Abstract

O câncer de pâncreas é considerado uma doença letal e refratária ao tratamento. Para obter um potente fármaco anti-cancro, o efeito citotóxico do ácido 2- (benzo [d] oxazol-3 (2H) -ilmetil) – 5 – ((ciclo-hexilamino) metil) benzeno-1,4-diol, dicloridrato de (NSC48693) em humanos células de câncer pancreático CFPAC-1, MiaPaCa-2 e BxPC-3 foi avaliada

em

vitro

. A proliferação de CFPAC-1, MiaPaCa-2, e BxPC-3 é inibida com IC

50 valor de 12,9 ± 0,2, 20,6 ± 0,3 e 6,2 ± 0,6 uM às 48 h, respectivamente. Esta descoberta é seguido com a análise adicional para demonstrar que a inibição NSC48693 é devido à indução da apoptose, incluindo coloração Anexina V, cromatinas de coloração, e ensaios de formação de colónias. É ainda revelado que NSC48693 induz a liberação de citocromo

c

, reduz o potencial de membrana mitocondrial, gera espécies reativas de oxigênio, e ativa a caspase. Estes resultados indicam colectivamente que NSC48693 induz apoptose principalmente de CFPAC-1, MiaPaCa-2, e BxPC-3 células por o circuito apoptótico mediado-mitocondrial. Excitante, o estudo põe em evidência um efeito de inibição encorajador que células de rim embrionário humano (HEK-293) e fígado (HL-7702) são mais resistentes ao efeito de anticrescimento NSC48693 em comparação com as três linhas de células de cancro. A partir desta perspectiva, NSC48693 deve ajudar a abrir uma nova oportunidade para o tratamento de pacientes com câncer pancreático

Citation:. Liu Z, Li D, Zhao W, X Zheng, Wang J, Wang E (2012) a Lead Potent induz a apoptose em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (6): e37841. doi: 10.1371 /journal.pone.0037841

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de agosto de 2011; Aceite: 28 de abril de 2012; Publicação: 20 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China, com as bolsas de No.90713022 e 20735003. J. Wang graças National Science Foundation e os Institutos Nacionais de Saúde para apoios financeiros. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é considerado um câncer agressivo, uma vez que normalmente não é detectada até que atinja a fase tardia [1]. Em 2010, o câncer de pâncreas foi o 4

th causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [2]. Tratamento de doentes com cancro do pâncreas depende, principalmente, cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou métodos terapêuticos combinados. É bem conhecido que o cancro pancreático, muitas vezes tem um mau prognóstico uma vez que o 80-85% dos pacientes apresentam numa fase localmente avançado ou metastásico, impedindo a cirurgia, devido à sua elevada tendência para a invasão local e metástases distantes. A quimioterapia pode ser usada para melhorar a qualidade de vida e ganhar um benefício modesto de sobrevivência de câncer pancreático. Agente único gemcitabina aprovado pelo FDA em 1998, representa atualmente o quimioterápico mais eficaz que melhora a qualidade de vida e prolonga o tempo de vida de pacientes com câncer pancreático avançado para 5 semanas. Devido à ocorrência de quimioresistência à gemcitabina [3], combinações contendo gemcitabina, tais como gemcitabina-erlotinib, -placebo e -oxaliplatin, foram inventados e exibiu efeitos sinérgicos e reduzida resistência [4]. É lamentável que resultados pouco convincentes são encontrados em melhorias clinicamente significativas na qualidade de vida e sobrevivência. Para abordar esta questão, parece haver uma necessidade urgente para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer.

A compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do câncer de pâncreas tem proporcionado muitas esperanças para a descoberta de novos agentes quimioterápicos na terapia do cancro pancreático [5]. A inibição de apoptose desempenha um papel fundamental no processo de degradação de cancro do pâncreas como outros tumores [6]. A apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico altamente controlada e um núcleo via de sinalização [7]. Assim, as drogas anti-cancro como indutor de apoptose tem sido propostos e largamente aceite na terapia de cancros [8]. Alguns trabalhos têm revelado que a terapia de mediar-apoptótico é um horizonte promissor para a terapia em cancros com pouca toxicidade para as células normais circundante devido à sua via de sobrevivência fisiologicamente controlada [9], [10]. A apoptose, portanto, de indução continua a representar uma direcção importante para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de pacientes com cancro pancreático.

No presente estudo, uma vantagem potente denominado como 2- (benzo [d] oxazol -3 (2H) – ilmetil) – 5 -. ((ciclo-hexilamino) metil) benzeno-1,4-diol, dicloridrato de (NSC48693, Figura 1) inibe a proliferação de células de cancro do pâncreas CFPAC-1, MiaPaCa-2, e BxPC -3 através da indução de apoptose na via mediada por mitocondrial

em

vitro

. Excitante, o efeito citotóxico do NSC48693 em células cancerosas é mais pronunciada do que as células normais de rim embrionário humano (HEK-293) e fígado (HL-7702). Estes resultados suportam um papel para NSC48693 como indutor de apoptose potente de câncer pancreático.

Materiais e Métodos

Materiais

Todos os produtos químicos, incluindo Ac-DEVD-FMK ( inibidor da caspase-3) e Ac-LEHD-fmk (inibidor da caspase-9) foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO), a menos que indicado de outra forma. DMEM, IMDM e soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos à Gibico (Grand Island, NY). Os anticorpos primários contra a caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bcl-2, Bax, citocromo

C

e conjugado com peroxidase anti-rato de cabra ou anti-coelho de anticorpo secundário, bem como do isotipo IgG1 de ratinho, de cabra anti- IgG1 de ratinho FITC foram adquiridos a BD Bioscience (San José, CA). NSC48693 foi gentilmente fornecida a partir de NCI /DTP Abrir Chemical Repository (https://dtp.cancer.gov). NSC48693 foi dissolvido em DMSO para fazer uma solução estoque (10 mg /ml) e diluiu-se a várias concentrações com água duplamente destilada contendo 10% de DMSO.

Antecedentes da NSC48693

Os estudos extensos sobre o cancro do pâncreas identificaram que a sinalização de Ras é envolvida na regulação de apoptose. O desenvolvimento de drogas que alvejam Ras e induzindo a apoptose está sendo perseguido intensamente na descoberta de medicamentos. O GTP-bound activa Ras está em equilíbrio com três estados diferentes, um dos quais é a conformação aberta sem sinalização que é um intermediário transiente durante a hidrólise de GTP [11]. Isto implica que a Ras intermediário é um ponto convergente para a sobrevivência de sinalização no cancro pancreático. Actualmente, por conseguinte, a conformação aberta parece ser o alvo mais promissora para a concepção de medicamentos. A estrutura de GppNHp-bound RasG60A-GTP (PDB ID: 1XCM [11]) foi utilizada nos cálculos de encaixe. Todos os cálculos foram realizados de encaixe usando o pacote AutoDock [12]. O banco de dados do National Cancer Institute (NCI) Conjunto diversidade foi utilizado para a triagem virtual. Em seguida, classificados estas pequenas moléculas de acordo com a afinidade e especificidade definida previu [13]. 2- (benzo [d] oxazol-3 (2H) -ilmetil) -5 – ((ciclo-hexil- amino) metil) benzeno-1,4-diol, dicloridrato de (NSC48693) escolhido a partir do banco de dados NCI demonstrou efeito de inibição do crescimento sobre linhas celulares de leucemia CCRF-CEM e MOLT-4 conforme mostrado na tela Câncer NCI dados Actuais (https://dtp.nci.nih.gov). Little esforços concentrar-se sobre o efeito da NSC48693 sobre o câncer de pâncreas, portanto, oferece uma escolha selecionada de indutor de alta qualidade de apoptose.

Cultura celular

As linhas celulares de cancro pancreático humano CFPAC-1, MiaPaCa -2, e BxPC-3 foram obtidos a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e cultivadas em DMEM e meio IMDM suplementado com 10% FBS e antibióticos (100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina), respectivamente. O rim embrionário humano 293 (HEK-293) e fígado (HL-7702), as células foram obtidas a partir da Academia Chinesa de Ciências Type Culture Collection (Xangai, China) e incubadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. As células foram descoladas da monocamada utilizando tripsina a 0,25% e EDTA 0,53 mM durante 5 min a 37 ° C quando as células foram cultivadas até próximo da confluência.

Hoechst 33342 Coloração

A três pancreático humano células cancerosas (1 × 10

5 células /placa) foram respectivamente semeadas em 6 bem-placa com fundo de vidro e deixadas a ligar durante a noite. As células cultivadas em 135 meio uL de DMEM foram tratados através da utilização quer de 15 uL de 250 ug /mL NSC48693 (concentração final de 25,0 ug /mL) como grupos experimentais ou 15 uL de água duplamente destilada contendo 10% de DMSO como grupos de controlo, e em seguida cultivadas durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO

2 condições. Em seguida, as células foram fixadas em MeOH-HOAc (03:01, v /v) durante 10 min a 4 ° C e, em seguida, coradas utilizando kit de Hoechst 33342 (KEYGEN Biotech, Nanjing, China). As células coradas foram analisadas por microscopia confocal de varrimento a laser (TCS SP2, Heidelberg, Alemanha).

Citotoxicidade

A viabilidade celular de três células de cancro do pâncreas e duas células normais humanos (1 × 10

4 células /poço em placas de 96 poços) depois de ter sido tratada por água duplamente destilada contendo 10% de DMSO como grupos de controlo ou de várias concentrações de NSC48693 como grupos experimentais foi avaliada por ensaio de azul tiazolilo brometo de tetrazólio (MTT). As células foram tratadas durante 48 h e em seguida a densidade óptica (OD) a 490 nm foi lida com um AutoReader 96 poços Multiscanner (Biotech Instruments, New York). O MTT não interferir com NSC48693 e provoca uma resposta positiva.

agar mole Ensaios

Os ensaios de agar mole foram realizados essencialmente como descrito anteriormente [14]. As suspensões de células únicas de células de cancro do pâncreas contendo 1 × 10

4 células em ágar a 0,3% foram colocados em 3,5 cm de pratos no topo de uma camada de gel de 1% de agar em meio (DMEM ou IMDM com 10% de FBS) e cultivadas com água duplamente destilada contendo 10% de DMSO como grupos de controlo ou de várias concentrações de NSC48693 como grupos experimentais a 37 ° C. Colónias foram fixadas com glutaraldeído 2,5% e contou marcando apenas as colónias que eram maiores de 10 células de diâmetro sob Olympus X71 microscópio de fase invertida (Dr. Schumann Optik OHG, Hessen, Alemanha). Percentagem de colónia eficiência formando foi calculado como o número de colónias /100 células semeadas.

apoptose Ensaios

A apoptose de três células de câncer pancreático (1 × 10

6 células /poço em 24 poços placa) depois de ser tratado por água bidestilada contendo 10% de DMSO como grupos de controlo ou várias concentrações de NSC48693 como grupos experimentais foi medida por anexina V-FITC /iodeto de propídio (PI) kit de detecção de apoptose (keygen Biotech, Nanjing, China ). A quantificação de sinais de FITC e PI foi realizada utilizando fluorescência classificador de células activadas FACSAria (BD Bioscience, San Jose, CA) e a percentagem de células coradas em cada quadrante foi quantificada utilizando software de diva 6,0 (BD Bioscience, San Jose, CA). No total, foram analisados ​​10000 eventos para cada amostra.

Ensaio de Actividade de Caspase

As células foram cultivadas em 6 poços de placas (5% de CO

2, 37 ° C) a densidade de sementeira de 2 × 10

6 células /poço. As placas foram pré-incubadas durante a noite antes de as soluções de fármaco foram adicionadas a cada poço. Após um período de exposição (24 ou 48 h) com várias concentrações NSC48693, células colhidas por tripsinização com solução de tripsina /EDTA foram lavadas por solução de PBS e a actividade da caspase-3, caspase-8, e caspase-9 foi determinada por caspase kit de ensaio de atividade (keygen Biotech, Nanjing, China), respectivamente. DEVDase, IETDase, e LEHDase actividade foi determinada medindo a clivagem proteolítica de substratos cromogénicos Ac-DEVD-pNA, Ac-IETD-pNA, e Ac-LEHDpNA, que foram utilizados como substratos para a caspase-3, caspase-8, e caspase proteases -9-like, respectivamente [15]. A absorvância de pNA enzimaticamente libertado foi medida a 490 nm num AutoReader Multiscanner.

Após 24 h de aderência, as células (1 x 10

5 células /placa) foram tratados com 25,0 ug /ml de NSC48693 durante 48 h. Em seguida, as células foram examinadas através de microscopia confocal de varrimento laser.

Análise do citocromo

c

lançamento

As células foram cultivadas em 24 poços da placa (5% de CO

2, 37 ° C) a densidade de sementeira de 5 × 10

4 células /poço. As placas foram pré-incubadas durante a noite antes de as soluções de fármaco foram adicionadas a cada poço. Após um período de exposição (6 ou 12 h) com várias concentrações NSC48693, as células foram colhidas por tripsinização com solução de tripsina /EDTA e lavadas com solução salina equilibrada de Hanks suplementada com 2% de albumina de soro bovino e 0,2% de azida. Em seguida, as células foram fixadas e permeabilizadas utilizando o kit Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience, San Jose, CA). ligação de anti-citocromo inespecífica

anticorpo c

foi bloqueada com IgG1 mouse. Anti-citocromo

C

(7H8.2C12) foi adicionado durante mais 30 min a 4 ° C. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo de cabra anti-IgG1 de ratinho FITC (1:20) durante 30 min a 4 ° C. Após lavagem com solução Perm /Wash, as células foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo (FCM). No total, 10.000 eventos por amostra foram adquiridos e analisados.

Medição da mitocôndria potencial de membrana (ΔΨm)

As alterações nas ΔΨm foram medidos por Rodamina-123 (Rho-123) corante [16] . As células foram cultivadas em 24 poços de placas (5% de CO2, 37 ° C) a densidade de sementeira de 5 × 10

4 células /poço. As placas foram pré-incubadas durante a noite antes de as soluções de fármaco foram adicionadas a cada poço. Após um período de exposição (48 horas) com várias concentrações NSC48693, células colhidas por tripsinização com solução de tripsina /EDTA foram lavadas por solução de PBS e incubadas com Rho-123 (10 ug /mL). Depois disso, a Rho-123 de fluorescência foi medida por FCM. A percentagem de Rho-123- células representa o efetivo colapso ΔΨm; a redução de Rho-123 indica a perda de ΔΨm em células [16]. No total, 10.000 eventos foram analisados ​​em cada amostra.

Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

Fluxo de detecção por citometria de ROS foi realizada como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, as células foram cultivadas em placa de 24 poços (5% de CO

2, 37 ° C) a densidade de sementeira de 5 × 10

4 células /poço. As placas foram pré-incubadas durante a noite antes de as soluções de fármaco foram adicionadas a cada poço. Após um período de exposição (2 h) com várias concentrações NSC48693, as células foram colhidas por tripsinização com solução de tripsina /EDTA e, subsequentemente, a intensidade de fluorescência de ROS foi determinada por FCM. níveis de ROS foram expressas como percentagem, que foi calculada pelo software diva 6.0. No total, foram analisados ​​10000 eventos para cada amostra.

Após 24 h de aderência, as células (1 x 10

4 células /poço em placa de 96 poços ou 1 × 10

4 em células 3,5 centímetros prato) foram tratados com várias concentrações de NSC48693, tal como indicado, durante 48 h. Então, a inibição do crescimento foi avaliada pelo método de MTT (A) e ensaios de crescimento independente de ancoragem (B), respectivamente. Cada valor representa a média ± SD em três experimentos independentes.

Western Blot

As células (2 x 10

6 células) foram semente para placa de 10 cm e cultivadas na incubadora durante a noite. Em seguida, as células foram expostas com 1 ou 2 × IC

50 concentração de NSC48693 e 10% de DMSO (controlo) durante 24 h. proteínas de células inteiras e frações mitocondriais foram isoladas usando o kit de extração de proteínas (Keygen Biotech, Nanjing, China). As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Keygen Biotech, Nanjing, China). Quantidades iguais de proteínas foram fraccionadas utilizando 12% de SDS-PAGE e depois transferidos para o difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas. As membranas foram incubadas com anticorpos primários contra a caspase-3, caspase-8, caspase-9, citocromo

C

, Bcl-2, Bax e, depois de ter sido bloqueada com 3% de BSA em TBS. As membranas foram incubadas com anti-rato de cabra conjugado com peroxidase anti-coelho ou anticorpo secundário. Actina foi utilizada para a carga de controlo. No ensaio de inibição para a caspase-3 e caspase-9, as células foram pré-tratadas por 20 jiM de Ac-DEVD-fmk ou Ac-fmk -LEHD durante 2 h após a adesão, e o meio foi alterado pela cultura contendo 2 × IC

50 concentração de NSC48693 ou 10% de DMSO.

Análise estatística

Todos os dados foram expressos como médias ± DP de experiências em triplicado, e a reprodutibilidade foi confirmada em pelo menos três experiências separadas. A análise estatística foi feita usando o programa SPSS 11.5 software estatístico.

Após 24 h de aderência, as células (1 x 10

4 células /poço em placas de 96 poços) foram tratados com diferentes concentrações de NSC48693 como indicado para 48 h. Em seguida, os ensaios de inibição de crescimento foi avaliada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± DP de três experiências independentes.

A extensão da apoptose induzida em células de cancro (1 × 10

6 células /poço em placas de 24 poços), tratados com 25,0 ug /ml de NSC48693 em MiaPaCa-2, 12,5 ug /ml de NSC48693 em CFPAC-1, e 6,25 ug /mL de NSC48693 em BxPC-3, durante 24 ou 48 horas foi medida por FCM, respectivamente. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados; e cada valor representa a média ± SD em três experimentos independentes.

Resultados

celular NSC48693 Alterações Morfologia

morfologia celular pode ser usado como um parâmetro para medir o efeito de um composto sobre a toxicidade celular. Uma vez que a condensação nuclear ocorre nesta fase da apoptose, a morfologia apoptótica do núcleo será evidente após coloração [18]. A coloração nuclear com Hoechst 33342 demonstra que as células em grupos de controlo são proporcionais e bem distribuída (Fig. 2). Em comparação com a morfologia nuclear normal, alterações morfológicas típicas, incluindo o colapso do citoesqueleto, a formação de corpos apoptóticos e fragmentação nuclear, são observadas nas células tratadas como mostrado com setas na fig. 2. Estas características consistentemente ocorreu durante esta forma de morte celular, que eram todos os caracteres comuns de morte de células [19].

As células (2 x 10

6 células /poço em placas de 6 poços) foram tratados com NSC48693, nas concentrações indicadas, durante 24 (a, B, C) ou 48 horas (D, e, F), em seguida, examinada. Cada valor representa a média ± SD em três experimentos independentes.

As células (5 × 10

4 células /poço em placa de 24 poços) foram tratados nas doses indicadas para 6 (CFPAC- 1 e BxPC-3) ou 12 h (MiaPaCa-2). citocromo intracelular

c

foi detectado pelo anticorpo 7H8.2C12 em células fixas e permeabilzed. Percentagens representam a proporção de células com citocromo reduzido

c

sinal. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados; e cada valor representa a média ± SD em três experimentos independentes.

NSC48693 Inibe a proliferação celular

Além da análise comparativa detalhada das alterações morfológicas, foi detectada a citotoxicidade de NSC48693 às células através da perda de viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT [20]. Como mostrado na Fig. 3A, a viabilidade das células cancerosas é significativamente diminuída por NSC48693 com a dose de exposição aumentado. NSC48693 inibe a proliferação de células cancerosas com IC

50 valor de 12,9 ± 0,2 uM para CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 uM para MiaPaCa-2, e de 6,2 ± 0,6 uM para BxPC-3 a 48 h, respectivamente. Isto foi ainda apoiado pela capacidade de NSC48693 para bloquear o crescimento independente de ancoragem de células de cancro em agar mole. Quando comparado com os grupos de controlo, as células cancerígenas formam colónias mais pequenas e menos quando cultivadas na presença de NSC48693. Tal como indicado na Fig. 3B, esta resposta ocorre de um modo dependente da dose. Combinados com os resultados, podemos concluir que NSC48693 diminui a proliferação de células cancerosas de uma maneira dependente da dose.

citotóxicos Efeitos de NSC48693 em células HEK-293 e HL-7702

Como mostrado na Fig . 4, a viabilidade das células de HEK-293 e HL-7702 é de 63,4 ± 4,1% e 91,2 ± 2,9% numa dose de 25,0 ug /mL de NSC48693, respectivamente. NSC48693 inibe a proliferação de células HEK-293 e células HL-7702 com um

valor de IC 50 144,5 ± 8,8 uM e 198,6 ± 11,3 uM às 48 h, respectivamente. Obviamente, os efeitos citotóxicos da NSC48693 sobre células humanas normais são menos sensíveis do que as células cancerosas CFPAC-1, MiaPaCa-2, e BxPC-3, em comparação com a Fig. 3.

As células (5 × 10

4 células /poço em placas de 24 poços) foram tratados com as doses indicadas, durante 48 h. Em seguida, os experimentos foram sujeitos a FCM. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados; e cada valor representa a média ± DP de três experiências independentes.

NSC48693 induz a apoptose

Para descartar a possibilidade de que a inibição do crescimento celular foi devido a efeitos citotóxicos, ensaio de apoptose foi realizada . As células positivas para anexina V-FITC e negativas para PI estão em fase inicial da apoptose, como mostrado no quadrante Q4, enquanto que as células positivas para ambos Anexina V-FITC e PI está na fase tardia de apoptose ou necrose, como mostrado no quadrante Q2 [21 ]. Assim, o grau de apoptose correlacionada com a quantidade de células V-FITC anexina positivas. E a integridade da membrana intacta avaliada por coloração PI negativa sugere que a apoptose, mas não de necrose é o caráter de apoptose. Como mostrado na Fig. 5, há pouca ligação de anexina V-FITC para as células de controlo, ao passo que a ligação após o tratamento com NSC48693 é aumentado, como mostrado no quadrante Q4. Quanto MiaPaCa-2 células tratadas a uma concentração de 25,0 jig /mL de NSC48693, a ligação é aumentada de 73,1 ± 1,0% para 82,7 ± 2,8% às 24 h e 48 h. A ligação é aumentada de 37,1 ± 2,0% para 50,5 ± 3,1% às 24 h e 48 h, após as células CFPAC-1 são tratados em 12,5 ^ g /mL de NSC48693. Enquanto a ligação é aumentada de 46,4 ± 2,4% para 55,0 ± 1,1% às 24 h e 48 h, após as células BxPC-3 são tratados por 6,25 ug /mL de NSC48693. Combinado com estas observações, é evidente que o efeito de NSC48693 em células de cancro é mediado principalmente por indução de morte celular apoptótica.

Activação de caspase

Como principais mediadores da apoptose, a activação de caspase depende da clivagem proteolítica da procaspase. Para melhorar a nossa compreensão se caspase estava envolvido na apoptose induzida por NSC48693 em células cancerosas, examinamos a atividade das enzimas de caspases com um ensaio espectrofluorométrico usando seus substratos correspondentes [22]. Como mostrado na Fig. 6A, C, D, M, a actividade de caspase-3 e caspase-9 é aumentada de uma maneira dose-dependente e tempo em comparação com células não tratadas em três células cancerosas; a actividade de caspase-8 ligada aos receptores de morte deixa de ser aumentada em CFPAC-1 e BxPC-3 de células (Fig. 6B, E). No entanto, a actividade de caspase-8 em células de MiaPaCa-2 é aumentada de um modo de dose e dependente do tempo em comparação com células não tratadas. Estes resultados implicam que NSC48693 activa a via de apoptose mediada por mitocôndrias intrínseca que conduz à activação da caspase para induzir apoptose em células CFPAC-1 e BxPC-3. Para as células MiaPaCa-2, NSC48693 ativa tanto o receptor de morte mitocondrial e da membrana via apoptótica.

As células (5 × 10

4 células /poço em placa de 24 poços) foram tratados nas doses indicadas para 2 h. Em seguida, os experimentos foram sujeitos a FCM. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados; e cada valor representa a média ± DP de três experiências independentes.

se quantidades iguais de proteínas celulares foram fraccionados em 12% de gel SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. Actina foi utilizada para controlar o carregamento.

A libertação de citocromo

c

A libertação de citocromo

c

é um passo crucial controlar a apoptossomo via. Clone 7H8.2C12 foi escolhido para detectar especialmente citocromo intracelular

c

. Portanto, a redução do citocromo

c

sinal detectado pelo anticorpo 7H8.2C12 reflete citocromo mitocondrial

c

lançamento e início precoce da apoptose [23]. Como mostrado na Fig. 7, BxPC-3 células em grupos de controle têm baixo nível de citocromo

c

(11,8 ± 1,7%), enquanto o tratamento NSC48693 aumenta citocromo mitocondrial

c

liberação de 32,9 ± 1,3% para 36,9 ± 1,4% às concentrações de 25,0 e 50,0 ng /mL, durante 6 h. CFPAC-1 células não tratadas por NSC48693 tem citocromo mitocondrial normal de

c

nível (7,9 ± 1,9%), enquanto que o citocromo mitocondrial

c

níveis de release são aumentou de 35,9 ± 1,2% para 47,6 ± 0,6 0,9% às concentrações de 25,0 e 50,0 ng /mL, durante 6 h. Além disso, as células de MiaPaCa-2 tratadas por NSC48693 tem um citocromo mitocondrial aumentada

C

libertação de 4,6 ± 1,8% no grupo controlo para 19,0 ± 1,3% e 29,3 ± 2,8% na concentração de 25,0 e 50,0 ug /mL durante 12 h, respectivamente.

Perda de ΔΨm

ΔΨm pode ser produzido quando protões foram bombeados da matriz mitocondrial para o espaço inter-mitocondrial [24]. E a dissipação de ΔΨm tem sido associada a algumas vias apoptóticas, incluindo via apoptótica mitocondrial [25]. Absolutamente a maioria das células não tratadas têm membrana plasmática intacta e ΔΨm normal, no entanto, a perda de ΔΨm exibe um aumento de forma dependente da dose depois as células foram tratadas com NSC48693 a 12,5 e 25,0 ug /ml durante 48 h (Fig. 8). Depois de células MiaPaCa-2 a ser tratada com NSC48693, a percentagem de ΔΨm colapso atinge 13,3 ± 1,9% e 24,7 ± 1,8%, respectivamente. E a percentagem de ΔΨm colapso das células CFPAC-1 atinge 18,9 ± 1,1% e 34,2 ± 2,9%, respectivamente. Embora a percentagem de células em colapso ΔΨm BxPC-3 é óbvia e atinge 24,9 ± 2,4% e 92,9 ± 8,9%, respectivamente. As experiências de proporcionar uma base suficientemente precisos para a conclusão de que as células cancerosas tratadas por NSC48693 perder ΔΨm.

se quantidades iguais de proteínas celulares foram fraccionados em 12% de gel SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. Actina foi utilizada para controlar o carregamento.

A geração de ROS

A geração de ROS está diretamente relacionada à mitocôndria [16]. Como demonstrado na Fig. 9, a análise por citometria de fluxo revelou que 2 MiaPaCa-células não tratadas têm baixo nível de ROS endógena (18,0 ± 0,3%), enquanto que o tratamento NSC48693 aumenta significativamente intracelular níveis de ROS de 58,0 ± 2,3% para 68,0 ± 4,4% às concentrações de 50,0 e 100,0 ug /mL durante 2 h. CFPAC-1 por células não tratadas têm NSC48693 nível ROS endógena normal (2,5 ± 1,6%), enquanto que os níveis de ROS são aumentou de 74,0 ± 2,8% para 81,4 ± 0,5% às concentrações de 12,5 e 25,0 ng /mL durante 2 h. Além disso, os níveis de ROS são aumentou de 9,8 ± 1,3% para 16,4 ± 2,7% após células BxPC-3 são tratados por NSC48693 às concentrações de 25,0 e 50,0 ng /mL durante 2 h.

Efeito do NSC48693 sobre As proteínas relacionadas apoptose-

O efeito de NSC48693 em proteínas relacionadas com a apoptose foi confirmada por transferência western, como mostrado na Fig. 10. NSC48693 tratamento aumento da clivagem de caspase-9 e caspase-3 de um modo dependente da dose. A expressão de clivada pela caspase-8 foi quase não detectável em células CFPAC-1 e BxPC-3. No entanto, a clivagem de caspase-8 foi óbvio em células MiaPaCa-2, que foi acordo com a actividade da caspase, como mostrado na Fig. 6. Simultaneamente, a expressão da proteína Bcl-2 caiu regulamentada e Bax estava regulamentado. O citocromo

c

no citosol foi reforçada concomitante com a atenuação relacionado de citocromo

c

na mitocôndria. Além disso, os inibidores específicos da caspase-9 e caspase-3 aboliu quase completamente a sua clivagem induzida por NSC48693 de caspase-9 e caspase-3, respectivamente (Fig. 11).

Discussão

Embora os medicamentos quimioterápicos descoberto ainda têm de alcançar qualquer progresso real na terapia clínica até o momento, a quimioterapia ainda é uma espinha dorsal no tratamento do cancro do pâncreas avançado no momento [25]. Assim, novos fármacos quimioterapêuticos com diferentes modos de acção são sempre na necessidade para o tratamento de doentes com cancro pancreático. O mecanismo de morte celular induzida por fármacos quimioterapêuticos se pensa ser um mecanismo apoptótico endógena. Assim, a indução de apoptose em células de cancro foi reconhecido como uma estratégia inovadora para a descoberta de medicamentos a terapia do cancro [26] – [28]

indutores apoptóticos potenciais devem matar células de cancro em vez de causar excessiva toxicidade para os normais.. No presente estudo, nós nos concentramos em avaliar o efeito da NSC48693 sobre a morte através da indução de apoptose de células cancerosas no pâncreas humanos CFPAC-1, MiaPaCa-2 e BxPC-3

em

vitro

. Parece que as células cancerosas e normais reagir de forma diferente para a exposição NSC48693 em ensaios MTT. Os resultados de viabilidade celular indicam que a viabilidade das células cancerosas é significativamente inibida por NSC48693 com IC50 de 12,9 ± 0,2 uM para CFPAC-1, 20,6 ± 0,3 uM para MiaPaCa-2, e de 6,2 ± 0,6 uM para BxPC-3, respectivamente. No entanto, a sensibilidade das células normais para NSC48693 é consideravelmente diferente. Em contraste, nenhuma citotoxicidade óbvia é detectada em células normais com IC

50 144,5 ± 8,8 uM para células HEK-293 e 198,6 ± 11,3 uM para HL-7702, respectivamente. Estes resultados proporcionam evidência directa de que as células normais de células HEK-293 e HL-7702 são mais resistentes aos efeitos anti-crescimento de NSC48693, em comparação com as células cancerosas CFPAC-1, MiaPaCa-2, e BxPC-3. Com base no efeito inibidor do crescimento causada por NSC48693 em células cancerosas como mostrado na Fig. 3, a apoptose celular em resposta a NSC48693 foi investigada. FIG. 5 NSC48693 sugere que desencadeia a morte celular apoptótica de células de cancro do pâncreas, o que implica que tem maior citotoxicidade NSC48693 via indução marcada morte celular por apoptose em células cancerosas. Além disso, diferentes tipos de células variar profundamente na sua susceptibilidade para a indução de apoptose, que leas de limiares distintos celulares existentes para a indução de apoptose [29]. A questão crítica é em torno tecidos ou células normais podem parar e reparar os danos, enquanto as células tumorais morrem por apoptose. NSC48693 parece ser menos tóxico para as linhas de células normais, o que pode atribuir a esta possibilidade de que as células normais têm alguns mecanismos de protecção contra NSC48693 [30]. Durante a redução celular normal, o peróxido de hidrogénio e gera radical hidroxilo ocorre. Estes podem ser perdido através de desacoplamento ou expulsos, levando a danos oxidativos. As células normais possuem mecanismos de protecção para desintoxicar excessiva de ROS, que conduz à redução do efeito tóxico do NSC48693 em células HEK-293 e HL-7702.

A apoptose pode ser desencadeada por estímulos diversos, e mitocôndrias são considerados para jogar um papel central em ambos dependente de caspase e caspase-independente apoptose [31]. As mitocôndrias iniciar duas vias de apoptose diferentes, a saber, a via mitocondrial e intrínseca via do receptor de morte membrana extrínseca [32]. Para a maior de fármacos quimioterapêuticos, a apoptose é iniciada pela via intrínseca mitocondrial [27], [28]. Assim, a compreensão da regulação da via apoptótica mitocondrial intrínseca é importante para o desenvolvimento de novo indutor da apoptose e verificar a indução da apoptose.