionado a PKG II [3]. Durante a nossa investigação, descobrimos que a expressão e a actividade de PKG II em linhas celulares de cancro gástrico humano foram significativamente menores do que o de células normais da mucosa gástrica [4]. Um estudo adicional no nosso laboratório mostraram que PKG II poderia inibir a proliferação de linhas celulares de cancro gástrico e bloco de transdução de sinal induzida por EGF da via MAPK /ERK mediada através da prevenção da activação do EGFR por EGF [5], [6]. Uma vez que a activação do EGFR pode iniciar várias vias de transdução de sinal, incluindo a MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT e vias PLCγ1 mediadas [7], [8], o efeito de bloqueio de PKG II na activação do EGFR sugere que esta enzima pode ter um efeito inibidor ampla gama de transdução de sinal e os relacionados actividades biológicas de células de cancro gástrico. Este artigo foi concebido para confirmar este efeito inibitório ampla gama de PKG II através da investigação da inibição de PKG II sobre a atividade de migração induzida por EGF ea transdução de sinal relacionado em células cancerosas gástricas.

Resultados

migração celular induzida por EGF PKG II Inibe a qual está associada com a transdução de PLCγ1 e MAPK /ERK-vias mediadas

a migração celular é importante na fisiologia normal como na doença. Aquisição da capacidade migratória por células cancerosas é uma característica que contribui para a disseminação de células tumorais metastáticas para órgãos distantes. Dados recentes mostraram que o EGF pode estimular a migração de células cancerosas. O mecanismo pelo qual o EGF estimula a migração de células não é clara, mas alguns dados indicam que EGF pode fazer isso através de iniciar a transdução de sinal de PLCγ1 e MAPK /vias mediadas por ERK. Nesta experiência, foram detectados os efeitos de estimulação de migração de EGF em células AGS e utilizado inibidor de componentes chave nas vias de sinalização, para investigar o possível transdução de sinal associada com o efeito. Os resultados mostraram que o tratamento com EGF aumentou a actividade de migração das células AGS e ambos MEK (componente fundamental da via de MAPK /ERK-mediada) U0126 inibidor e PLCγ1 inibidor U73122 inibida induzida por EGF de migração, indicando que o EGF estimulou a actividade de migração das células através da activação de ambos MAPK /ERK e PLCγ1 vias de transdução de sinal mediado (Fig. 1).

actividade de migração das células foi analisada com AGS Transwell sistema. As células foram infectadas com Ad-LacZ ou Ad-PKG II durante 48 horas e privadas de soro O /N. Em Ad-LacZ + EGF e grupos Ad-PKGII + EGF, EGF (100 ng /ml) foi adicionado ao meio de cultura; No Ad-LacZ + + EGF de cGMP e Ad-PKGII + + EGF de cGMP grupos, as células foram tratadas com 8-pCPT-cGMP durante 1 h e, em seguida, EGF (100 ng /mL) foi adicionada ao meio de cultura. O tempo de migração foi de 12 h. A: figuras representativas de células migraram coradas por Giemsa (× 200); B: O número de células que migraram em cada grupo. Os dados apresentados são as médias ± SD de 5 experiências independentes, cada um realizado em duplicado (* P 0,01 comparado com grupo LacZ;

P 0,01, comparado com o grupo LacZ + EGF).

PKG II Blocos de EGF-induzida Tyr Tyr 992 e 1068 a fosforilação do EGFR

Quando o EGF se liga com o EGFR, que faz com que a auto-fosforilação do receptor. Existem vários sítios de auto-fosforilação que estão ligados a diferentes via de transdução de sinal. Tirosina 992 e 1068 tirosina estão entre os locais de auto-fosforilação do EGFR e estão associados com PLCγ1-mediada e sinalização MAPK /ERK mediada respectivamente. Nesta experiência, foi investigado o efeito inibidor de PKG II sobre a fosforilação da tirosina 992 e 1068 Tirosina do EGFR em células tratadas de modo diferente AGS utilizando Western blotting. Os resultados mostraram que o tratamento com EGF provocou um aumento de 14 dobras de tirosina 992 e um aumento de 8 dobras de tirosina 1068 fosforilação do EGFR. Em células infectadas com Ad-PKG II e estimuladas com cGMP, a fosforilação foi significativamente diminuída (Fig. 2, 3). Isto indicou que PKG II poderia impedir tirosina 992 induzida por EGF e tirosina 1068 fosforilação de EGFR e, consequentemente, inibir PLCγ1 mediada e MAPK sinalização /mediada por ERK.

células AGS foram infectadas com Ad-LacZ ou Ad-PKG II durante 48 h e privadas de soro o /n. Em Ad-LacZ + EGF e grupos Ad-PKGII + EGF, as células foram incubadas com EGF (100 ng /ml) durante 5 min. No Ad-LacZ + + EGF de cGMP e Ad-PKGII + + EGF de cGMP grupos, as células foram tratadas com 8-pCPT-cGMP durante 1 h e, em seguida, com EGF (100 ng /ml) durante 5 min. As células foram colhidas e lisadas tal como descrito em materiais e métodos. O lisado celular foi sujeita a transferência de Western com anticorpo contra Tyr 992 fosfo-EGFR e EGFR. Os níveis totais de proteína EGFR foram utilizados como controle de carga. análise de densitometria foi realizada para quantificar as bandas positivas. A: Um representante dos resultados iniciais de três experiências independentes. B: Os resultados da análise de densitometria. Os dados apresentados são as médias ± DP de 3 experiências independentes (* P 0,05, comparado com o grupo LacZ e grupo PKG II;

P 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 uM) grupo + EGF e PKG grupo II + EGF).

AGS células foram tratadas mesmo como descrito na Figura 2. transferência de Western foi utilizada para a detecção Tyr 1068 fosforilação do EGFR e análise de densitometria foi realizada para quantificar a bandas positivas. A: Um representante dos resultados iniciais de três experiências independentes. B: Os resultados da análise de densitometria. Os dados apresentados são as médias ± DP de 3 experiências independentes (* P 0,05, comparado com o grupo LacZ e grupo PKG II;

P 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 uM) + grupo EGF eo grupo PKG II + EGF).

PKG II Previne EGF-desencadeada Principais Eventos de PLCγ1 mediada transdução do sinal Caminho

(1) activação PLCγ1.

PLCy é o componente a jusante da tirosina-quinases receptoras (RTK). Ele tem duas isoformas: PLCγ1 é distribuído e ubiquamente PLCγ2 é expressa principalmente em células hematopoiéticas. Ativação de PLCγ1 requer seu recrutamento para a membrana e de associação, através do seu domínio SH2, com RTKs activado, tal como EGFR. Esta associação deverá resultar na fosforilação de resíduos de tirosina no PLCγ1, particularmente na tirosina 783, e um aumento da sua actividade enzimática. Nós aplicamos o método IP para isolar PLCγ1 e depois usou método de Western Blot para detectar a fosforilação de PLCγ1. Os resultados mostraram que o tratamento com EGF provocou um aumento óbvio de Tyr783 fosforilação de PLCγ1 e o aumento da actividade de PKG II por meio de infectar as células com Ad-PKG II e estimular as células com cGMP eficientemente impedida a fosforilação induzida por EGF de PLCγ1 (Fig. 4 ).

células AGS foram cultivadas em placas de 100 mm e infectadas com a Ad-LacZ ou Ad-PKG II. Em seguida, as células foram o /n e tratadas de modo diferente privadas de soro: no grupo Ad-LacZ, sem tratamento com fármacos; no grupo Ad-LacZ + EGF, as células foram incubadas com EGF (100 ng /ml) durante 5 min; no Ad-PKG grupo II + + EGF de cGMP, as células foram incubadas com 250 | iM de 8-pCPT-cGMP durante 1 h e seguida por incubação com EGF (100 ng /ml) durante 5 min. A imunoprecipitação com o anticorpo contra PLCγ1 foi realizada para precipitar PLCγ1 e a fosforilação de PLCγ1 precipitado foi analisar por transferência de Western com anticorpos contra fosfo- PLCγ1 (Tyr783). Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

(2) formação de DAG.

Uma vez activado, PLCγ1 pode catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bisphos-phate (PI-4,5P

2) em inositol 1,4,5-trifosfato (IP

3) e diacilglicerol (DAG), duas moléculas que regulam a mobilização de Ca intracelular

2 + e proteína quinase atividade C, respectivamente. Para observar os efeitos de EGF e PKG II sobre a formação de DAG, o método ELISA foi utilizado para detectar a concentração DAG em células AGS. Os resultados mostraram que em EGF estimuladas células AGS, o nível de DAG aumentou obviamente e pré-infecção com Ad-PKG II e tratamento com 8p-CPT-cGMP inibida a formação de DAG provocado por estimulação com EGF (Fig. 5).

AGS células foram tratadas mesmo como descrito na Figura 4. A concentração de DAG nos extractos celulares foi medida por ELISA. Os dados apresentados são as médias ± SD de 5 experiências independentes, cada um realizado em duplicado [* P 0,05, comparado com o grupo LacZ;

P . 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 M) + grupo EGF eo grupo PKG II + EGF]

(3) Ca

2+ liberação.

IP3 e DAG são segundos mensageiros em via de transdução de sinal PLCγ1 mediada. IP3 é conhecido por estimular a libertação de cálcio das reservas internas. Utilizou-se cálcio indicador fluo-3 /AM para detectar cálcio no citoplasma. Os resultados mostraram que o tratamento com EGF aumentou a libertação de Ca

2+ a partir do retículo endoplasmático (ER) para o citoplasma e elevada expressão e actividade de PKG II inibiu significativamente a libertação, reverter o efeito de tratamento com o EGF (Fig. 6).

de qualquer Ad-PKG II infectadas ou células que crescem em uma placa de 96 poços Ad-LacZ-infectados foram privadas de soro durante 12 h, carregado com 5 M de membrana indicador de cálcio permeável fluo-3 /AM para 30 min a 37 ° C em DMEM. Após carregamento com Fluo-3 /AM, as células foram lavadas com solução de PBS e suspensas em meio DMEM, e depois incubado com 8-pCPT-cGMP (100 μΜ e 250 μΜ) durante 30 min, e em seguida, estimulada com EGF (100 ng /ml) durante 5 min. As medições de fluorescência foram realizadas utilizando um sistema confocal Olympus FluoView-500. Os dados apresentados são as médias ± SD de 5 experiências independentes, cada um realizado em duplicado [* P 0,05, comparado com o grupo LacZ;

P 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 M) + grupo EGF eo grupo PKG II + EGF]

(4) A ativação PKCα..

PKCα, uma isoforma da proteína quinase C, é um componente chave da via de sinalização PLCγ1 mediada e pode ser activado por Ca

2 + e DAG. Sendo activado, PKCα transloca do citossol para a membrana das células. Assim, a quantidade de PKCα na membrana representa a activação de PKCα. Nesta experiência, foi investigado o efeito inibidor de PKG II sobre a activação de PKCα em células tratadas de modo diferente AGS utilizando Western blotting. Os resultados mostraram que, dentro de cinco minutos após a adição do EGF ao meio de cultura, a translocação de PKCα do citossol para a membrana aumentou dramaticamente e a translocação foi inibida por pré-infecção das células com Ad-PKG II e o tratamento com 8-pCPT-cGMP ( a Fig. 7).

AGS células foram tratadas mesmo como descrito na Figura 4. fraccionamento subcelular em fracções de citosol e membrana foi realizada utilizando membrana e citosol kit de extracção de proteína. Western blot foi usado para detectar PKCα quer na membrana ou no citosol. análise de densitometria foi realizada para quantificar as bandas positivas. A: Um representante dos resultados iniciais de três experiências independentes. B: Os resultados da análise de densitometria. Os dados apresentados são as médias ± DP de 3 experiências independentes (* P 0,05, comparado com o grupo LacZ;

P 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF).

( 5) a ativação CaMKIIα.

Estudos sobre a regulação da Ca

2 + /calmodulina (CaM) dependente quinase II alfa (CaMKIIα), que é uma isoforma principal de CaMKII, sugeriram que, quando Ca

2 + /CAM se liga com CaMKIIα, auto-fosforilação intra-molecular e ocorre a fosforilação mantém a activação persistente do enzima. O anticorpo contra a fosfo-CaMKIIα (Thr286) foi aplicada na transferência de Western para detectar a fosforilação de CaMKIIα. Os resultados mostraram que em células AGS tratadas com EGF, Thr286 fosforilação de CaMKIIα aumentou cerca de 2,5 pregas e infecção com Ad-PKG II e o tratamento com 8-pCPT-cGMP inibiu o aumento da fosforilação induzida por EGF (Fig. 8).

AGS células foram tratadas mesmo como descrito na Figura 2. Western blotting foi aplicado para detectar a fosforilação de CaMK IIα. análise de densitometria foi realizada para quantificar as bandas positivas. A: Um representante dos resultados iniciais de três experiências independentes. B: Os resultados da análise de densitometria. Os dados apresentados são as médias ± DP de 3 experiências independentes (* P 0,05, comparado com o grupo LacZ;

P 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 ^ M) + grupo EGF e PKG II + EGF grupo).

a ativação induzida por EGF PKG II Inibe dos componentes-chave de MAPK /ERK mediada transdução do sinal Caminho

(1) a ativação de MAPK /ERK .

MAPK /ERK é o componente chave de MAPK /via mediada por ERK. A fosforilação em ambas as treonina 202 e tirosina 204 resíduos de ERK1 e treonina 185 e tirosina 187 resíduos de ERK2 é necessária para a activação enzimática completa. O anticorpo contra a P-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) foi aplicada na transferência de Western para detectar a fosforilação de ERK dupla. Os resultados mostraram que, dentro de cinco minutos após a adição de EGF ao meio de cultura celular, a fosforilação de ERK1 /2 em células AGS aumentou dramaticamente (10 dobras) e a fosforilação foi inibida por pré-infecção das células com Ad-PKG II e activar a enzima com 8-pCPT-GMPc (Fig. 9).

AGS células foram tratadas mesmo como descrito na Figura 2. Western blotting foi aplicado para detectar a fosforilação de ERK. análise de densitometria foi realizada para quantificar as bandas positivas. A: Um representante dos resultados iniciais de três experiências independentes. B: Os resultados da análise de densitometria. Os dados apresentados são as médias ± DP de 3 experiências independentes (* P 0,05, comparado com o grupo LacZ;

P 0,05, comparado com o grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 ^ M) + grupo EGF e PKG II + EGF grupo).

(2) a ativação ras.

proteína pequeno G Ras é outro componente-chave na via de sinalização MAPK /mediada por ERK. Tem duas formas nas células: forma activa ligada a GTP e forma inactiva ligada a GDP. Uma vez que é de Ras na forma ligada a GTP, que pode ligar-se e activar Raf-1 e iniciar as consequentes activações de serina /treonina-cinases no percurso de sinal. Nós aplicamos o método “pull-down” para detectar a Ras activado. O resultado mostrou que após a adição de EGF para o meio de cultura, de Ras activa nas células AGS aumentada, obviamente dentro de cinco minutos. Infectar as células com Ad-PKG II e estimulando-as com 8-pCPT-cGMP antes da adição de EGF preveniu significativamente a activação de Ras induzida por EGF (Fig. 10).

O método de “pull-down” foi usada para detectar a Ras activado. O lisado celular foi preparado e quantidades iguais de proteína foram incubadas com esferas de GST-RBD como descrito em materiais e métodos. complexos de ligação foram recolhidas por centrifugação, separadas por SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF e sondadas com anticorpo anti-pan Ras. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

A ativação induzida por EGF PKG II Inibe de RAC1

Small G RAC1 proteína é o principal membro da família Rho que desempenham papel importante na regulando a migração de células cancerosas. Ambos PLCγ1 e MAPK /ERK transdução de sinal mediada pode activar RAC1 e depois estimular a migração de células. Para confirmar ainda mais o efeito inibidor de PKG II na sinalização de EGF /EGFR induzida pelo que está relacionada com a migração, o método de “pull-down” foi aplicado para detectar a inibição da PKG II na activação de RAC1. O resultado mostrou que o tratamento com EGF provocou um aumento óbvio de RAC1 activo e elevada actividade de PKG II eficientemente inibida a activação de RAC1 (Fig. 11). Isto proporcionou uma evidência adicional da inibição de PKG II sobre a migração induzida por EGF de células de cancro gástrico.

O método de “pull-down” foi utilizado para detectar a RAC1 activado. O lisado celular foi preparado e quantidades iguais de proteína foram incubadas com esferas de GST-PBD, como descrito em Materiais e Métodos. complexos de ligação foram recolhidas por centrifugação, separadas por SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF e sondadas com anticorpo anti-pan RAC1. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

PKGII interage com o EGFR e causas Thr-phoshporylation do Receptor

O mecanismo pelo qual PKGII bloqueia a ativação induzida pelo EGF do EGFR foi preliminarmente investigadas neste experimento. Co-imunoprecipitação foi aplicado para detectar a interacção entre o EGFR e PKGII. Western blotting com anti pan fosforilação de anticorpo treonina foi utilizado para detectar a fosforilação do EGFR Treonina causada por PKGII. Os resultados de co-imunoprecipitação mostraram que em células infectadas com Ad AGS-PKG II e estimuladas com 8-CPT-GMPc, a ligação directa entre PKG II e EGFR foi detectada (Fig. 12, painel A). Os resultados de Western blot mostrou que a activação de PKG II causada treonina de EGFR (Fig. 12, painel B). Isto indicou que PKG II bloqueou o EGFR activação através da ligação com o receptor e causando a fosforilação de que

A:. Resultados do Co-imunoprecipitação. AGS células foram cultivadas em placas de 100 mm e infectadas com Ad-PKG II. Depois de ser privadas de soro O /N, tratou-se com 250 | iM de 8-pCPT-cGMP durante 1 h, e incubou-se com EGF (100 ng /ml) durante 5 min, as células foram lisadas e o lisado foi imunoprecipitado com anti-PKG II anticorpo ou IgG de isotipo. Os precipitados foram sondadas com anticorpo anti-EGFR. Cinco percentagem de lisado celular foi utilizado como um controle de entrada de proteína. Também foi realizada a experiência contrária, isto é imunoprecipitado com anticorpo anti-EGFR e sondadas com anticorpo anti-PKG II. B: Os resultados de imunoprecipitação e Western blotting. As células foram tratadas AGS mesmo que o A, e o lisado foi imuno-precipitado com anticorpo contra o EGFR para enriquecer a proteína. Os precipitados foram sujeitos a Western blotting com um anticorpo anti-pan fosforilação treonina. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Discussão

Atualmente, duas proteínas quinases cGMP-dependentes (PKGS), PKG I e II PKG, foram identificados em células de mamíferos [10], [11]. PKG I é amplamente distribuídos no interior do corpo e devido ao seu efeito inibidor sobre o crescimento do tumor e induzir invasividade e efeito sobre a apoptose de células de tumor, que foi identificada como um supressor de tumores [12]. A expressão de PKG II é mais restrito ao tecido [13]. Durante muito tempo, em contraste com o efeito anti-tumor bem provado de PKG I, não há dados pesquisa claramente indicado papel antitumoral de PKG II e esta quinase só foi implicado em diversas funções fisiológicas incluindo a secreção intestinal, crescimento ósseo, e de aprendizagem e memória [14]. No entanto, o interesse pesquisas sobre PKG II está a aumentar e novas funções de PKG II foram encontrados recentemente, incluindo o papel do PKG II na regulação do canal de sódio epitelial e transdução de sinal-mecano [15] – [17]. Mais importante ainda, a acumular dados de pesquisa indicaram que PKG II foi relacionada com a proliferação e apoptose em algumas células, especialmente em células tumorais, que sugere fortemente o papel potencial desta enzima na regulação das actividades biológicas de células de tumor [1] – [6].

EGFR existe na superfície de todas as células. Com um peso molecular de 170KD, o EGFR tem um domínio extracelular, um domínio de trans-membrana e um domínio intracelular. O domínio intracelular de EGFR tem 542 resíduos de aminoácidos e pode ser dividido em sub-membrana aproximada de domínio, da tirosina quinase subdomínio, e C-terminal de Sub-domínio [18]. O processo de activação do EGFR inclui a fosforilação da tirosina do seu domínio intracelular e diferentes locais de fosforilação no domínio estão relacionados com diferentes vias de sinalização. Quando EGFR é activado, ele pode recrutar proteínas efectoras a sua sub-fosforilado domínio C-terminal e inicia as vias mediadas por proteínas efectoras [19], [20]. Entre os locais de fosforilação, tirosina 1068 e 1086 estão relacionadas com a via de MAPK /ERK-mediada e a tirosina 992 e 1173 estão relacionadas com a via de sinal mediada por PLCy [7], [8]. Os resultados anteriores mostraram que PKG II poderia inibir induzida por EGF da tirosina 1068 fosforilação do EGFR na linha celular de cancro gástrico BGC-823 [6], levantando a questão de saber se PKG II pode inibir a fosforilação de outros locais de tirosina em EGF /EGFR e posteriormente têm uma inibição ampla gama on /transduções de sinal induzida por EGFR EGF e actividades biológicas relacionadas de células cancerosas gástricas.

neste trabalho, investigamos a ação de PKG II sobre a atividade de migração induzida por EGF da linha de células de câncer gástrico AGS. O resultado mostrou que PKG II teve uma inibição significativa na migração de células causada por EGF. Isto proporciona mais uma prova para revelar o efeito inibidor do tumor de PKG II. Os dados da pesquisa demonstraram que entre os /EGFR iniciado vias de transdução de sinal EGF, PLCγ1 e MAPK /ERK vias de transdução de sinal mediada estão relacionados com a actividade de migração [21], [22]. Para confirmar este em células de cancro gástrico, utilizou-se inibidor de componente de transdução de sinal para identificar a participação de MAPK /ERK e vias mediadas PLCγ1 no processo. Os resultados mostraram que o inibidor de MEK e U0126 PLCγ1 inibidor U73122 parcialmente bloqueado actividade de migração de EGF /EGFR induzida por células de AGS, indicando que ambas as vias de transdução de sinal participou no processo de regulação. Para elucidar o potencial de acção inibidora de PKG II sobre estas vias de transdução do sinal, nós primeiro explorado o efeito inibidor de PKG II em EGF iniciado PLCγ1-mediada via de transdução de sinal. Os resultados mostraram que PKG II prevenida todos os principais eventos nesta via de transdução de sinal, incluindo a Tyr 992 fosforilação /activação do EGFR, a fosforilação /activação de PLCγ1, a formação do segundo mensageiro DAG, a libertação de cálcio em citoplasma, e a activação de PKC e CaMK IIα. Para a inibição de PKG II com EGF /EGFR induzida MAPK /via de transdução de sinal mediada por ERK, o nosso trabalho anterior tem mostrado que PKG II inibe a activação de todos os componentes-chave na via induzida pelo EGF na linha celular de cancro gástrico BGC-823 [ ,,,0],6]. Neste trabalho, nós investigamos o efeito inibitório do PKG II em EGF activação /induzido-EGFR de componentes-chave nesta via. Os resultados confirmaram que PKG II inibiu a activação induzida por EGF da proteína Ras e MAPK /ERK em células AGS, sugerindo que PKG II também inibida EGF /EGFR induzida por transdução de sinal de MAPK /ERK-mediada via nesta linha celular de cancro. Estes resultados sistematicamente revelou que PKG II inibiu a migração induzida por EGF de células de câncer gástrico através do bloqueio /EGFR iniciado transdução de sinal de EGF de PLCγ1 e MAP /ERK vias mediadas.

A transdução de sinal de ambos PLCγ1 e MAP /ERK vias mediadas pode ativar a proteína G pequena Rac1, que é um componente-chave na regulação da migração celular [23], [24]. Para confirmar a inibição da PKG II sobre este importante evento na migração induzida por EGF de células de gás, foi aplicado o método “pull-down” para verificar a atividade de Rac1 em células AGS diferente tratados. Os resultados mostraram que, durante a migração induzida por EGF, Rac1 foi activado e a activação foi relacionado tanto PLCγ1 e MAP /ERK sinalização mediada. Além disso, PKG II inibiu a activação induzida por EGF da RAC 1. Isto confirmou ainda mais o efeito inibidor de PKG II com EGF /EGFR iniciada a migração celular.

EGFR está intimamente associada com tumorigenensis. Mais de expressão e mutação do EGFR muitas vezes acontecem na maioria dos cânceres. Os dados da pesquisa mostrou que mais de 50% -70% de câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de mama têm alta expressão de EGFR [25]. Além disso, os doentes de cancro com a sobre-expressão de EGFR geralmente têm mau prognóstico. Por exemplo, EGFR sobre-expressão foi detectada em 60% dos pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) eo prognóstico dos pacientes eram pobres, com uma sobrevida de apenas 4-5 meses [26].

In vitro

experimentos confirmaram que a sobre-expressão de EGFR causou transformação de NIH-3T3, Rat-1 e células NRK e bloquear a activação do EGFR inibiu a proliferação de algumas células tumorais [27]. Por conseguinte, o EGFR é o primeiro receptor do factor de crescimento tomado como alvo a terapia do cancro. Vários métodos de inibição da actividade de transdução de sinal de EGFR e afins, incluindo anticorpos específicos contra o EGFR e os inibidores de EGFR, recebeu uma pesquisa intensiva [28] – [30]. Novos e mais eficazes no bloqueio métodos de transdução de sinal mediada pelo EGFR será útil na terapia do cancro. Por conseguinte, o achado de que PKG II pode inibir a activação do EGFR e consequente transdução de sinal tem um significado importante. Ele sugere fortemente que PKG II é um potencial inibidor EGFR endógeno e fornecerá nova dica sobre a estratégia da terapia do cancro.

Os dados da pesquisa mostraram que algumas proteínas quinases pode causar a fosforilação de EGFR e afetar a sua activação e /ou destino. Por exemplo, a proteína quinase C (PKC) pode fazer com que a fosforilação da treonina 654 de EGFR e regula a ligação ao receptor e a internalização [31]. Serina 1046/1047 (/1047 Ser1046) local de fosforilação é necessária para a dessensibilização do EGFR nas células tratadas com EGF [32] .Em nossas experiências, foi detectada a fosforilação de Thr654 e Ser1046 /1047 de EGFR e descobriram que PKG II não causar a fosforilação destes locais de fosforilação. No entanto, os nossos resultados mostraram que havia uma interacção directa entre PKG II e EGFR e PKG II causada Treonina fosforilação do EGFR. Isto indicou que PKG II bloqueou a activação do EGFR através da ligação com a e fosforilar o receptor. O sítio de fosforilação exata será a nossa próxima meta pesquisa.

Line e celular Materiais e Métodos Reagentes

linha de células de câncer gástrico humano AGS foi fornecido pelo Instituto de Biologia Celular (Xangai, China). vetores adenovirais que codificam β-galactosidase (PAD-LacZ) e PKG II (PAD-PKG II) foram presentes amáveis ​​do Dr. Gerry chefe e Dr. Renate Pilz na Universidade da Califórnia, San Diego, de Eagle Modificado de mídia dos EUA Dulbecco (DMEM) e de soro bovino fetal (SBF) eram de GIBCO (Grand Island, NY). O anticorpo contra PKG II foi de ABGENT Biotecnologia (San Diego, CA). De cabra anti-β-actina, de ratinho anti-pan-Ras, e de ratinho anti-anticorpos PLCγ1 eram de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). De coelho anti-p-EGFR (Tyr1068), de coelho anti-p-EGFR de coelho (Tyr992), anti-EGFR, de ratinho anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), de coelho anti-ERK e de coelho anti-p-PLCγ1 (Tyr783) eram anticorpos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Rabbit anti-PKCα e coelho anti-p-CaMK IIα (Thr286) eram de Bioworld Tecnologia (St. Louis Park, MN). anticorpo anti-P-Thr coelho foi de Abcam (MA, EUA) .Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated anticorpos secundários foram a partir de Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). O análogo de cGMP celular permeável 8-pCPT-cGMP foi de Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 e U0126 eram da Sigma (St. Louis, MO). Electroquimioluminescência (ECL) reagentes eram da Millipore (Billerica, MA). Ca

2 + indicador de Fluo-3 /AM e membrana e citosol Kit extração de proteínas eram de Beyotime (Jiangsu, China). Human diacil glicerol (DAG /DG) ELISA Kit era de Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE).