Abstract

O principal objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito potencial de extracto de acetona de

Ficus religosa

folha (FAE) em múltiplos de sinalização de apoptose em células de câncer de mama humano. tratamento FAE induzida significativamente a dose e dependente do tempo, a inibição irreversível do crescimento das células do cancro da mama com a toxicidade moderada a células epiteliais normais da mama. Esta observação foi validado utilizando o ensaio de Sulforodamina B. análise do ciclo celular por citometria de fluxo mostrou parada do ciclo celular na fase G1 e indução de pico sub-G0. FAE induzida condensação da cromatina e exibido um aumento na população apoptótica em anexina V-FITC /PI (fluoresceína isotiocianato de iodeto /propídio) coloração dupla. FAE estimulou a perda de potencial de membrana mitocondrial em várias linhas celulares de cancro da mama, quando comparado com as células diplóides normais. Para compreender o papel da Bax na apoptose induzida FAE, empregamos uma plataforma de células sensíveis base de células MCF-7 expressando Bax-EGFP. Bax translocação para a mitocôndria foi acompanhada pela perturbação do potencial de membrana mitocondrial e marcada elevação da actividade LEHDase (Caspase 9). Consistente com estes dados, a activação induzida FAE Caspase como evidenciado pela alteração do índice de sensor de FRET linha celular que expressa caspase MCF-7 e a clivagem de caspases PARP e proeminentes. Curiosamente, FAE acelerada de morte celular de um modo dependente mitocondrial no modo de imagem de células vivas contínua, indicando a sua possível efeito fotossensibilizador. geração intracelular de espécies de oxigénio reactivas (ROS) por FAE desempenhou um papel crítico na mediação de morte celular por apoptose e actividade de fotossensibilização. FAE de dose induzida e dependente do tempo da inibição do crescimento das células do cancro que foi associado com a translocação da Bax e mitocôndrias apoptose mediada com a activação da caspase 9 dependente da cascata de caspase. FAE também possuía efeito fotossensibilizador forte na linha de células de câncer que foi mediada através rápida transmembrana mitocondrial perda potencial e ativação Caspase parcial geração envolvendo de ROS intracelular

Citation:. Haneef J, MP, Thankayyan R SK, Sithul H, Sreeharshan S (2012) Bax translocação Mediated mitocondrial apoptose e Caspase Dependente fotossensibilizante Efeito da

Ficus religiosa

sobre as células cancerosas. PLoS ONE 7 (7): e40055. doi: 10.1371 /journal.pone.0040055

editor: Venugopalan Cheriyath, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de novembro de 2011; Aceito: 4 de junho de 2012; Publicação: 06 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Haneef et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Universidade Grants Comissão (UGC) e do Conselho de Pesquisa Científica e industrial (CSIR), Governo da Índia, como bolsas de pesquisa sênior Dr. Haneef e Dr. Parvathy M respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

plantas de ervas e medicamentos derivados de plantas têm sido amplamente utilizados em culturas tradicionais em todo o mundo e ganharam popularidade na sociedade moderna como alternativas naturais para produzir novos compostos terapêuticos potenciais para o combate às doenças [1]. A promoção da saúde efeitos de constituintes de plantas e extractos estão a ser cada vez mais estudado e o seu consumo é em ascensão [2]. Muitas ervas foram avaliadas em estudos clínicos e estão actualmente a ser investigados fitoquímico para entender suas ações tumoricidas contra vários cancros. Infelizmente, a maioria dos estudos foram realizados em moléculas individuais que foram encontrados a ser menos eficazes como agentes quimiopreventivos em comparação com cocktails fitoquímicos que podem induzir a sua actividade por sinergismo [3].

Os estudos farmacológicos efectuados com o fresco materiais de planta de

F.religiosa

fornecer um apoio pragmático por seus inúmeros usos tradicionais. A sua casca, frutos, folhas, raízes adventícias, látex e sementes são medicinalmente utilizados em diferentes formas, por vezes em combinação com outras ervas [4]. Phytochemical pesquisa efectuada em

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levou ao isolamento de fitoesteróis, aminoácidos, furanocoumarins, flavonóides, componentes fenólicos, hidrocarbonetos, álcoois alifáticos, os componentes voláteis e algumas outras classes de metabolitos secundários, taninos, esteróides , alcalóides e β-sitoesteril–d-glucósido, vitamina K, n-octacosanol, oleanolate metilo, lanosterol, estigmasterol, lupen-3-ona [5], [6]. Singh

et al

[7] tinha sugerido uma investigação detalhada por seu potencial contra o cancro, doenças cardiovasculares, inflamatórias neuro, neuropsiquiátrica, desordens relacionadas ao estresse oxidativo e infecções parasitárias. A maioria dos estudos farmacológicos foram destinadas a validar as suas utilizações tradicionais para a cura de feridas [8], [9], anti-bacteriana [10], anti-convulsivante [11], anti-diabético [12], anti-oxidante [13] , anti-inflamatório [14], actividade inibidora da colinesterase acetil [15] e a actividade anti-ansiedade [16]. O extracto metanólico de

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folha forte exerce efeito neuroprotector contra a inflamação causada por mediadores tais como o óxido nítrico e citóquinas em LPS (lipopolissacarídeo) estimulada por microglia via MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) via [17] .

espécies de Ficus

foram mostrados para ter actividade anti proliferativa em linhagens de células tumorais e as suas diversas partes têm mostrado efeitos apoptóticos, proporcionando assim um suporte farmacológico preliminar para seu uso como droga anticâncer [18] . Até à data, nenhuma literatura e evidências experimentais estão disponíveis para fundamentar o anti-câncer e efeito apoptótica de

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extratos de folhas em várias células de câncer de mama. Isto levou-nos a investigar o possível mecanismo da sua actividade de promoção de apoptose e para identificar actividade biológica adicional, se for o caso.

ciclo celular é um processo que actua como uma chave para controlar o crescimento e proliferação de uma célula. A interrupção do processo do ciclo celular irá causar um desequilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular, subsequentemente levando ao desenvolvimento do cancro. Assim, o ciclo celular pode servir como alvo para agentes anti-cancerígenos para deter a proliferação descontrolada de células tumorais e de dar início a eles sofrem apoptose [19]. O processo de apoptose (ou morte celular programada) é um mecanismo importante na resposta ao tratamento citotóxico e sua indução é uma altamente desejável

modus operandi Compra de um agente anticancerígeno [20]. Um dos desafios no tratamento do cancro é que as células malignas possuem a capacidade para evadir a apoptose, o que é a causa principal para a ineficácia de qualquer droga citotóxica para matar tais células. O presente estudo mostra o efeito do extrato de acetona de

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folhas na inibição da dose e do crescimento dependente do tempo de múltiplas linhas celulares de cancro da mama que foi associado com Bax translocação e mitocôndrias apoptose mediada com a ativação da Caspase 9 via dependente. Embora FAE induz a activação de caspase significativa tanto no ensaio enzimático, bem como em modelos de células sensor de caspase de células vivas, a exposição contínua das células tratadas revelou uma actividade inesperada de fotossensibilização. Este estudo é importante porque é o primeiro relatório de prestação de provas para mostrar que os componentes de bio-disponíveis de

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extrato de folha exercem fotossensibilizantes e indução de apoptose capacidade através da geração de ROS intracelular.

resultados

análise fitoquímica

o extracto de acetona bruto recentemente preparada de

Ficus

folhas (FAE) foi qualitativamente testado para a presença de alcalóides, flavonóides, fenóis, saponinas e taninos ( A tabela 1) utilizando procedimentos padrão de análise [21]. método colorimétrico de cloreto de alumínio foi usado para a estimativa de flavonóides [22]. O teor de flavonóides do extrato em termos de quercetina equivalente foi de 79 ± 4 mg /g de pó FAE seco. Os fenóis totais estimados pelo método de Folin Ciocalteu [23] em termos de equivalente de ácido gálico foi de 110 ± 2,18 mg /g no extrato em pó.

FAE inibiu a proliferação de linhas de células do cancro da mama

o efeito anti-proliferativo de FAE sobre o crescimento de células epiteliais mamarias, células MCF-10A, as células MCF-7, células MDAMB231, T47D e SKBr3 foram inicialmente determinadas por MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio) ensaio de citotoxicidade e por ensaio de exclusão do corante azul tripano. As células foram tratadas com concentrações crescentes de FAE (20-320 ng /ml) durante 24, 48 e 72 h. FAE inibiram o crescimento de células de cancro da mama em uma dose e forma dependente do tempo (Figura 1A). IC

50 valor para cada linhas de células determinados a partir dos dados de MTT são – 363,6 ug /ml (células epiteliais mamárias), 800 ug /ml (MCF10A), 83,3 ug /ml (MCF-7), 121,2 ug /ml ( MDAMB231), 81,6 ug /ml (T47D) e 75,47 ug /ml (SKBr3). Nas duas células epiteliais mamárias não tumorigénicas, FAE mostrou citotoxicidade moderada do que as células cancerosas. Um ensaio baseado em proteína Sulforodamina B também foi realizada fundamentado que os resultados do MTT (Figura 1B). Estes resultados sugeriram que FAE mostrou grande selectividade em relação a células cancerosas do que células normais. Além disso, a observação microscópica da morfologia celular indicou que o tratamento FAE induziu alterações morfológicas notáveis ​​incluindo a formação de bolhas de membrana e encolhimento das células para além da redução na densidade celular de um modo dependente do tempo (Figura 1E), que era consistente com os dados do corante azul de exclusão com Trypan ( Figura 1C). Temos realizado ensaio de sobrevivência de células clonogénicas para avaliar o efeito de FAE na formação de colónias. FAE tratamento diminuiu significativamente o número de colónias de um modo dependente da dose em células MCF-7 (Figura 1D).

(A), células MCF-7 a proliferação celular foi avaliada pelas células MTT assay- foram tratados com 20, 40 , 80, 160 e 320 ug /ml de FAE durante 48 h. IC

50 valor para cada linhas de células determinados a partir dos dados de MTT são- 363,6 ug /ml (células epiteliais mamárias), 800 ug /ml (MCF10A), 83,3 ug /ml (MCF-7), 121,2 ug /ml ( MDAMB231), 81,6 ug /ml (T47D) e 75,47 ug /ml (SKBr3). (B) A citotoxicidade foi determinada utilizando um teste de viabilidade celular viabilidade base de proteínas ensaio Sulforrodamina B (C) por ensaio de exclusão do corante azul de tripano, as células MCF-7 foram tratados com CI

50 de FAE para 24, 48 e 72 h. Os dados mostrados representam ± SD média de três experiências independentes. (D) FAE inibe a formação de colónias de células de câncer de mama. As células MCF-7 foram semeadas em placas de seis poços a 500 células /poço em DMEM isento de fenol vermelho, contendo 10% de FBS. Após 12 h, as células foram tratadas com diferentes concentrações de FAE. O meio foi mudado com FAE depois a cada 4 dias. Após 14 dias de incubação, as colónias foram coradas com solução de violeta cristal a 0,3% durante 2 minutos, lavado com PBS, e contadas seco ao ar. Cada experiência foi realizada em triplicado. (E) de inibição de crescimento e as alterações morfológicas de células MCF-7 tratadas pelo IC

50 valor da FAE por 24, 48 e 72 h, em comparação com células não tratadas. As células foram fotografadas com um microscópio invertido Leica DMIL (200 ×).

FAE causou a parada do ciclo celular leve e Sub-Go Indução

ensaios de viabilidade celular confirmou a capacidade dos FAE para inibir o crescimento de células MCF-7. Análise do ciclo celular usando citometria de fluxo foi efectuada para determinar se a inibição induzida FAE de crescimento de células MCF-7 foi o resultado da indução de apoptose ou paragem do ciclo celular ou a activação simultânea destes dois modos. Um histograma representativo juntamente com os dados fechado é dado (Figuras 2 A e B). Os resultados revelaram que o tratamento de FAE a 100 ug /mL durante 24, 48 e 72 h induziram um aumento dependente da dose e do tempo na percentagem de células em sub-L

0 fase, que foi acompanhada por uma redução correspondente na percentagem de células no S e G

2 /M fase. Em 24 h de exposição, não houve alteração considerável na distribuição de fases do ciclo celular. O tratamento com FAE durante 48 e 72 h aumento da população de células de G

uma fase de 60,4% e 58,3% respectivamente, como comparado com o controlo de 56,6% (Figuras 2 A e B). Todos estes resultados indicaram que FAE induzida G

1 prisão fase leve e indução de sub-Go população. Todos os valores foram obtidos a partir de três experiências independentes. diferenças significativas em relação ao valor de controlo foi indicada por um * (P 0,05), ** (P 0,01) ou *** (p 0,001).

células MCF-7 foram cultivadas com FAE a 100 ug /valor mL durante 24, 48 e 72 h e a distribuição de fases do ciclo celular foi determinado por coloração com PI e analisados ​​utilizando o software diva BD (a). A percentagem de fases do ciclo celular são mostradas no histograma (B).

FAE Induced de condensação da cromatina e apoptose

Hoechst 33342 coloração da MCF 7-células tratadas com FAE em IC

50 para 24, 36 e 48 h também mostrou o aparecimento de alterações apoptóticas característicos, tais como a condensação da cromatina nuclear (Figura 3A). FAE apoptose induzida foi ainda confirmada por dupla marcação anexina V-FITC /PI. As alterações celulares envolvidos no processo de apoptose incluído perda de assimetria de fosfolípido. No início da apoptose, a fosfatidilserina, que é normalmente encontrado na camada interna da membrana plasmática, torna-se translocado para o exterior. A Anexina V-FITC pode ligar-se ao fosfatidilserina exposta na superfície da membrana do plasma [24]. Anexina V-positivas /negativas células PI foram consideradas apoptótica precoce, células positivas para PI positivos e anexina V foram apoptótica ou necrótica tarde. Não houve aumento significativo na população celular apoptótica precoce ou tardia em 24 h de tratamento com FAE (Figura 3B). No entanto, após 36 h de tratamento, a percentagem de células apoptóticas precoces aumentada para 16,85% em relação ao controle de 3,15%. Depois de 48 h de tratamento, a população apoptótica total aumentou até 53,4% (41,4% de apoptose inicial e 12% de apoptose tardia, p 0,05; Figura 3C).

mudanças (A) nucleares associados com células MCF-7 células tratadas com IC

50 valor da FAE após Hoechst 33342 coloração sob Eclipse E-600 microscópio de fluorescência (400 ×). O número de células que apresentam morfologia apoptótica característica emissores de fluorescência brilhante aumentou de uma forma dependente do tempo. (B) A análise de FACS através de anexina V-FITC coloração /PI foi usado para observar a indução de apoptose. Células no quadrante inferior direito indicam anexina-positivo /PI negativo, as células iniciais apoptóticos. As células no quadrante superior direito indicam anexina-positivo /PI positivo, células final apoptóticos ou necróticos. (C) A percentagem de células que sofrem apoptose precoce e tardio em comparação com o respectivo controlo, por tratamento com FAE durante 48 horas, altura em IC

50 valor. Cada valor representa ± SD média de três experiências independentes. diferença significativa do valor de controlo foi indicada por * (p 0,05).

FAE Stimulated translocação de Bax-GFP para mitocôndrias e perda de mitocondrial transmembranar potencial em um tempo forma dependente

Bax é uma proteína multi-domínio pró-apoptótica forte que reside no citoplasma como monómero inactivo em células saudáveis. Após a estímulos apoptóticos, Bax sofre activação conformacional que conduz à sua translocação para a mitocôndria. Vários estudos tinham previamente implicado papel de Bax e a sua activação conformacional como os eventos iniciais que contribuem para a libertação de citocromo c das mitocôndrias e subsequente activação da caspase em droga apoptose induzida sinalização intrínseca [25]. Temos empregue uma plataforma de base de células sensíveis, células MCF-7 que expressam EGFP-Bax (Enhanced Green Fluorescent Protein) e Mito DsRed Bax para detectar a translocação para a mitocôndria em morte celular induzida FAE. A fim de marcar a actividade em grande número de células vivas, Caminho Bio gerador de imagens foi utilizada com 2 × 2 montagens como descrito [26]. A imagem representativa de células MCF-7 Bax EGFP após o tratamento com 100 ug /ml de FAE foi mostrado na Figura 4A. Como mostrado na Figura 4B, tão cedo quanto 3 h de tratamento de droga cerca de 33,3% das células mostraram um padrão granular mitocondrial nas células tratadas em comparação com células não tratadas. Antes do tratamento FAE, o Bax-EGFP mostrou padrão citosólica difusa indicando o seu estado monomérico. Em horas mais tarde, a maioria das células mostraram padrão granular com enormes grandes oligômeros Bax na mitocôndria (Figura 4B). Uma imagem de alta ampliação de mitocôndrias em Bax agrega também é mostrado na Figura 4B. Temos observado um aumento da translocação início Bax em Bax sobre-expressando células que foi consistente com o relatório anterior que a sobre-expressão do Bax células sensibilizadas a morte devido à sua actividade pró-apoptótica inerente [27]. O resultado claramente demonstrada que a activação Bax cedo desempenhou um papel crítico na FAE sinalização de apoptose induzida. O silenciamento de Bax utilizando siRNA reduzida a condensação da cromatina no FAE células tratadas, em comparação com células transfectadas de sequência (Figuras 4 mexidos II e III). Além disso, tínhamos utilizadas linhas adicionais de células de câncer de mama três, MDAMB 231, SKBR3, T47D e duas células diplóides normais ao perfil actividade apoptótica de FAE. Para visualizar a membrana mitocondrial potencial condensação da cromatina e simultaneamente, as células após tratamento com 100 ug /ml de FAE durante 36 h foram coradas com corante de membrana mitocondrial potencial específico TMRM e corante nuclear Hoechst 33342, como descrito [28]. Como mostrado na Figura 5A, a maioria das células de cancro da mama tratadas mostraram uma diminuição na intensidade TMRM indicando que o potencial de membrana mitocondrial foi perdido que se correlacionavam bem com cromatina condensada. Curiosamente ambas as células endoteliais humanas, bem como células epiteliais mamárias humanas mostraram menos perda de intensidade de TMRM e menos do que a condensação da cromatina das células cancerosas. Os resultados sugeriram que a morte celular induzida FAE na maioria das células de cancro da mama com a perda do potencial de membrana mitocondrial e a condensação da cromatina. As células diplóides normais em proliferação foram relativamente resistentes à morte celular por apoptose induzida pela FAE. No entanto, eles também demonstraram uma diferença de TMRM fluorescência, em comparação com células não tratadas, o que indica que a permeabilidade da membrana mitocondrial é alterada.

(A) células MCF-7 que expressam EGFP Bax e Mito DsRed foram semeadas em placas de 96 vidro bem inferior placa (BD, EUA), com baixa densidade e após 48 h, tratada com FAE a 100 ug /ml. A imagem foi tirada utilizando BD Caminho Bioimager 435 (Becton Dickinson, EUA) a 3, 18 e 27 h, definindo Montagem (2 × 2) e Macro específica usando o software AttoVision ™. O agregado granular verde indica que a translocação para a mitocôndria de Bax, como indicado pelas setas. As imagens representativas recolhidos em pontos de tempo indicado, foram utilizados para a análise de percentagem de células positivas com Bax EGFP para a mitocôndria em relação ao total no campo. (B) O gráfico mostra a percentagem de células que sofrem Bax translocação para a mitocôndria após tratamento FAE. células (C) O MCF-Bax DS-vermelho foram tratados conforme indicado acima. acumulação Bax-EGFP na mitocôndria é indicado em imagens de alta ampliação com setas. Uma imagem fundida aumentada das células tratadas também é mostrada. células (D) MCF-7 foram transfectadas com Controlo (SCR) ou siARN Bax siARN. Após 48 h de transfeco, extracto celular total foi preparado e imunotransferidas para Bax e actina. As mesmas células também foram corados com Hoechst 33342 após 48 horas de tratamento FAE de visualizar a condensação da cromatina (painel da esquerda). O gráfico é a representação quantitativa da percentagem de células com cromatina condensada em células mexidos transfectadas e Bax-transfectadas após o tratamento FAE.

As células de cancro da mama (A), MDAMB231, T47D, SKBR3 e as células normais como as células epiteliais mamárias humano e células endoteliais humanas após tratamento com FAE a 100 ug /ml durante 24 h foram coradas com 50 nM de TMRM e 0,5 ug /ml de Hoechst 33342 durante 15 minutos. Em seguida, as células foram fotografadas ao microscópio fluorescente utilizando DAPI e conjuntos de filtros Rodamina usando 40 × objetiva. As imagens foram capturadas com a câmera Retiga Exi usando software elemento NIS (Nikon). (B) clivagem Ac-LEHD-AFC (Caspase 9 de atividade) (C) clivagem Ac-DEVD-AMC (Caspase 3/7 atividade). As células MCF-7 foram tratados com CI

50 valor de FAE para 24, 36 e 48 h. Os resultados foram medidos fluorometricamente. Os valores são expressos como média ± desvio padrão de amostras em triplicado. Diferença significativa do valor de controlo foi indicada por um * (P 0,05), ** (P 0,01) ou *** (p 0,001). FAE tratamento resultou num aumento dependente do tempo na clivagem de Ac-LEHD-AFC (Acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluorometil cumarina), sugerindo uma maior actividade de caspase 9 (Figura 5B). Em 24 h de tratamento, sem clivagem proeminente de Ac-DEVD-AMC (substrato para as caspases 3/7; Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metilcumarina) foi observado. atividade DEVDase perceptível só ocorreu 36 h tratamento com FAE. barra de escala representa 50 micrômetros.

FAE triggerd ativação de caspase 9

Para examinar o envolvimento das caspases na apoptose induzida FAE, as atividades de iniciador Caspase 9 like (LEHDase) e efetoras caspase 7/3 como atividades (DEVDase) foram investigados por ensaio protease fluorom�rica. As células MCF-7 foram tratadas com FAE em IC

50 valor para 24, 36 e 48 h e atividades caspase foram determinados. FAE tratamento resultou num aumento dependente do tempo na clivagem de Ac-LEHD-AFC (Acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluorometil cumarina), sugerindo uma maior actividade de caspase 9 (Figura 5B). Em 24 h de tratamento, sem clivagem proeminente de Ac-DEVD-AMC (substrato para as caspases 3/7; Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metil cumarina) foi observado. atividade DEVDase perceptível só ocorreu 36 h tratamento com FAE (Figura 5C).

FAE Induced Caspase Activation no Modelo de células vivas de Caspase Activation

Acima de resultados indicaram que FAE apoptose induzida principalmente por meio de mitocôndrias mediada via intrínseca envolvendo Bax permeabilização mitocondrial mediada seguido por caspase 9 e caspase 3/7 activação. Além disso, para comprovar o papel das caspases na morte celular induzida FAE, nós usamos uma FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) modelo de células vivas com base conforme descrito anteriormente [28] para monitorar activado caspases em células vivas. Em resumo, a linha celular de cancro da mama que expressam a sonda FRET ECFP-DEVD-EYFP (Enhanced Cyan Fluorescent proteína-caspase 3 clivada sequence- reforçada proteína fluorescente amarela) foi exposta a FAE a 100 ug /ml e fotografada em modo de razão. Após a activação de caspase, a FRET do fluoróforo dador de aceitador foi perdida com o aumento da ECFP e diminuição da fluorescência EYFP. Como mostrado na Figura 6A, as células de controlo não tratadas demonstraram um aumento da fluorescência do aceitador de fluorescência do dador que foi reflectida como diminuição em relação /EYFP ECFP (0,04) devido a um aumento da transferência de energia de fluorescência mediada por receptor. No entanto, nos poços tratados, a maioria das células mostraram um aumento da proporção de 1,005, indicando a perda de FRET, devido a clivagem de caspase mediada DEVD do ligador colocado entre dador e aceitador com aumento de ECFP e diminuição da fluorescência EYFP. As células apoptóticas tardias com encolhimento celular perceptível eram vistas como corpos brilhantes na imagem com relação de mudança suficientes relação da imagem (Figura 6A) no.

células MCF-7 (A) que expressa caspase sondas FRET foram expostas a 100 ug /ml de FAE para 24 he 48 h. Os canais ECFP, EYFP trastes e fundiu imagens para tratada DMSO e FAE trataram células são mostrados. A relação da imagem ECFP /EYFP também é mostrada. O gráfico mostrado é a alteração na proporção quantitativa em DMSO e FAE tratada células morrendo como analisado em software elementos NIS (N = 4). (B) As mesmas células foram coradas com TMRM e expostas a 100 ng /ml de FAE e fotografada para TMRM, ECFP, EYFP-FRET em um modo de intervalo de tempo com um intervalo de 5 minutos, como descrito. A imagem resultante da concentração de TMRM, ECFP, EYFP-FRET a partir das imagens de lapso de tempo para os pontos de tempo indicados, são mostrados. A alteração do índice de ECFP /EYFP em DMSO e FAE células é mostrado como um gráfico tratada. O gráfico indica a alteração na proporção quantitativa em DMSO e FAE-tratados células morrendo (quadro completo é mostrado como vídeo S1). (C) A FRET células que expressam foram tratadas como acima e a visualização foi efectuada tal como descrito com um intervalo de 2 minutos. A imagem representativa durante o tempo indicado é mostrado (quadro completo é mostrado como vídeo S2). As mesmas células tratadas com DMSO e fotografada como descrito para C. A imagem representativa durante o tempo indicado é mostrado (quadro completo é mostrado como vídeo S3). (D)

FAE Possessed forte efeito fotossensibilizador

Para a análise do efeito fotossensibilizante da FAE, o sensor Caspase células que expressam foram semeadas em 8- vidro bem compartimentado placas de fundo e corados com mitocondrial potencial de membrana corante fluorescente específico TMRM (éster tetrametilrodamina metil) como descrito anteriormente [28 ]. As células foram tratadas com 100 ug /ml de FAE e expostos a imagiologia contínua para TMRM bem como dador e o aceitador de fluorescência usando CARV (BD Biosciences) microscópio confocal durante 24 h a intervalos regulares de 5 minutos. Como mostrado na Figura 6B e vídeo S1, no prazo de 30 minutos de imagiologia, as células perdidas TMRM fluorescência indicando a perda de potencial de membrana mitocondrial. perda de células notável foi evidente tão cedo quanto 60 minutos procedeu-se rapidamente que a perda completa de células no plano de imagem por 7 h. Apenas uma ligeira alteração no rácio /EYFP ECFP foi observado nestas células, indicando a activação da caspase parcial (Figura 6B). Além disso, para comprovar o papel fotossensibilizador da FAE, reduzimos o intervalo de exposição aos 2 minutos com imagens contínuas até 200 frames. Curiosamente, a perda de células bem correlacionado com o número de quadro, em vez de o momento do tratamento de FAE comprovar que o efeito sensibilizante foi altamente influenciada pela exposição à luz de excitação, em vez de a duração do tratamento FAE. As células não tratadas expostas a condições de imagiologia mesmos não mostraram qualquer alteração na proporção ou perda de células durante até 24 h de imagiologia de validação de que o efeito observado foi causado pela FAE (S2 Figuras 6B, C, D e vídeos, S3). As células também retido TMRM fluorescência indicando a manutenção do potencial de membrana mitocondrial ao longo do período de imagem. No geral, os resultados confirmaram que FAE possuía fotossensibilizantes efeito que foi associada a rápida perda de transmembrana mitocondrial potencial e parcial ativação Caspase.

FAE Expressão Mediada de Reguladores apoptóticos

Inorder para fundamentar a importância da Caspase cascata trás a indução de apoptose, analisou-se a clivagem de caspases importantes como a caspase 8, caspase 7, caspase 9 e também PARP (poli (ADP-ribose) polimerase) em células MCF-7, T47D e MCF10A. Como mostrado na Figura 7A, o tratamento FAE em 80 e 160 ug /ml de clivagem de caspase 8, caspase e caspase 7 9 induzidas em células MCF-7, bem como em T47D. A clivagem da PARP também foi observada nestas células. No entanto, em MCF10A, apenas uma ligeira clivagem foi evidente tanto para as caspases e PARP.

(A) células MCF-7 foram tratadas com FAE (80, 160 ug /ml) durante 48 h e colhidas. As imunotransferências foram realizadas no extracto celular total utilizando os anticorpos indicados. A de comprimento completo e fragmentos clivados correspondente são indicadas. Para blot de PARP, as células foram tratadas com 160 ug /ml de FAE durante 48 h. As células MCF-7 e T47D (B) foram tratadas com 100 ug /ml de FAE durante 24 h. FAE geração de ROS induzidas em células MCF-7, bem como células T47D do que o controlo de DMSO, como indicado por um aumento na fluorescência de DCF-DA em células tratadas. As células MCF-7 e T47D (C) foram tratadas com 100 ug /ml de FAE sozinho e após pré-tratamento com NAC durante um período de 24 h. Como mostrado, o pré-tratamento de células com o antioxidante NAC reduziu a morte celular induzida pela FAE. Percentagem de células com cromatina condensada para cada grupo é mostrado como gráfico (N = 3)

FAE -. Induzida Cell Death Geração Envolva de ROS

Os resultados anteriores indicaram que na maioria das linhas celulares utilizadas, de FAE poderia provocar a perda da integridade da membrana mitocondrial e a condensação da cromatina, possivelmente através de maneira dependente da Bax. Além disso, mediante imagens de células vivas temos acidentalmente observado efeito fotossensibilizador para o FAE extrair em células MCF-7 expressando sonda sensor de caspase com perda acelerada do potencial de membrana mitocondrial. Anteriormente, foi relatado que a maioria dos fotossensibilizadores induzida morte celular por meio da geração de ROS [29], um dos gatilhos proeminentes para a activação do Bax conformacional. Por isso, analisaram as ROS após tratamento das células com 100 ng /ml de FAE durante 24 h por FACS. Como mostrado na Figura 7 B, FAE induzida a produção de ROS em células MCF-7, bem como células T47D indicados por aumento da 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H

2-DCF-DA) de fluorescência nas células tratadas do que o controle . Pré-tratamento das células com o anti-oxidante N acetilcisteína (NAC) reduziu a morte celular induzida pela FAE como mostrado nos resultados de condensação da cromatina (Figura 7 C). -Lo novamente validado que a geração de ROS nas células foi o principal gatilho para a morte celular por apoptose e que possa contribuir para a sua actividade fotossensibilizante.

Discussão

extractos de produtos naturais têm sido amplamente testado na indústria farmacêutica a indústria e têm sido considerados como uma valiosa fonte de novas drogas [30]. Como um meio de identificação de agentes anti-câncer, a farmacologia reversa, ou o ‘cabeceira’ para abordagem “banco” tem sido explorado que envolve o estudo de plantas medicinais que têm sido tradicionalmente utilizados para tratar várias doenças. Vários estudos indicam que

Ficus

espécies são amplamente utilizados no tratamento de vários tipos de doenças, como doenças respiratórias, distúrbios sexuais, distúrbios do sistema nervoso central (SNC), desordens cardiovasculares (CV), problemas gástricos, infecções da pele e diabetes etc. [31], [6]. A maioria dos estudos farmacológicos foram destinadas a validar as suas utilizações tradicionais [32]. Embora design moderno droga enfatiza o desenvolvimento de agentes com alvos específicos individuais, o facto de extracto completo tem sido demonstrado ser mais eficaz do que os seus componentes individuais (um conceito conhecido como sinergia ervas) sugere as limitações desta abordagem [3]. Morte de células tumorais através da indução de apoptose é agora reconhecido como uma estratégia para a identificação de fármacos anti-cancro [33]. No presente relatório, buscou-se determinar os mecanismos pelos quais a fração de acetona de

F.religiosa

extrato de folha exerce o seu efeito anti-proliferativo em várias células de cancro da mama.

Efeito

Anti-proliferativa