Sumário

inibidores de serina-protease (serpinas) parecem ser ubiquamente expresso numa variedade de espécies e desempenham papéis importantes em processos fisiológicos, tais como pivot angiogénese, as respostas imunes, a coagulação do sangue e fibronolysis. Destes, antigénio de carcinoma de células escamosas 1 (SCCA1), também conhecido como um SERPINB3, foi identificado pela primeira vez em tecido de carcinoma de células escamosas do colo do útero da mulher. No entanto, há pouco sabe sobre a expressão SERPINB3 em câncer epitelial de ovário humano (EOC). Portanto, no presente estudo, investigamos o papel funcional da

gene SERPINB3

em EOC humano utilizando galinhas, o modelo animal mais relevante. Em 136 frangos, EOC foi encontrada em 10 (7,4%).

SERPINB3

ARNm foi induzida em cancerosa, mas não ovários normais de galinhas (p 0,01), e foi abundantes apenas no epitélio glandular dos ovários das galinhas cancerosas. Além disso, vários microRNAs, especificamente

miR-101, miR-1668 Comprar e

miR-1681 foram descobertos para influenciar

expressão SERPINB3

através do seu 3′-UTR que sugere que influências de regulação pós-transcricional

expressão SERPINB3

em frangos. SERPINB3 proteína foi localizada predominantemente no epitélio glandular no cancerosas ovários das galinhas, e que era abundante no núcleo de ambos galinha e linhas celulares de cancro do ovário humano. Em 109 pacientes humanos com EOC, 15 (13,8%), 66 (60,6%) e 28 (25,7%) pacientes mostraram expressão fraca, moderada e forte de proteína SERPINB3, respectivamente. forte expressão de proteína SERPINB3 foi um fator prognóstico para a resistência de platina (OR ajustado; odds ratio, 5,94; 95% dos limites de confiança, 1.21-29.15), e para a sobrevivência pobre livre de progressão (PFS; hazard ratio, 2,07;; HR ajustado 95 CI%; intervalo de confiança, 1,03-4,41). Portanto, SERPINB3 pode desempenhar um papel importante na carcinogênese ovariana e ser um novo biomarcador para prever resistência de platina e um mau prognóstico para a sobrevivência em pacientes com EOC

Citation:. Lim W, Kim HS, Jeong W, Ahn SE , Kim J., Kim YB, et ai. (2012) SERPINB3 no Modelo de frango de câncer de ovário: Um fator prognóstico para resistência de platina e sobrevida em pacientes com epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 7 (11): e49869. doi: 10.1371 /journal.pone.0049869

editor: Wendong Huang, Instituto de Pesquisas Beckman da City of Hope, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de abril de 2012; Aceito: 15 de outubro de 2012; Publicação: 21 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pelo programa Universidade World Class (WCU) (R31-10056) e pelo programa Básico de pesquisa da ciência (2010-0013078), através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia, e também por uma subvenção do Next-Generation BioGreen 21 Programa (No. PJ008142), Administração de Desenvolvimento Rural, República da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial (EOC) é o 7

th principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres em todo o mundo [1], [2]. A importância clínica tem crescido a uma maior extensão, porque não existem sintomas relevantes e não há métodos de rastreio eficazes para a detecção precoce [3], o que leva a Federação Internacional de ginecologista (FIGO) estádios da doença III-IV no momento do diagnóstico, em mais de 75 % de pacientes com EOC [4]. Embora a doença em estágio inicial, bem diferenciação, sensibilidade de platina e cirurgia cytoreductive ideal têm sido sugeridos como fatores prognósticos favoráveis, mas o seu valor no prognóstico não foi melhorada significativamente [5]. Portanto, a detecção precoce do EOC e previsão de prognóstico para a sobrevida do paciente utilizando biomarcadores específicos é cada vez mais reconhecido como uma melhor abordagem para superar essas limitações. Para este efeito, modelos de roedores geneticamente manipuladas têm sido desenvolvidos para a elucidação da etiologia e patogénese da AOE. No entanto, a natureza artificial dos tumores induzidos em ratos limita a sua relevância clínica [6], [7], [8]. Enquanto isso, a galinha poedeira é bem conhecido como o único animal que desenvolve espontaneamente tumores a partir de epitélio da superfície do ovário, e a galinha poedeira é um modelo único e adequado para desenvolver novos biomarcadores e medicamentos anti-cancro para os doentes com EOC [6], [7 ], [9].

inibidor serpin peptidase, clade B, membro 3

(

SERPINB3

) é um membro da superfamília serpina de inibidores de protease envolvidos na apoptose, resposta imune, a coagulação do sangue, a migração celular e invasão de células [10], [11]. É também conhecido como antígeno de células escamosas carcinoma 1 (SCCA1) descoberto pela primeira vez em carcinoma de células escamosas do colo do útero [12]. Em humanos, o gene para a

SERPINB3

está localizado em 18q21.3 cromossoma, e que inibe as proteases de cisteína lisossómica papaína semelhante, catepsina K (CTSK), CTSL CTSS e [10], [13]. Anteriormente, foram identificados

SERPINB3

em frangos e determinou que ele tem homologia moderada à sua orthologue proteínas de mamíferos (aproximadamente 36-47%). SERPINB3 aviária é expresso no oviduto em resposta ao estrogénio de uma forma para tecidos e específica de células [14]. No entanto, pouco se sabe sobre a expressão e valor prognóstico da

SERPINB3

tanto em galinhas ou seres humanos com EOC.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos e RNAs de 18-23 nucleotídeos não-codificante em comprimento. Aqueles regular a expressão do gene de pós-transcricionalmente e também são capazes de alterar o destino da célula, controlando a tradução de mRNAs alvo em diversos tecidos e tipos de células. Portanto, miARNs desempenham um papel crucial em um de vários processos biológicos incluindo o crescimento dos vertebrados, o desenvolvimento, diferenciação e oncogénese por regulação da expressão de genes [15], [16], [17]. No entanto, não existem resultados de investigação publicados miARN relacionada com SERPINB3 em galinhas. A fim de determinar o papel de SERPINB3 como um biomarcador novo para EOC, comparou-se a distribuição e localização de SERPINB3 entre ovários normais e cancerosos de galinhas poedeiras e, em seguida, foi realizado um ensaio de validação miARN alvo para investigar regulação pós-transcricional da

SERPINB3

expressão. Depois disso, em comparação expressão SERPINB3 entre células normais e cancerosas de ovários das galinhas poedeiras, as linhas celulares humanas do EOC (OVCAR-3 e SKOV-3) e uma linha celular de teratocarcinoma humano do ovário (PA-1). Finalmente, nós investigamos os valores diagnóstico e prognóstico da expressão SERPINB3 em pacientes com EOC.

Resultados

expressão e localização de mRNA SERPINB3 e proteína na normais e cancerosos Os ovários das galinhas poedeiras

As comparações de expressão de

SERPINB3

ARNm entre ovários normais e cancerosos de galinhas poedeiras por RT-PCR revelou que era expresso em apenas ovários cancerosos (Fig. 1A e 1B). Além disso, RT-PCR quantitativa mostrou que

SERPINB3

ARNm foi induzida apenas na ovários cancerosas (

P

0,01; Fig. 1C). Estes resultados sugerem que

SERPINB3

é um biomarcador para o câncer de ovário derivado do epitélio em galinhas poedeiras.

análise de RT-PCR foi realizada utilizando modelos de cDNA do frango

SERPINB3

e

GAPDH

iniciadores espec�icos. [A] As faixas 1 a 4 mostram quatro diferentes ovários normais e N é o controle negativo. [B] as pistas 1-10 mostram 10 diferentes ovários cancerosas. análise [C] RT-PCR quantitativa foi realizada por meio de modelos de cDNA a partir de ovários normais e cancerosas de galinhas poedeiras (média ± SEM; P 0,01).

In situ

análise de hibridação demonstraram que

SERPINB3

ARNm era abundante no epitélio glandular do cancerosas ovários das galinhas poedeiras (Fig. 2a), mas não era detectável no estroma, vasos sanguíneos ou células imunitárias de ovários cancerosas. Consistente com estes resultados, a proteína foi detectada SERPINB3 predominantemente no citoplasma do epitélio glandular no cancerosa, mas não ovários normais de galinhas poedeiras (Fig. 2B). Estes resultados indicam que SERPINB3 é especificamente expressa apenas no epitélio glandular dos ovários cancerosas de galinhas poedeiras.

[A]

In situ

hibridação análises de

SERPINB3

mRNA. Cortes transversais de ovários normais e cancerosas de galinhas poedeiras foram hibridizados com sentido ou frango anti-sense

SERPINB3

sondas de cRNA. [B] Expressão imuno-histoquímica de proteína SERPINB3: Para o controle negativo, o anticorpo primário foi substituído com IgG de rato não imune purificado. F, folículo; GE, epitélio glandular; S, estroma;

Barra de escala

representa 200 um (os primeiros painéis de colunas e sentido) ou 50 mm (o segundo painéis de colunas).

regulação pós-transcricional de microRNAs que afetam SERPINB3

Para investigar a possibilidade de que

SERPINB3

expressão é regulada ao nível pós-transcricional por miRNAs, foi realizado um ensaio de validação de alvos miRNA. Análise de potenciais locais de ligação de miRNA dentro do 3′-UTR para

SERPINB3

usando um banco de dados de previsão alvo miRNA (miRDB; https://mirdb.org/miRDB/) revelou três sítio de ligação putativo para

miR -101, miR-1668 Comprar e

miR-1681

(Figura 3A). Portanto, determinamos se estes três miRNAs influenciado

SERPINB3

expressão através da sua 3′-UTR. Um fragmento de

SERPINB3

3′-UTR abrigando sítios de ligação para os miARNs foi clonado a jusante do quadro de leitura verde proteína fluorescente (GFP), criando, assim, um repórter fluorescente em função da região 3′-UTR. Além disso, SERPINB3 3′-UTR mutantes incluindo mutado locais para ligação

miR-101

,

miR-1668 Comprar e

miR-1681 também foram gerados por mutação de ponto no para confirmar a modulação da expressão de eGFP por cada miARN (Figura 3B). Após a co-transfecção de eGFP-

SERPINB3

3′-UTR e DsRed-miARN, a intensidade da expressão da GFP e a percentagem de células que expressam GFP foram analisadas por microscopia de fluorescência e de FACS (Figura 3C e 3D). Na presença de

miR-101,

miR-1668 e

miR-1681, a intensidade e a percentagem de células que expressam GFP (44,8% no controlo vs. 27,5% no

miR-101

, 24,2% no

miR-1668

, 14,8% no

miR-1681

) diminuiu (p 0,01). No entanto, quando houve co-transfecção de eGFP-

SERPINB3

mutantes 3′-UTR, a intensidade ea porcentagem de células que expressam GFP não foram alteradas (14,8% no controle vs. 16,1% no

miR -101

, 13,5% em

miR-1668

, 14,3% no

miR-1681) como um controlo (Figura 3D). Estes resultados indicam que estas três miRNAs ligar diretamente para o

SERPINB3

transcrição e regular

SERPINB3

expressão-transcricionalmente pós gene.

[A] Diagrama de

miR- 101, miR-1668 sítios de ligação em

SERPINB3

3′-UTR

e

miR-1681

. [B] mapas Expressão vetor para eGFP com

SERPINB3

3′-UTR e mutado

SERPINB3

3′-UTR e Ds-vermelho com cada miRNA. A de tipo selvagem (WT) e mutantes de 3′-UTR do

SERPINB3

transcrição foram subclonados entre o gene EGFP e a cauda poliA para gerar a construção de fusão de GFP a transcrição na sequência da miARN alvo 3′- UTR (pcDNA-eGFP-3’UTR) (superior e o painel do meio) e a expressão de miARN vector foi concebido para co-expresso DsRed e cada miARN (pcDNA-DsRed-miARN) (painel inferior). [C] Após co-transfecção de pcDNA-eGFP-3’UTR para o

SERPINB3

transcrição e pcDNA-DsRed-miRNA para o

miR-101, miR-1668 Comprar e

miR-1681

, os sinais de fluorescência de GFP e DsRed foram detectados através de microscopia de fluorescência. [D] A taxa de inibição da expressão de eGFP de modulação foi calculada pela miARN de células activadas por fluorescência (FACS). barras sólidas representam WT de

SERPINB3

3′-UTR e bares vazios mostrar o mutante de

SERPINB3

3′-UTR para cada miRNA. As barras de erro indicam o erro padrão das análises em triplicado. Os asteriscos denotam diferenças estatisticamente significativas entre WT vs. mutantes (*** P 0,001).

Detecção de Imunofluorescência da proteína SERPINB3 na galinha e do cancro do ovário humano Células

Para comparar a padrões de proteína SERPINB3 entre frango e células de cancro do ovário humanos de expressão, foi realizada análise de imunofluorescência. SERPINB3 proteína foi raramente detectada em células normais, mas abundante no núcleo de células do cancro do ovário de galinhas poedeiras (Fig. 4a). Analogamente, a proteína SERPINB3 era abundante no núcleo de três linhas de células de cancro do ovário humano, OVCAR-3, SKOV-3 e DP-1 de células (Fig. 4B).

[A] SERPINB3 proteína foi detectada em raramente células normais, mas abundante nos núcleos de células de cancro do ovário de frango. [B] SERPINB3 proteína foi expressa em núcleos de células SKOV-3, PA-1 e células OVCAR-3 humana. os núcleos das células foram coradas com DAPI (azul). Todas as imagens foram capturadas em 40X ampliação da objetiva.

Expression SERPINB3 proteína está associada à resistência de platina e sobrevida em pacientes com epitelial de ovário cancro

Um total de 109 pacientes com uma idade média de 52 anos (variação, 23-82 anos) foram incluídos no estudo atual. Entre todos os pacientes, 38 (34,9%) estavam no estágio FIGO I, 20 (18,3%) no estágio II, e 51 (46,8%) no estágio III. o grau do tumor foi G1 em 21 (19,3%), G2 em 41 (37,6%) e G3 em 47 pacientes (43,1%). Histologicamente, 62 tumores (57%) foram diagnosticados com carcinoma seroso, 17 (15,6%) com carcinoma mucinoso, 12 (11%) com carcinoma de células claras, 9 (8,3%) com carcinoma endometrioid, 4 (3,6%) com carcinoma indiferenciado , e 3 (2,7%) com endometrióide e carcinoma de células claras, e 2 (1,8%) com carcinoma seroso e clara. cytoreductive cirurgia Optimal foi realizada em 65 pacientes (59,6%), enquanto que 44 (40,4%) foram submetidos à cirurgia cytoreductive abaixo do ideal. Noventa pacientes (82,6%) receberam quimioterapia adjuvante após a cirurgia, e 84 (93,3%) receberam paclitaxel /carboplatina enquanto que o paclitaxel /cisplatina foi administrada a 6 (6,7%) dos pacientes. Os resultados da análise imunohistoquímica revelou que a proteína SERPINB3 foi detectada predominantemente no epitélio glandular como para o modelo de galinha poedeira, e 15 (13,8%), 66 (60,6%) e 28 (25,7%) pacientes apresentavam expressão fraca, moderada e forte de proteína SERPINB3 no epitélio glandular do ovário, respectivamente (Fig. 5).

(a e a ‘) fraco, (b e b’) moderada e forte expressão da proteína SERPINB3 (C e C ‘) foi detectada em mulheres com câncer epitelial de ovário. Não havia qualquer expressão de expressão muito fraca de SERPINB3 em ovários normais, enquanto protine SERPINB3 foi facilmente detectável nos ovários cancerosas de mulheres. O controlo negativo foi usada IgG de ratinho em vez do anticorpo primário.

Barra de escala

representa 200 mm (os primeiros painéis horizontais e IgG) ou 50 mm (o segundo painéis horizontais).

O tempo médio de acompanhamento foi de 69,2 meses (intervalo , 2-88 meses) e 70 pacientes (77,8%) mostraram sensibilidade de platina, enquanto 20 (22,2%) demonstraram resistência de platina. forte expressão de proteína SERPINB3 foi mais frequente em pacientes com resistência de platina (n = 11, 55%) do que naqueles com sensibilidade de platina (n = 17, 24,3%) (

P

= 0,01). forte expressão de proteína SERPINB3 também foi um fator prognóstico independente para a resistência de platina após ajustes usando fatores clínico-patológico (OR ajustado; odds ratio, 5,94; IC 95%, 1,21-29,15) (Tabela 1). forte expressão de SERPINB3 foi associado com PFS mais curtas do que expressão fraca ou moderada (média PFS foram 25,7 vs 47,8 meses;

P

= 0,03), apesar de não haver diferença no OS (média OS; sobrevida global, 49,5 vs . 60,9 meses;

P Art 0,05). Além disso, SERPINB3 foi um fator prognóstico pobre para PFS (sobrevivência livre de progressão) usando análise multivariada de riscos proporcionais de Cox (HR ajustado; hazard ratio, 2,07; 95% CI; intervalo de confiança, 1,03-4,41; Tabela 2), enquanto que não houve valor prognóstico fator para OS exceto citorredução sub-ótima (HR ajustado, 6,83; IC 95%, 2,34-20,02).

Discussão

A galinha poedeira é um bem conhecido modelo para investigação de carcinogênese ovariana e para o desenvolvimento de agentes anti-câncer para as mulheres por causa da semelhança em carcinomas surgindo espontaneamente a partir de células de ovário epiteliais [18]. Histologia, metástase e estágios de EOC em galinhas poedeiras são semelhantes aos dos seres humanos que indica a viabilidade do uso do modelo de galinha poedeira para investigar carcinogênese ovariana [6]. Além disso, vários biomarcadores, incluindo CA-125, são comumente expressa e utilizada para a detecção de doença em estágio inicial e monitoramento da resposta terapêutica em mulheres com EOC e eles são reactivo com biomarcadores para EOC em galinhas poedeiras [18], [19].

de um modo geral, um número de arquitecturas glandulares complexos são normalmente encontrados em vários carcinomas que surgem em vários órgãos, tais como o estômago, brônquios, gladder, próstata, testículo e ovário, devido à natureza ubíqua das glândulas. Especialmente, nos ovários de espécies tanto de aves e mamíferos, estas estruturas glandulares são principalmente em tumores do tipo endometrioid com várias características, tais como atipia nuclear, focos cribriform e atresia de folículos estromais. Além disso, as glândulas de adenocarcinomas em mulheres constituído por uma única camada de células epiteliais em mitose e margens afiadas luminais [6]. Os nossos resultados preliminares também mostraram que a arquitectura glandular em carcinomas epiteliais ovárica primária das galinhas poedeiras é composto por um labirinto de glândulas ou papilar semelhante a renda dobráveis ​​com núcleos grandes contendo plieomorphic figuras mitóticas como relatado anteriormente [6]. O atual estudo para encontrar um novo biomarcador de prognóstico para pacientes com EOC utilizando o modelo de galinha poedeira identificados alta expressão de

gene SERPINB3

no epitélio glandular dos ovários cancerosas comparada com a de ovários normais de galinhas. Os resultados sugerem que SERPINB3 pode estar associada com a carcinogénese do ovário, através da activação dos factores de transcrição ou a inibição da apoptose. Nossos resultados também revelaram que

SERPINB3

expressão do gene é pós-transcricionalmente regulada por vários miRNAs críticos para o desenvolvimento da carcinogênese ovariana frango. Além disso, a forte expressão da proteína SERPINB3 foi relacionada com a resistência de platina e sobrevida livre de progressão mais curto em pacientes com EOC. Estes resultados suportam a hipótese de que SERPINB3 desempenha um papel no desenvolvimento tumoral e proliferação de células epiteliais do ovário.

Embora o papel funcional de

SERPINB3

gene em biologia EOC não é conhecida, os resultados da presente estudo indicam claramente que

SERPINB3

está associada a morfogênese glandular afetando carcinogênese ovariana em ambas as galinhas e mulheres com EOC. Em ambas as mulheres e galinhas, SERPINB3 é expresso no epitélio glandular, mas há pouca ou nenhuma expressão SERPINB3 em outros tecidos e células do estroma, incluindo vasos sanguíneos e do ovário. Estes resultados indicam que a proteína SERPINB3 podem ativar fatores de transcrição ou inibir a apoptose levando ao desenvolvimento de EOC em galinhas poedeiras e mulheres. Em estudos anteriores, SERPINB3 foi encontrado para regular a morte celular programada por diferentes mecanismos em vários tipos de cancro e a sua sobre-expressão era característico de células cancerígenas de origem epitelial. Além disso, atenua SERPINB3 apoptose mediada por fármacos anti-cancro para células NK e por inibição da libertação de citocromo c das mitocôndrias [20], [21], [22] Por outro lado, a morfogénese glandular associados com

SERPINB3

pode contribuir transição epitelial-mesenquimal, que podem desregular o processo de aderência para permitir a metástase e aumentar o potencial de capacidade de invasão de células tumorais em mulheres [23].

expressão forte de SERPINB3 foi também associado com resistência de platina e PFS mais curtos em pacientes com EOC. O mecanismo responsável pelo desenvolvimento de quimioresistência e um potencial papel para SERPINB3 não foi estabelecida em EOC. No entanto, a permeabilização disfuncional de lisossomas contribui para o desenvolvimento de quimiorresistência em células de cancro do ovário [24], e SERPINB3 confere resistência à apoptose induzida por drogas por inibição de proteases catepsina lisossomal em células cancerosas [25]. Assim, SERPINB3 pode contribuir para a resistência de platina seguinte desestabilização lisossomal induzida por quimioterapia. Embora forte expressão de SERPINB3 foi associada com o PFS mais curtas, é possível que a resistência de platina associada com SERPINB3 leva a PFS mais curtos. Este facto é apoiado por um estudo anterior em que a expressão SERPINB3 foi encontrado para ser associado com a sobrevivência pobre em pacientes com câncer de mama [26].

SERPINB3 ou SCCA1 tem sido investigada em vários tipos de carcinoma de células escamosas [27 ], [28], [29], [30], mas ele só tem sido sugerida como um fator prognóstico para câncer de mama e adenocarcinoma do pulmão [26], [31]. Para o nosso conhecimento, os resultados do estudo são significativos em ser o primeiro a estabelecer a probabilidade de um papel funcional para SERPINB3 em EOC das galinhas poedeiras. Estes resultados validam a galinha poedeira como um modelo para a pesquisa sobre EOC humano. Além disso, os resultados sugerem fortemente que SERPINB3 tem funções importantes no desenvolvimento da EOC em galinhas poedeiras e que é um biomarcador da novela para predizer resistência à platina e PFS pobres em pacientes com EOC. A nossa hipótese de que SERPINB3 tem um papel específico no desenvolvimento de EOC humano requer uma avaliação mais aprofundada em estudos clinicamente potenciais.

Materiais e Métodos

Animais Experimentais e Animal Care e Use

A utilização experimental de frangos no presente estudo foi aprovado pelo Instituto de Recursos Animais de laboratório, Universidade Nacional de Seul. White Leghorn (WL) galinhas poedeiras foram geridos de acordo com as normas aprovadas para a operação do Animal Farm University, Universidade Nacional de Seul, Coreia. Todas as galinhas tinham livre acesso

ad libitum

para alimentar e água.

Amostras de tecido em frango modelo

Um total de 136 galinhas poedeiras (88 em 36 meses e 48 mais de 24 meses de idade), que tinha parado de botar ovos, foram sacrificados para biópsia e coleta de (n = 10) ovários cancerosas. Como um controlo, normal (n = 5) ovários foram coletados de galinhas poedeiras de idade similar. Examinamos estágios tumorais em 10 galinhas com ovários cancerosas com base em características do câncer de ovário da galinha [6]. Três galinhas tinha Stage III EOC como células do tumor dos ovários tinham metástase para a superfície do trato gastrointestinal e fígado com ascite profusa na cavidade abdominal. Em cinco galinhas, os seus tumores tinham metástases para órgãos distantes como o parênquima do fígado, do pulmão, do tracto gastrointestinal e oviduto com ascite profusa que é indicativo da Fase IV EOC. As outras duas galinhas não têm tumores em quaisquer outros órgãos; portanto, seus tumores ovarianos foram classificados como estágio I EOC. Subconjuntos destas amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% para mais análises. Depois de 24 h, os tecidos fixados foram alteradas para 70% de etanol durante 24 h e depois desidratado e embebido em Paraplast Plus (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). Galinhas com EOC foram classificadas com base nos seus subtipos e padrões de diferenciação celular celulares com referência aos tipos de tumores malignos humanos do ovário [6].

Isolamento de ARN

O ARN celular total foi isolado a partir de tecidos congelados usando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. A quantidade e qualidade do RNA total foi determinada por espectrometria e eletroforese desnaturante em gel de agarose, respectivamente.

análise semi-quantitativa RT-PCR

A expressão de

SERPINB3

mRNA em ovários normais e cancerosos de galinhas foi avaliada usando semi-quantitativo de RT-PCR como descrito previamente [32]. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de ARN celular total (2 ug), utilizando hexâmero aleatório (Invitrogen, Carlsbad, CA) e iniciadores oligo (dT) e AccuPower® RT pré-mistura (Bioneer, Daejeon, Coreia do Sul). O ADNc foi diluída (1:10) em água estéril antes da sua utilização em PCR. Após a PCR, a mesma quantidade de produto de reacção foram analisados ​​utilizando um gel de agarose a 1%, e os produtos de PCR foram visualizados utilizando coloração com brometo de etídio.

RT-PCR quantitativo Análise

os níveis de expressão do gene foram medidos usando SYBR® Green (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e um StepOnePlus ™ real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). [33] O

gene GAPDH

foi simultaneamente analisados como um controle e usado para a normalização para a conta de variação de carga. Cada gene alvo e

GAPDH

foi analisada em triplicado. corante ROX (Invitrogen) foi utilizado como um controlo negativo para as medições de fluorescência. Sequência de produtos específicos foram identificadas através da geração de uma curva de fusão em que o C

valor T representa o número do ciclo no qual um sinal fluorescente foi estatisticamente maior do que o fundo, e a expressão do gene relativa foi quantificada utilizando o método 2

-ΔΔCT [34]. Para o controlo, a quantificação relativa da expressão do gene foi normalizado para o C

T do ovário controlo.

Hibridização In Situ Análise

Para sondas de hibridação, os produtos de PCR foram gerados e eram extraiu-gel e depois clonado no vector pGEM-T (Promega) como descrito anteriormente [35]. Após a verificação das sequências, os plasmídeos que contêm as sequências de genes correctos foram amplificados com iniciadores T7 e SP6-específica, em seguida, digoxigenina (DIG) sondas de ARN foram transcritas marcado com usando um kit de marcação DIG RNA (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Após a hibridação e bloqueamento, as secções foram incubadas durante a noite com ovelhas anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (Roche). O sinal foi visualizada por exposição a uma solução contendo 0,4 mM de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, nitroazul de tetrazólio 0,4 mM, e levamisole 2 mM (Sigma).

MicroRNA Alvo Ensaio de Validação

A 3′-UTR de

SERPINB3

foi clonado e confirmado por sequenciação. A 3′-UTR foi subclonado entre o gene EGFP e a hormona de crescimento bovina (bGH) cauda poli-A em pcDNA3eGFP (Clontech, Mountain View, CA) para gerar o alvo eGFP-miARN 3′-UTR (pcDNA-eGFP-3 ‘-UTR) construções de fusão. Além disso, os mutantes de SERPINB3 3’-UTR para cada miARN foram gerados por mutação pontual e, em seguida, clonado o mesmo tipo de plasmídeos. Para o ensaio de repórter de fluorescência dupla, as construções de fusão contendo o gene DsRed e ou

miR-101

,

miR-1668 Comprar e

miR-1681 foram projetados para ser co -expressed sob o controlo do promotor de CMV (pcDNA-DsRed-miARN). O pcDNA-eGFP-3′-UTR e pcDNA-DsRed-miARN (4 ug) foram co-transfectados em células 293FT utilizando o método do fosfato de cálcio. Quando o DsRed-miARN é expressa e liga-se ao local alvo da 3′-UTR a jusante do transcrito de GFP, a intensidade da fluorescência verde diminui devido à degradação do transcrito de GFP. Às 48 h pós-transfecção, dupla fluorescência foi detectada por microscopia de fluorescência e calculada por citometria de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). Por citometria de fluxo, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e analisados ​​utilizando o software FlowJo (ár Inc., Ashland, OR).

cultura celular

Um total de cinco linhagens de células, incluindo três cancro epitelial do ovário humano e células de ovário de frango dois primários, foram utilizados neste estudo. linhas celulares de cancro do ovário humano (OVCAR-3, SKOV-3, e PA-1) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor. Duas células epiteliais da superfície do ovário galinha diferentes (células normais e cancerosas) foram isoladas e cultivadas como anteriormente descrito, com algumas modificações [36], [37].

Microscopia de imunofluorescência para a detecção de SERPINB3 Activação

células do cancro do ovário e células de ovário normal, proveniente de galinhas poedeiras, e três linhas celulares de cancro do ovário humano, OVCAR-3, SKOV-3, e PA-1, foram examinados para padrões de expressão SERPINB3 por microscopia de imunofluorescência como descrito anteriormente. Cada tipo de célula foi semeadas em lâminas de câmara Lab-Tek (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Após 24 h, as células foram fixadas com metanol -20 ° C e coloração por imunofluorescência foi realizada utilizando um anticorpo monoclonal anti-SERPINB3 humana (número de catálogo: ab55733; Abcam plc, Cambridge, Reino Unido). As células foram então incubadas com Alexa Fluor 488 anticorpo secundário de coelho anti-IgG de cabra (A21222, Invitrogen). As lâminas foram cobertas com DAPI antes imagens foram captadas com uma Zeiss confocal LSM710 microscópio (Carl Zeiss) equipado com um AxioCam câmera microscópio digital e software Zen 2009.

Estudo da População Humana

Os dados clínicos foram recuperados a partir de um banco de dados de pacientes com EOC entre Junho de 2003 e Março de 2009. Aprovação pelo Institutional Review Board of Seoul Bundang Hospital da Universidade Nacional foi obtido com antecedência para o estudo atual. Os critérios de elegibilidade foram os seguintes para os pacientes: que eles foram diagnosticados com EOC; que foram tratados com cirurgia cytoreductive máxima seguido de adjuvante taxane- e quimioterapia à base de platina, se indicado; eles tinham status de desempenho Eastern Cooperative Oncology Group de 0-2; e eles não tinham doença subjacente que afeta a sobrevivência. _ENREF_4Optimal Cirurgia citorredutora foi definida como um tumor residual ≤1 cm, enquanto a cirurgia citorredutora subóptima foi definida como um tumor residual 1 cm de diâmetro máximo. Todos os pacientes, exceto aqueles com doença em estágio inicial de baixo risco, como FIGO estádio IA ou IB com grau 1 ou 2 doença receberam quimioterapia adjuvante com paclitaxel (175 mg /m

2) /carboplatina (AUC 5,0) ou paclitaxel (175 mg /m

2) /cisplatina (75 mg /m

2) por 1-2 semanas após a cirurgia e quimioterapia foi repetido a cada 3 semanas durante 6 ciclos. sobrevida livre de progressão (PFS) foi definida como o tempo decorrido desde a data da conclusão da quimioterapia adjuvante primário para a data de agravamento clinicamente comprovada. A sobrevida global (OS) foi calculado a partir da data de laparotomia para a data de morte relacionada ao câncer ou o fim do estudo. resistência de platina foi definida como a resposta à quimioterapia à base de platina, com um intervalo mínimo isento de tratamento de menos do que 6 meses, enquanto a sensibilidade de platina foi definida como a resposta à quimioterapia à base de platina, com um intervalo mínimo sem tratamento, maior do que ou igual a