Abstract

Fundo

O câncer de próstata é o câncer mais comum entre em homens idosos, os EUA e a imunoterapia tem sido mostrado para ser uma estratégia promissora para o tratamento de pacientes com cancro da próstata metastático resistente à castração. Os esforços para identificar antigénios específicos de tumor da próstata romance irá facilitar o desenvolvimento de vacinas contra o cancro eficazes contra o cancro da próstata. receptor acoplado específico da próstata G-proteína (PSGR) é um novo antigénio que tem sido mostrado para ser especificamente sobre-expressos em tecidos de cancro da próstata humana. Neste estudo, descrevemos a identificação de epítopos peptídicos derivados de PSGR reconhecidos por células CD8 +

T de uma forma dependente A2-HLA.

Metodologia /Principais Achados

Vinte e um péptidos derivados de PSGR foram previstos por uma abordagem imuno-informática com base no motivo de ligação a HLA-A2. Estes péptidos foram examinadas quanto à sua capacidade para induzir respostas de células T específicas do péptido em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de qualquer HLA-A2

+ dadores saudáveis ​​ou de pacientes com HLA-A2

+ cancro da próstata. O reconhecimento de células LNCaP positivas e PSGR expressando HLA-A2, também foi testada. Entre os 21 péptidos derivados de PSGR, três péptidos, PSGR3, PSGR4 e PSGR14 frequentemente induzidas respostas de células T específicas do péptido em PBMCs de dois dadores saudáveis ​​e de doentes com cancro da próstata. É importante ressaltar que estas células T específicas do péptido reconhecido e matou as células cancerosas da próstata LNCaP em uma classe de HLA forma I-restrito.

Conclusões /Significado

Nós identificamos três novel HLA-A2-restrito PSGR -derived péptidos reconhecidos por células T CD8 +

T, o qual, por sua vez, reconhece HLA-A2

+ e PSGR

+ células tumorais. Os péptidos derivados de PSGR identificados podem ser usados ​​como marcadores de diagnóstico, bem como alvos imunológicos para o desenvolvimento de vacinas anti-cancro

citação:. Matsueda S, Wang H, J Weng, Li Y, Yin B, J Zou, et ai. (2012) Identificação de Prostático Específico acoplados à proteína G Receptor como um antigénio tumoral Reconhecido pela CD8

+ células T para o cancro imunoterapia. PLoS ONE 7 (9): e45756. doi: 10.1371 /journal.pone.0045756

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de maio de 2012; Aceito: 24 de agosto de 2012; Publicação: 20 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Matsueda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi em parte apoiada por doações do Instituto Nacional do Câncer, Instituto Nacional de Saúde e do Instituto de Pesquisa do Câncer e do Instituto de Pesquisa Hospital Metodista. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata tornou-se o tipo de câncer mais comum entre os homens em os EUA e é a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos [1]. O padrão de tratamento para a maioria dos pacientes com câncer de próstata é a cirurgia e /ou radioterapia. No entanto, a recorrência da doença após cirurgia ou radioterapia ainda ocorre em até 30% dos pacientes. Embora a terapia de privação de androgénio é um tratamento eficaz contra a doença recorrente, a maioria destes pacientes, eventualmente, desenvolver cancro da próstata refractário-androgénio, que é insensível ao tratamento tradicional. Assim, são urgentemente necessárias terapias mais eficazes e menos tóxicos. A imunoterapia tem sido mostrado para ser uma abordagem promissora para o tratamento do cancro da próstata, especialmente para pacientes com cancro da próstata metastático resistente à castração [2] – [4]. Aproveitando o sistema imunológico para erradicar as células malignas é uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, mas até recentemente, tem sido reuniu-se com apenas um sucesso clínico esporádico [4] – [6]. Food and Drug Administration (FDA) aprovações recentes dos vacina à base de imunoterapia /droga sipuleucel-T

(

Provenge) e ipilimumab (Yervoy) representam marcos no campo da imunoterapia do cancro [7], [8]. Além disso, um ensaio clínico de fase III do peptídeo gp100 para o melanoma também produziram resultados clínicos altamente encorajadores [9]. No entanto, os benefícios clínicos relatados por estes agentes têm ficado muito aquém das respostas completas e curas permanentes. No caso de sipuleucel-T, o benefício de sobrevivência para os pacientes foi de apenas 4,1 meses, sem regressão objectiva do tumor ou alterações substanciais no antigénio específico da próstata (PSA). Um estudo recente usando mais modelos animais revela a importância de antígenos específicos do tumor em induzir respostas imunes contra um tumor em desenvolvimento [10], estimulando mais esforços para identificar esses antígenos para imunoterapia de câncer. Além disso, uma vez que alguns dos principais antigénios de rejeição podem ser perdidos ou alterados devido à seleção de célula T e matando [11], a melhor estratégia é alvo de vários antígenos tumorais que estão presentes em tumores individuais para imunoterapia.

Até o momento, uma série de antigénios específicos de tumores da próstata têm sido bem definido, incluindo o PSA [12], [13], prostein [14], [15], antigénio das células estaminais da próstata (PSCA) [16], antigénio da membrana específico da próstata (PSMA ) [17] – [19], fosfatase ácida prostática (PAP) [20] e o receptor transiente potencial P8 (Trp-P8) [21]. Além disso, os epitopos de HLA de classe I-restringida derivadas destes antigénios tumorais têm sido descritos [22]. Uma desvantagem de tumor único imunoterapia baseada no antigénio que é imune pode ocorrer fuga. Por isso, é necessária a identificação de antigénios específicos do cancro da próstata adicionais para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes e específicos do antigénio para os pacientes com cancro da próstata metastático. receptor acoplado específico da próstata G-proteína (PSGR) é um membro da proteína G acoplada a família do receptor olfactivo, e é altamente expresso em células de cancro da próstata em comparação com as células da próstata normais [23] – [25], sugerindo que PSGR pode ser alvo para o desenvolvimento de novas estratégias de imunoterapia contra o cancro da próstata.

Numa tentativa para determinar se PSGR pode ser reconhecido pelas células T, descrevemos a identificação de epítopos de células T derivadas do PSGR para o reconhecimento das células T por um imuno -bioinformatics abordagem. Vinte e uma péptidos que foram previstos para se ligarem à molécula de HLA-A2 foram seleccionados e sintetizados. Todos estes péptidos foram avaliados

In vitro

quanto à sua capacidade para estimular células T em PBMC de indivíduos saudáveis ​​e em pacientes da próstata com base no interferão-γ (IFN-γ) de libertação medida por ELISA ou ensaios ELISPOT. Três péptidos foram encontrados para induzir a libertação de IFN-γ em células T periféricas de ambos os indivíduos saudáveis ​​e em doentes com cancro da próstata. Mais importante, estas células T específicas do péptido pode reconhecer a HLA-A2

+, PSGR-expressando células LNCaP em uma forma HLA-classe I-dependente.

Materiais e Métodos

dadores saudáveis e câncer de próstata Os pacientes

Ten HLA-A2

+ pacientes com câncer de próstata e dez HLA-A2

+ indivíduos saudáveis ​​foram incluídos neste estudo após a obtenção do consentimento informado por escrito. Todos os protocolos foram aprovados pelo Institutional Review Board (IRB), do Baylor College of Medicine, antes de iniciar os estudos. 20 ml de sangue periférico foi obtido a partir de cada pessoa, e as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega). As PBMC isoladas de fresco foram criopreservados para uso posterior em 1 ml de meio de congelamento contendo 90% de FCS e sulfóxido de dimetilo a 10% (DMSO) a -140 ° C. A expressão de moléculas de HLA-A2 em CMSPs obtidas a partir de doentes com cancro e indivíduos saudáveis ​​foi verificada por meio de citometria de fluxo com FITC HLA-A2 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA).

Linhas celulares

células T2 (uma molécula HLA-A2

+ deficiente para TAP, linha de células) de células LNCaP, as células PC3 (uma linha celular de cancro da próstata de HLA-A2-negativos), e (a HLA-A2 positiva próstata linha celular de carcinoma) foram todos adquiridos a partir de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 (Mediatech, Manassas, VA, EUA), suplementado com 10% de FBS, 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina e estreptomicina

Peptídeos

Vinte e uma péptidos derivados de PSGR (Tabela 1) foram previstas usando BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), e Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) com base no motivo de ligação a HLA-A2. Apenas os epitopos que foram previstos pelo menos dois destes algoritmos foram seleccionados para testes adicionais. Os péptidos foram sintetizados por um método em fase sólida utilizando um sintetizador de péptidos (AApptec, Inc .; Louisville, KY, EUA), purificou-se por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa e validado por espectrometria de massa. Os péptidos sintetizados foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 10 mg /mL e armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

In vitro

estimulação das células específicas do péptido T em PBMCs

PBMC (1 × 10

5 células /poço) a partir de qualquer indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com cancro da próstata foram incubadas com concentrações de péptidos de 20 ug /mL de péptido por [26] – [28] em de 96 poços de fundo em U microplacas (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) em 200 ul de meio de células T (TCM), que consiste em meio RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, EUA), 10% de soro AB humano (Vale Biomedical, Winchester, EUA), 50 uM de 2-mercaptoetanol, 100 U /mL de interleucina-2 (IL-2), e uma solução de aminoácidos não essenciais MEM 0,1 mM de ácido (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Metade do TCM foi removido e substituído com péptidos contendo TCM fresco (20 ug /ml) a cada 5 dias. Após 14 dias de cultura, as células foram colhidas e testadas quanto à sua capacidade de produzir IFN-γ em resposta a células T2 (1 × 10

4 células /cavidade), que foram pré-carregadas com qualquer um dos péptidos PSGR (5 ug /mL) ou um péptido de controlo (um péptido de ligação HLA-A2 irrelevante: NLLTHVESL) como um controlo negativo. Após 18 horas de incubação, os sobrenadantes foram recolhidos, e a libertação de IFN-γ foi determinada por ensaio de ELISA.

rápida protocolo de expansão (REP) para PSGR Péptido T específicas células

PSGR péptido específico As células T foram expandidas por um protocolo de expansão rápida (REP) como anteriormente descrito [29] com uma ligeira modificação. Resumidamente, no dia 0, 0,1-0,5 × 10

6 células T específicas de péptidos PSGR foram cultivadas num frasco T25 com 20 ml de RPMI-1640 suplementado com 10% de soro AB humano, 50 uM de 2-mercaptoetanol, e 30 ng /mL de anticorpo OKT3 (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ), em conjunto com 20 × 10

6 PBMC alogénicas irradiadas e 5 × 10

6 irradiados de Epstein Barr (EBV) de células-B transformadas como células alimentadoras. Os frascos foram incubados na posição vertical a 37 ° C em 5% de CO

2. IL-2 (300 UI /mL) foi adicionado no dia 1 e no dia 5, metade do sobrenadante da cultura celular foi removido e substituído com meio fresco contendo 300 UI /ml de IL-2. 14 dias após o início do REP, as células foram recolhidas e criopreservadas para experiências futuras

Ensaio ELISA

a libertação de citoquinas foi medida por revestimento de placas de 96 poços de ELISA (Thermo Fisher Scientific;. Rochester, NY , EUA) com 1 ug /mL de IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) durante a noite a 4 ° C. A placa foi lavada seis vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (solução de lavagem) para remover o anticorpo não ligado do revestimento, e bloqueadas com BSA a 1% /PBS em temperatura ambiente por 2 horas. Em seguida, 50 ul de sobrenadante foi adicionada a cada poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida, 50 mL de 0,5 ug /mL biotinilado IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) foi adicionado e as placas foram incubadas durante mais 1 hora adicional à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas e incubadas durante 30 min com poli-HRP-estreptavidina (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EUA) diluídos em PBS 1:5000 /1% de BSA. As placas foram lavadas e 100 ul de solução de substrato TMB (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, EUA) foi adicionado por poço. A reacção colorimétrica foi parada utilizando 2N H

2SO4 e as placas foram lidas a 450 nm utilizando um leitor de placas de ELISA.

ELISPOT IFN-y Ensaio

O ensaio ELISPOT de IFN-y foi realizada como previamente descrito [27] para quantificar os linfócitos T específicas do péptido citotóxicos (CTLs) após

in vitro

expansão. Resumidamente, 96 poços ELISPOT de placas (Millipore; Bedford, MA, EUA) foram revestidos durante a noite a 4 ° C com 7,5 ug /mL de IFN-γ anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). As placas foram lavadas seis vezes com PBS estéril para remover o anticorpo não ligado revestimento. As células T foram semeadas a 1 x 10

5 células por poço e incubou-se com células T2 sozinhas, células T2 pulsadas com um peptídeo PSGR (5 ug /ml) ou um péptido irrelevante como controlo negativo. As células estimuladas com anticorpo /ml 5 ug OKT3 (Ortho Biotech; Bridgewater, NJ, EUA) foram utilizados como controlo positivo. Após a incubação durante 18 – 20 horas a 37 ° C e 5% de CO

2, as placas foram lavadas com solução de lavagem. 0,75 ug /ml de IFN-γ biotinilado anti-humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) foi adicionado, e as placas foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas com solução de lavagem e incubou-se ainda mais com poli-HRP-estreptavidina (Thermo Fisher Scientific; Rochester, NY, EUA) diluídos em PBS 1:1000 /1% de BSA durante 1 hora. As placas foram lavadas e 200 ul de substrato de 4-cloro-1-naftol (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, EUA) foi adicionado a cada poço. Finalmente, as placas foram lavadas sob água corrente da torneira e secou-se à temperatura ambiente. células formadoras de manchas de IFN-y (SFC) foram enumeradas usando um leitor ELISPOT (CTL Technologies, Minneapolis, MN, EUA).

Extração de RNA e RT-PCR

extracção de ARN e RT- a PCR foi realizada como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de células de cancro da próstata com um reagente Trizol mL (Invitrogen; Carlsbad, CA, EUA). Três microgramas de RNA foi transcritos de modo inverso em ADNc em 30 uL de volume e 1 ul de cada ADNc foi utilizado na subsequente reacção de PCR com um par de iniciadores específicos PSGR: Iniciador 1: 5′-GAAGATCTATGAGTTCCTGCAACTTC-3 ‘, iniciador 2: 5’ -CCCAAGCTT TCACTTGCCTCCCACAG-3 ‘. β-actina foi utilizado como controlo de carga: iniciador 1: 5’-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3 ‘; Iniciador 2: 5’-CAGACTATGCTGTCCCTGTACGC-3 ‘. A reacção de PCR foi realizada sob as seguintes condições: 94 ° C durante 2 min, 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min 20 s, no total 35 ciclos, 72 ° C durante 10 min, e β-actina foi corrido durante 25 ciclos. Quantidades iguais dos produtos de PCR foram, em seguida, carregado e detectados por electroforese em gel.

Ensaio de Citotoxicidade

células T específicas do péptido PSGR derivados foram testadas quanto à citotoxicidade contra ambos PC3 e LNCaP por um lactato desidrogenase (LDH ) ensaio (Promega; Madison, WI, EUA). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. liberação de LDH foi calculado com base na seguinte fórmula:

A citotoxicidade (%) = (Experimental – Effector espontânea – Alvo libertação de LDH espontânea) /(Target máxima – libertação espontânea alvo LDH) × 100.

a libertação espontânea foi determinada usando-se o sobrenadante das células alvo sozinhas ou células efectoras sozinhas, e a libertação máxima foi determinada utilizando o sobrenadante de células alvo incubadas com uma solução de lise incluídos no kit de LDH. Para determinar se o reconhecimento pelas células T é HLA-I restrito, anti-HLA-I, anti-HLA-II, ou mAb anti-CD19 (todos a partir de ATCC, Manassas, VA, EUA) foram adicionados a poços no início da cultura .

intracelular IFN-γ de citocinas coloração

As células T de peptídeos específicos derivados de PSGR (0,5-1 × 10

6) foram cultivadas com 0,5 × 10

6 células T2 pulsadas com ou sem péptido (5 ug /ml) na presença de GolgiStop (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) numa placa de 48 poços, durante 4 h a 37 ° C. As células foram coradas com anti-CD8 e anti-IFN-γ e analisados ​​utilizando uma máquina FACScalibur.

Estatísticas

O teste t de Student foi utilizado para analisar as diferenças quantitativas entre os poços experimentais e controles ELISA e ensaios ELISPOT. P 0,05 foi considerado significativo

Resultados

CTLs Peptide-específicas Indução de PSGR Derivado a dadores saudáveis ​​

Para determinar se precursores de células T PSGR-reativa estão presentes em saudável. indivíduos, obteve-se PBMC a partir de 10 HLA-A2

+ dadores saudáveis ​​e estimuladas eles

in vitro

com cada um dos péptidos 21-PSGR derivado contendo o motivo de HLA-A2 de ligação (Tabela 1). Após 2 semanas de estimulação de péptidos, os sobrenadantes de células T estimuladas com péptido foram analisados ​​por ensaio de ELISA para detectar a libertação de IFN-γ em resposta a células T2 pulsadas com ou sem péptidos correspondentes. Como mostrado na Tabela 2, 13 péptidos derivados de PSGR foram capazes de induzir respostas de células T específicas do péptido em pelo menos um dos 10 indivíduos saudáveis. Importante, PSGR3, PSGR4 e PSGR14 poderia induzir respostas de células T em 7 dos 10 indivíduos saudáveis, o que indica que estes 3 peptídeos são imunogênica e potencialmente capaz de se expandir células T antígeno-específicas em indivíduos saudáveis.

presença de peptídeo CTLs específicos derivados de PSGR em pacientes com câncer de próstata

Uma vez que as células específicas do péptido T contra PSGR3, PSGR4 e PSGR14 foram encontrados em mais de 70% dos indivíduos saudáveis, que argumentou que precursores de CTL que reconhecem estes 3 péptidos podem também ser elevados em PBMC de doentes com cancro da próstata. Para testar a hipótese, examinámos se estes três candidatos de péptidos pode induzir CTL específicos do péptido a partir da PBMC de doentes HLA-A2

+ cancro da próstata. PBMC de pacientes com câncer de próstata foram coletadas e estimulado

in vitro

com PSGR3, PSGR4 ou peptídeos PSGR14. Como mostrado na Tabela 3, PSGR3, PSGR4 e PSGR14 de facto induziu CTL específicos do péptido a partir de PBMCs de doentes com cancro da próstata.

Linhas Celulares de cancro da próstata Reconhecimento pelo PSGR derivados de células T específicas de péptidos-

para se obter um grande número de células T específicas do péptido PSGR para posterior análise, as células T expandidas específicas do péptido PSGR identificados nas Tabelas 2 e 3. para determinar uma concentração eficaz de péptido para as células de carga T2 para o reconhecimento das células T , realizamos experimentos de titulação peptídicas. Como mostrado na Figura 1A, para todos os 3 péptidos uma concentração de péptido de 5 mg /ml foi suficiente para saturar os locais de ligação de moléculas de HLA-A2 em células T2 para o reconhecimento pelas células T. Portanto, nós utilizamos de forma consistente esta concentração de péptido para células T2 pré-carregamento em ELISA e /ou ensaios ELISPOT. As células T expandidas mantida antigénio-especificidade e segregada quantidades significativas de IFN-γ após estimulação com células T2 pulsadas com os péptidos correspondentes, mas não com um péptido de controlo (Figuras 1A, B, C, D). ensaio ELISPOT confirmou adicionalmente a presença de células T específicas do péptido na forma expandida PSGR células T (Figuras 1E, F, G)

O reconhecimento de células T2 pré-carregadas com concentrações tituladas de péptidos (0-20 ug /ml) por células T específicas do péptido PSGR expandidas foi testado por ensaio ELISA (A). As células PSGR3 T expandidas (B e E), células PSGR4 T (C e F) e células PSGR14 T (D e G) foram, respectivamente, co-incubou-se com células T2 (1 × 10

4 células /cavidade) sozinho em meio completo (CM), ou com células T2 pré-carregadas com um péptido correspondente (5 ug /ml) ou um péptido de controlo como um controlo negativo. As células foram incubadas durante 18 -24 horas, a secreção de IFN-γ no sobrenadante foi determinada por ensaio ELISA (B, C e D). células formadoras de manchas de IFN-y (SFC) foram enumerados por ensaio ELISPOT (E, F e G). Os dados estão representados como médias ± DP. Os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001 versus controles (células T2 sozinho ou células T2 pulsadas com um péptido de controlo).

para determinar se as células T específicas do péptido derivado da PSGR foram capazes de reconhecer e matar HLA-A2

+, células de cancro da próstata expressam PSGR, utilizou-se um alelo HLA linha de células PC3 negativo A2 e uma linha de células de câncer HLA-A2 positiva LNCaP próstata. A expressão de PSGR nestas duas linhas celulares foi analisada por RT-PCR. Consistente com um relatório anterior [31], PSGR foi altamente expressa em LNCaP, mas não em PC3, DU145 ou uma linha de células de próstata normais PNT1A (Figura 2 A). Tal como mostrado na Figura 2B, PSGR3-, PSGR4-, ou células T específicas para PSGR14 de ambos os dadores saudáveis ​​e pacientes poderiam reconhecer e matar as HLA-A2 positiva, PSGR expressando LNCaP, mas não com HLA-A2 negativa células PC3. Estes resultados sugerem que as células T específicas de PSGR reconhecem epítopos de células T que são endogenamente processados ​​e apresentados por células de tumor da próstata.

A expressão de ARNm PSGR em diferentes linhas celulares foi determinada por RT-PCR (A). PSGR células T específicas do péptido derivados foram testadas quanto à citotoxicidade contra ambos PC3 e LNCaP pelo ensaio de LDH (B). Dados de B estão representados como médias ± DP. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *

P Art 0,05, versus controle

As células T reconhecem peptídeos derivados do PSGR em uma HLA-I restrito Manner

Para testar se as respostas induzidas. por péptidos derivados de PSGR são dependentes de CD8

+ células T, que co-cultivadas células T derivadas do PSGR específicas do péptido com células T2 pulsadas com ou sem péptidos correspondentes na presença de GolgiStop durante 4 h. A coloração para as moléculas de CD8 e intracelular IFN-γ foi subsequentemente executada. Apenas CD8

+ células T foram encontrados para produzir IFN-γ em resposta a células T2 pulsadas com peptídeos (Figura 3A) correspondente, enquanto que CD4

+ células T que não produzem IFN-γ (dados não mostrados).

células T específicas do péptido derivado da PSGR foram co-cultivadas com células T2 pulsadas com ou sem um determinado péptido na presença de GolgiStop em uma placa de 48 poços, durante 4 h a 37 ° C. As células foram coradas com anti-CD8 e anti-IFN-γ, em seguida, analisadas num FACScalibur da máquina (A). células T específicas do péptido derivado da PSGR foram co-incubadas com células LNCaP sozinho em meio, ou com células LNCaP na presença de anticorpos anti-HLA-I mAb (W6 /32), HLA-II mAb ou de um mAb de controlo (anti mAb -CD19). Após 4 horas de incubação, a citotoxicidade contra as células LNCaP foi determinada pelo ensaio de LDH (B). Dados de B estão representados como médias ± DP. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *

P

. 0,05, em comparação com controlos

Para determinar se o reconhecimento de células LNCaP de células T específicas do péptido derivado da PSGR é restrito a HLA-I, que co- células LNCaP cultivados com células T específicas do péptido derivado da PSGR na presença quer de HLA-I anti-Acm (W6 /32) ou mAb de controlo (HLA-II ou mAb mAb anti-CD19). Tal como mostrado na Figura 3B, a citotoxicidade destas células T específicas do péptido foi completamente inibida pela adição de I de HLA anti-mAb, mas não por anticorpos anti-HLA-II (HLA-DR) ou um mAb de controlo (anti-CD19 ), o que sugere que o reconhecimento de células LNCaP de células T específicas do péptido derivado da PSGR é HLA-I restrita.

Discussão

está bem estabelecido que as células CD8 +

T desempenham um papel crítico no controle de desenvolvimento e progressão do tumor. epítopos de péptidos derivados de antigénios associados a tumores (TAAs) podem ser reconhecidos como antigénios pelas células T no contexto de moléculas MHC-I, [33] [32]. Identificação de TAA e seus péptidos que são reconhecidos pelas células T é essencial para o desenvolvimento de vacinas contra o cancro eficazes.

O objectivo do presente estudo foi o de identificar a HLA-A2 derivados de ligação de epitopos reconhecidos por PSGR CD8

+ células T em PBMC de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer de próstata. Três algoritmos de previsão baseados em computadores diferentes, incluindo BIMAS, SYFPEITHI, e Rankpep foram usadas para verificar a sequência da proteína PSGR para HLA-A2 péptidos com base no motivo de ligação a HLA-A2 de ligação. Apenas os péptidos que foram preditos com sucesso por pelo menos 2 de 3 dos diferentes algoritmos de previsão baseados em computador foram incluídos. Vinte e um 9mero ou 10mer peptídeos foram selecionados neste estudo de acordo com este critério. Todos estes péptidos foram testados quanto à sua capacidade para estimular PBMC a partir de qualquer indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com cancro da próstata para a libertação de IFN-γ. Dos 21 péptidos, três péptidos frequentemente induzidas respostas de células T específicas em CMSPs obtidas a partir de qualquer indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com cancro, e estas células T específicas do péptido também reconhecido HLA-A2

+ PSGR-expressando células LNCaP, o que sugere que estes péptidos são naturalmente processados ​​por células de cancro da próstata

PSGR é um gene específico para o tecido da próstata com homologia com a família de genes de receptor olfactivo acoplado à proteína G e que seja especificamente expresso em tecidos da próstata humana [23] -. [25]. A expressão de PSGR é significativamente mais elevada em neoplasia intra-epitelial da próstata e da próstata tumores humanos do que os tecidos normais [25]. Curiosamente, embora PSGR tem sido considerado como um novo alvo para a imunoterapia do cancro da próstata, os epítopos de células T derivadas de PSGR não foram identificados. Isto é, a nosso conhecimento, o primeiro relatório para identificar e caracterizar epítopos derivados de PSGR reconhecidos pela CD8

células + T. A identificação de epitopos derivados de PSGR reconhecidos por células T confirma ainda mais PSGR como um alvo promissor para o desenvolvimento de vacinas contra o cancro.

A maioria das TAAs são auto-antigénios [34], por isso, auto-tolerância pode ocorrer numa tentativa de proteger o indivíduo a partir do desenvolvimento de auto-imunidade. Este é considerado como sendo um obstáculo importante na indução da específica-TAA células T capazes de erradicar tumores

in vivo.

No entanto, no nosso estudo, embora PSGR é expresso no tecido da próstata normal, tolerância imunitária contra PSGR pode ser quebrado, uma vez que as respostas de células T contra epítopos derivados de PSGR eram frequentemente detectável em PBMC a partir de qualquer indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com cancro da próstata.

Um grande número de ensaios clínicos de imunoterapia baseada em vacinas com lisados ​​de tumor, proteínas TAA, TAA e péptidos de ARN ou de ADN que codifica TAA já foram realizados. No entanto, a maioria desses estudos não têm conseguido resultados desejáveis. Uma razão é que a expressão desses TAAs é heterogénea entre os tumores de diferentes doentes e pode variar até entre metástases obtidos a partir de um paciente [35], [36], assim, a fuga imune pode ocorrer quando a abordagem imunoterapêutica se baseia apenas em um TAA. Para evitar fuga imune, as estratégias imunoterapêuticas baseado em vacina que têm como alvo vários antigénios tumorais são essenciais para o desenvolvimento de vacinas contra o cancro com sucesso. imunoterapia assim a identificação de Prostate Specific antigénios tumorais adicionais, tais como PSGR, para células T-baseado é ainda necessária, apesar de que um certo número de antigénios específicos de tumores da próstata, incluindo o PSA [12], [13], de PSCA [16], PSMA [ ,,,0],17] – [19]., PAP [20], Prostein [14], [15] e TRP-P8 [21], foram identificados nos últimos anos

O FDA aprovou recentemente um câncer vacina, Sipuleucel-T, para o tratamento de pacientes com cancro da próstata avançado, com base em um estudo de fase III [8]. Sipuleucel-T é preparado a partir de PBMC autólogos contendo antigénios das células que são incubadas com uma proteína recombinante composto de uma PAP ligadas a granulócitos-macrófagos factor de estimulação de colónia (GM-CSF) que apresentam. Sipuleucel-T, presumivelmente funciona em parte através do aumento específico PAP-CD8

respostas de células T +, demonstrando ainda a importância de tumor específica do antigénio CD8

+ células T induzidas por vacinas contra o cancro. Até agora, Sipuleucel-T é o primeiro agente imunoterapêutico celular aprovada pela FDA para ser utilizado para o tratamento de doentes com cancro. A aprovação pela FDA de Sipuleucel-T como uma vacina contra o cancro terapêutico não só valida a eficácia da imunoterapia do cancro, mas também proporciona um forte impulso no campo da imunologia do cancro [37]. Portanto, a identificação e desenvolvimento de mais romance TAAs incluindo PSGR e peptídeos derivados reconhecido por CTLs é definitivamente essencial para facilitar o desenvolvimento de vacinas contra o câncer eficazes contra o câncer de próstata, bem como outros tipos de cânceres no futuro.

Além disso, os epítopos reconhecidos por células CD8

+ células T podem ser usadas como ferramentas de diagnóstico para monitorizar

+ células T específicas do péptido CD8 nos indivíduos durante o curso de imunização, identificando assim intervalos de tempo óptimos para a imunização, durante o tratamento, incluindo se subsequente imunizações são necessárias em indivíduos quando a imunidade anti-tumor diminui.

em resumo, foram identificados três novos epitopos de CTL derivados de PSGR. Uma vez que a expressão PSGR é fortemente regulados positivamente em cancros da próstata humanos, os péptidos derivados de PSGR podem servir como ferramentas de diagnóstico ou alvos imunoterapêuticos de vacinas anti-cancro isoladas ou em combinação com outros epítopos que são derivados de outros antigénios específicos da próstata.

Agradecimentos

gostaríamos de agradecer Drs. Adebusola Alagbala Ajibade e Audrea M. Burns para a leitura crítica do manuscrito e Hui An para a assistência na figura preparação.