Sumário

Apesar da terapia óptima radiação (RT), a quimioterapia e /ou cirurgia, a maioria dos pacientes com localmente avançado cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) não responde ao tratamento. Para identificar genes alvos novos para o controle de tumor melhorada, realizamos todo genoma telas de RNAi para identificar knockdowns que mais reprodutível aumentar NSCLC citotoxicidade. Estas telas identificadas várias subunidades de proteassoma entre maiores sucessos, incluindo o hit de nível superior

PSMA1

, um componente do núcleo 20 S proteassoma. Radiação e proteassoma inibição mostraram efeitos sinérgicos. A inibição do proteosoma resultou numa redução de 80-90% na recombinação homóloga (HR), uma diminuição de 50% na expressão de genes de RH NF-kB-induzíveis

BRCA1

e

FANCD2

, e uma redução de BRCA1, FANCD2 e RAD51 ionizante focos induzidos pela radiação. IκBα RNAi knockdown resgatado NSCLC radiorresistência. A irradiação de camundongos com xenoenxertos NCI-H460 após inducible

PSMA1

shRNA knockdown marcadamente aumento da sobrevida murino em comparação com qualquer tratamento sozinho. A inibição do proteosoma é uma estratégia promissora para NSCLC radiossensibilização via inibição da expressão de NF-kB mediada da anemia de Fanconi /RH genes de reparo de DNA

Citation:. Cron KR, Zhu K, Kushwaha DS, Hsieh G, Merzon D, Rameseder J, et al. (2013) Câncer de Pulmão Reparo do DNA inibidores de proteassoma do bloco e do celular radiossensibilizar Non-Small. PLoS ONE 8 (9): e73710. doi: 10.1371 /journal.pone.0073710

editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de abril, 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 05 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cron et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma Sociedade americana para radiação Oncológica (ASTRO) Júnior Faculdade Carreira Award Training Research, um Centro Conjunto de radioterapia Foundation Grant, a Dana-Farber /Award Harvard Cancer Center SPORE Developmental Projeto de Pesquisa em Pesquisa Cancro do pulmão, eo National Cancer Instituto dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número K08CA172354. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a radioterapia (RT) é uma modalidade crítica no tratamento de cancro do pulmão. É altamente eficaz quando a doença está localizada, e as doses curativas pode ser administrada com segurança. Por exemplo, os carcinomas do pulmão de células Fase I não pequenas (NSCLC) pode ser suficientemente tratado com doses elevadas de radiação ionizante (IR), para se obter as taxas de controlo locais de 3 anos, cerca de 90% [1]. Isto é principalmente devido às altas doses biologicamente eficazes (TCAP), que podem ser administradas a tumores de pulmão isolado utilizando radioterapia estereotáxica corpo. Infelizmente, apenas 15% dos pacientes apresentam com tais tumores [2]. tumores mais avançados, os quais são significativamente mais comum, não podem ser tratados com maior CAMA, devido à infiltração de, ou proximidade com, estruturas radiossensíveis incluindo os pulmões, medula espinal, do esófago e do coração [3]. Esta limitação representa as taxas de falhas locais mais elevados de cerca de 30% [4]. agentes sistémicos são, por conseguinte, administrada para melhorar a resposta a radiação. Tais agentes incluem agentes quimioterapêuticos citotóxicos que se têm toxicidades dose-limitante significativos e efeitos limitados sobre o controlo do tumor. Apenas uma minoria dos tumores apresentam características genéticas, tais como mutações EGFR ativação [5] ou translocações EML4-ALK [6], que permitem a terapias específicas; Opções adicionais são necessários.

Vários estudos genômicos foram concluídos em NSCLC, incluindo sequenciação de ADN [7], número de cópias análise [8] e perfil de expressão gênica [9]. Estes estudos deram uma identificação imparcial das alterações genéticas e epigenéticas mais frequentes e importantes entre as 20-25,000 genes do genoma humano [10]. Eles revelaram associações intrigantes entre genes e co-variáveis ​​clínicas, mas foram incapazes de demonstrar diretamente as relações de causa e efeito entre as alterações e os resultados terapêuticos. Em contraste, a interferência de RNA (RNAi) pode demonstrar directamente os efeitos da expressão gênica reduzida na fisiologia e sobrevivência celular [11].

agrupada RNA curto hairpin (shRNA) telas, em que as células cancerosas são expostos a vários milhares sequências shRNA diferentes, com média de um knockdown gene por célula, tem vários recursos interessantes. Em primeiro lugar, o efeito do knockdown shRNA estável ao longo de várias duplicações celulares podem ser exploradas, em comparação com a transfecção transiente das sequências de pequenos ARN interferente (siRNA) com efeitos de curta duração. Por conseguinte, os tratamentos shRNA expressão imita droga que normalmente são dadas ao longo de várias semanas, em vez de dias. Além disso, as células que abrigam seqüências shRNA diferentes competir eficazmente uns com os outros dentro da piscina como eles proliferam, dando origem a acertos que produzem efeitos mais pronunciados na proliferação [12].

Uma vez que a radioterapia é a base do tratamento NSCLC, gene silencings que resultam em citotoxicidade sinérgico quando combinados com radiação ionizante (IR) são desejáveis. Muitos tratamentos contra o cancro são aditivos na natureza, e são combinadas uma vez que resultam em perfis de efeitos colaterais diferenciais [13]. tratamentos sinérgico que resultam em efeitos maiores quando são administrados concomitantemente, em comparação com os efeitos aditivos de cada tratamento dada individualmente, podem servir particularmente bem como radiossensibilizadores, uma vez que a entrega de RT pode ser restrita a um volume limitado, e os efeitos secundários podem ser menos pronunciado fora da irradiado volume.

Demonstrando o mecanismo de um shRNA sensibilizador também pode revelar biomarcadores para a seleção dos pacientes e avaliação do tratamento. DNA rupturas dos filamentos duplos (LAP) estão entre os efeitos de IR que melhor se correlacionam com a sua citotoxicidade. Uma única ORL não reparada é suficiente para resultar em morte celular via reprodutiva paragem G2 ou catástrofe mitótica [14]. LAP são predominantemente reparado através de duas vias, recombinação homóloga (RH) e não homóloga-end juntar (NHEJ) [15]. silencings gene ou pequenas moléculas inibidoras de cada via pode promover radiossensibilização.

Aqui nós examinar a inibição do proteosoma como uma estratégia para NSCLC radiossensibilização através da inibição da reparação do ADN DSB. A inibição do proteosoma tem sido explorado em vários ensaios clínicos que se inscrevem pacientes com NSCLC, com resultados variáveis. Por exemplo, um estudo de Fase II de 114 pacientes tratados com bortezomib mais gemcitabina e carboplatina como tratamento de primeira linha de NSCLC avançado, mostrou uma taxa de resposta de 23% e uma taxa de controle da doença (respostas + doença estável) de 68%, garantindo, assim, mais estudos [16]. Bortezomib mostrou nenhuma atividade como monoterapia em um estudo de Fase II de 14 pacientes, nenhum dos quais mostravam respostas objetivas, e três (21%) tiveram a doença estável duradoura 3.4-11.5 meses [17]. Com base em nossos dados, propomos que os inibidores de proteassoma pode ser útil como radiosensitizers, dado os seus efeitos repressivos na expressão de NF-kB mediada por genes necessários para a via HR.

Resultados

Proteasoma múltipla Os genes são Top hits em todo NSCLC telas genoma RNAi

Um genoma tela inteira shRNA foi realizado em duas linhas de células NSCLC, A549 e NCI-H460. Estas linhas partilham características genéticas comuns, incluindo mutações no

KRAS Comprar e

STK11

(aka LKB1). Estas mutações são encontradas em tumores que são particularmente fortes e resistentes a terapia, e para os quais não estão disponíveis terapias orientadas [18], [19]. As linhas de células são de tipo selvagem em

TP53

e, portanto, menos provável, em comparação com as linhas mutantes, exibem a instabilidade genómica ao longo de uma tela abrangendo várias semanas [20]. Além disso, sua semelhança genética, em termos de genes supressores de chave oncogênicos e tumorais, aumenta a probabilidade de que a tela sucessos em uma linha será reproduzida no outro (Tabela S1).

A biblioteca Hannon-Elledge contém 74.705 distinta sequências e alvos shRNA quase 18.000 genes [21]. Após a transdução com esta biblioteca e seleção de puromicina para integrantes estáveis, as células foram passadas, e a representação relativa de cada sequência dentro de um pool foi determinada antes e após doze duplicações da população. shRNA sequências dirigidas contra genes essenciais para a proliferação celular foram perdidos selectivamente. 1.667 genes foram os alvos de, pelo menos, uma sequência de shRNA cuja abundância reduzida em pelo menos duas vezes durante a passagem em ambas as linhas celulares (Tabela S2). Várias subunidades de proteassoma numerados entre os acertos em ambas as linhas celulares, incluindo o hit top

PSMA1

, uma subunidade do núcleo 20 S proteassoma [22] (Fig. 1 e Tabela S3).

diagrama do S proteassoma 26 mostrando toda genoma tela múltipla shRNA bate com o seguinte código de cores: top hit (vermelho), hit forte ( 1 seqüência shRNA per gene em ambas as linhas celulares, laranja escuro), hit menor (1 seqüência shRNA per gene em ambas as linhas celulares, laranja claro), sítio catalítico proteolítico quimotripsina-like (não é um hit, mas destaque para fins ilustrativos, verde). Cada batida é nomeada usando os dois últimos caracteres alfanuméricos de HUGO nomenclatura do gene; por exemplo, A1 = PSMA1, B5 = PSMB5, ​​M1 = SHFM1.

inibidores de proteassoma Sensibilizar NSCLC células à radiação

A doxiciclina-inducible shRNA knockdown de

PSMA1

em A549 e NCI-H460 resultou na perda de expressão da proteína de ambos PSMA1 e PSMB5, ​​uma outra subunidade do S proteassoma núcleo 20 e o sítio catalítico da actividade do tipo quimotripsina (CTL) do proteassoma [22] (Fig. 2A). Este resultado confirma o papel essencial da

PSMA1

em 20 de montagem do proteassoma S. O tratamento com o bortezomibe pequena molécula inibidora de proteassoma ou

PSMA1

shRNA knockdown causou uma perda de actividade de CTL (Fig. 2B).

(A) Western blot que mostra os níveis de proteína de PSMA1 e PSMB5 em A549 e as células NCI-H460 NSCLC após

PSMA1

shRNA knockdown em relação ao controle não-silenciando shRNA. (B) ensaio de actividade (CTL) proteassoma Chymotrypsin-like no A549 (à esquerda) e células NCI-H460 (à direita) NSCLC após o tratamento com bortezomib, ou

PSMA1

siRNA knockdown. Todos os resultados são a média ± SEM e normalizado ao veículo de controlo DMSO. (C) ensaio de sobrevivência clonogênica de A549 (à esquerda) e NCI-H460 (à direita) após IR e bortezomib. barras marcadas mostram a percentagem de mortes de amostras tratados com bortezomib em comparação com controlo de veículo de DMSO a cada dose IV. Todos os resultados são a média ± SEM e normalizado ao veículo de controlo DMSO. ensaio de detecção (D) Apoptose de NCI-H460 e a seguir 2 4 Gy IR e bortezomib 50 nM. As barras mostram percentagem de células em apoptose precoce (esquerda) ou apoptose tardia (direita) através de Anexina V e iodeto de coloração propidum, respectivamente. Todos os resultados são a média ± valores SD e P foram calculados usando

t

teste de Student de duas caudas.

O bortezomib é um agente ativo

in vitro

em NSCLC linhas, incluindo A549 [23] e NCI-H460 [24], e que demonstrou anteriormente radiossensibilizadora propriedades em estudos pré-clínicos [25]. A capacidade de inibidores de proteassoma para aumentar os efeitos da radiação fraccionado, um método de fornecer uma radiação clínica diariamente em doses pequenas para minimizar a toxicidade a longo prazo [26], foi, por conseguinte, explorou. Bortezomib e radiação fracionada produziu efeitos sinérgicos (Fig. 2C). Sinergia também foi observada com uma dose única de radiação (Fig. S1), embora o resultado com radiação fraccionado é mais clinicamente relevante. Este efeito sinérgico sobre a morte celular foi mediada pelo menos em parte por apoptose; 2 Gy IV sozinho não induziu a apoptose, enquanto que a combinação de IR e bortezomib induzida aumentou significativamente a apoptose em comparação com qualquer dos tratamentos sozinhos (Fig. 2D).

induzida por radiação danifica proteassoma Inibição reparação de quebras de ADN de dupla vertente diminuindo Recombinação homóloga

Dada a sinergia entre a inibição do proteassoma e da radiação, o próximo determinado se inibidores de proteassoma afetar o DNA breaks induzida por radiação de filamentos duplos (LAP) [26] (Figura 3). Em ensaios de cometa neutros, células NSCLC reparado a grande maioria de DSB de ADN gerado por irradiação de dose elevada dentro de uma hora. Em contraste, o tratamento com bortezomib antes da radiação atrasou significativamente a reparação de DSB de ADN, pelo menos, até 8 horas após a irradiação (Fig. 3A-B). Esta persistência de LAP pode resultar num aumento da catástrofe mitótica [27], que se acredita ser a causa predominante de morte celular em tumores sólidos irradiados.

(a) Visualização de um teste do cometa neutro mostrando induzida IV de ADN DSB em células NCI-H460 1, 4 e 8 horas após 40 Gy IR e pré-tratados com bortezomib 50 nM em comparação com controlo de veículo de DMSO. (B) Quantificação do ensaio do cometa neutra via momento de oliva (esquerda) e DNA% na cauda (à direita) em 1, 4 e 8 horas após 40 Gy IR com e sem 50 bortezomib nM em células NCI-H460. Cada ponto de dados representa 3 experiências independentes em duplicado de pelo menos 50 células. Todos os resultados são a média ± valores SD e P foram calculados usando

t

teste de Student de duas caudas. (B) ensaio de repórter GFP por recombinação homóloga após a inibição do proteassoma durante 24 horas através bortezomib ou

PSMA1

siRNA knockdown em A549 (à esquerda) e NCI-H460 (direita). Todos os resultados são SD ± média e normalizadas para o controle DMSO veículo (Veh) ou nonsilencing controle de siRNA. Os valores de P foram calculados utilizando

t

teste de Student de duas caudas.

Para observar os efeitos de bortezomib ou RNAi knockdown de

PSMA1

no reparo do DNA, um repórter GFP para construir RH [28] foi introduzido em células A549 e NCI-H460. Em comparação com células não tratadas, aqueles tratados com bortezomib ou

PSMA1

siARN mostrou uma diminuição estatisticamente significativa na reparação mediada por AR de I-

Sce

DSB de ADN I-induzidas (Fig. 3C). Resultados semelhantes foram observados por NHEJ (Fig. S2). Estes resultados demonstram um efeito direto da inibição do proteosoma sobre os mecanismos de reparo do DNA DSB, consistente com estudos anteriores [29] – [31].

Para entender o mecanismo de inibição de RH, nós exploramos o efeito de bortezomib em formação de focos nuclear de proteínas-chave no Anemia de Fanconi (FA) via /AR. IR induzida por formação de focos RAD51 nuclear, que é um biomarcador para HR [32], foi substancialmente reduzida pelo bortezomib ou

PSMA1

RNAi (Fig. 4A, a Fig. S3-S4). a expressão da proteína FANCD2 e formação de focos FANCD2 induzida IR foram igualmente diminuiu bortezomib ou

PSMA1

RNAi (Fig. 4B, Fig. S3-S4). Finalmente, formação de focos BRCA1 induzida IR foi significativamente reduzida pelo bortezomib ou

PSMA1

RNAi (Fig. 4C, Fig. S3-S4). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a inibição do proteassoma pode ter impacto reparação mediada por HR de LAP DNA induzidos por IR, reduzindo a disponibilidade ou o recrutamento de proteínas-chave /RH FA danificar sites.

(A) Depois de bortezomib × 24 horas ou

PSMA1

knockdown × 72 horas, A549 ou células NCI-H460 foram irradiados, em seguida, fixado após 6 horas. focos Rad51 foram detectados por imunofluorescência. As células com ≥5 focos foram classificados como positivos (n 100). Todos os resultados são a média ± SEM. Os valores de P foram calculados utilizando um teste t de Student de duas caudas. As fotos mostram imagens representativas de NCI-H460 tratados com bortezomib, barra = 10 mm. (B) como em (a), mas para FANCD2, incluindo Western blot e imunofluorescência. (C) como em (a), mas para BRCA1.

Proteasoma Inibição Blocos NF-kB expressão induzida de anemia de Fanconi /Genes recombinação homóloga

A seguir, explorou a relação entre proteassoma inibição e da via /HR FA via de sinalização de NF-kB. Dalton e colegas [33] demonstraram anteriormente que o bortezomib diminui a expressão do gene FA /BRCA em células de mieloma múltiplo, e que o NF-kB regula positivamente a via transcricionalmente /BRCA FA. Por exemplo, o NF-kB liga-se directamente ao promotor de

FANCD2

, com base no ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) (Fig. 5A). Um mecanismo pelo qual o bortezomib regula negativamente a via de NF-kB é através da inibição da degradação mediada por proteassoma de IκBα [34]. IκBα, que sequestra de NF-kB, no citoplasma, e fosforilação de IκBα pelo inibidor de NF-kB quinases (IKKS), liberta de NF-kB, permitindo a sua entrada no núcleo [35]. Bortezomib também regula negativamente a via de NF-kB através da indução de translocação nuclear de IκBα, resultando na supressão do NF-kB p65 transcrição /50-dependente [36].

(A) Diagrama de promotores de NF-kB em

FANCD2 Comprar e

genes BRCA1

. (B) Expressão por qPCR da

FANCD2

seguinte inibição do proteosoma ± 30 nM (A549) ou 50 nM (NCI-H460) bortezomib ou ± inducible

PSMA1

shRNA, e ± 10 Gy IR. Todos os valores são normalizados para ACTB e todos os resultados são a média ± SEM. (C) como em (B), mas com BRCA1. (D) a sobrevivência da célula NSCLC seguinte bortezomib e IR é parcialmente resgatado pelo

IkBα

siRNA knockdown quando realizada com antecedência. A viabilidade celular foi ensaiada utilizando um ensaio baseado em medição de luminescência ATP unidades luminescentes relativas (RLU). Todos os resultados são a média ± SEM.

Por isso, procuraram determinar se a transcrição induzida por IR de genes /RH FA

FANCD2

e

BRCA1

é diminuído pela A inibição do proteosoma. Transcrição de

FANCD2

e

BRCA1

aumento no prazo de 30 minutos de irradiação, e foi substancialmente bloqueada por qualquer bortezomib ou

PSMA1

RNAi (Fig. 5B-C). Esta escala de tempo curta poderia explicar o efeito de curto prazo sobre o reparo DSB observada no teste do cometa. Para estabelecer causalidade, foi realizado um experimento de resgate em células pré-tratadas com NSCLC IκBα siRNA. As células foram em seguida submetidos a inibição de proteassoma e irradiação. IkBa knockdown resgatado radiorresistência e célula de sobrevivência das células tratadas com bortezomibe (Fig. 5D). Esses dados estabelecem um papel para os inibidores de proteassoma como radiosensitizers, através do bloqueio de NF-kB expressão induzida de genes /RH FA (Fig. 6).

inibição do proteosoma pelo bortezomib ou

PSMA1

resultados knockdown num aumento da IκBα, que por sua vez diminui a NF-kB de ligação para os promotores de genes /RH FA incluindo

FANCD2

e

BRCA1. Isso reduz a disponibilidade destas proteínas de reparo do DNA para o recrutamento aos locais de danos no DNA, resultando em diminuição da formação de focos RAD51 e HR após a indução de DNA rupturas de filamentos duplos por radiação ionizante.

Combinação de proteassoma Inibição e Radiação melhora

controle do tumor

a seguir, procurou determinar se a inibição do proteassoma pode ser uma estratégia útil

in vivo

. Fraca penetração do bortezomib em tumores pode limitar a sua eficácia em doenças malignas sólidas [37]. Por isso, testamos se inducible

PSMA1

RNAi knockdown melhora o controle de xenoenxertos tratados com radioterapia fracionada (RT).

Para administrar fracionada RT, foi utilizada uma plataforma de pesquisa pequena radiação animais (SARRP) que pode entregar guiada por CT RT conformada para tumores em ratos [38], [39]. Esta plataforma garante um tratamento completo do tumor, minimizando irradiação de tecidos não envolvidos. É também facilitada avaliações volumétricas de crescimento do tumor e parcialmente correlacionados (r = 0,61) com medições de calibre (Fig. 7A-B).

10

6 células NCI-H460 transfectadas com doxiciclina induzível

PSMA1

shRNA foram injetadas nos flancos de ratinhos nus NCr com 6-8 semanas de idade. Uma vez que os tumores atingiram diâmetro de 3 mm (dia 0),

PSMA1

knockdown foi iniciada com água potável doxiciclina. Uma semana mais tarde, a RT foi iniciada para se obter um total de cinco fracções de 4 Gy cada dois dias utilizando uma plataforma de investigação pequena radiação animais (SARR). (A) imagens ortogonais de uma tomografia computadorizada (TC), obtida utilizando o SARRP, de um rato tendo um xenoenxerto subcutâneo. (B) A correlação das medições volumétricas tumorais usando o feixe SARRP cone de CT em comparação com pinças tradicionais. (C) do esquema de tratamento. (D) Os ratinhos foram subsequentemente seguidos até tumores atingiu 2 cm de diâmetro, os animais moribundos ou tornou-se durante 100 dias. (E) de Kaplan-Meier foram realizadas análises com testes de log-rank de pares para avaliar as diferenças na sobrevivência. Números de sobreviventes de 10 ratos por grupo no dia 100 são indicados entre parêntesis. Para RT vs. RT +

PSMA1

knockdown, log rank

P = 0,0003

.

Ratos foram implantados com células NCI-H460 abrigando um doxiciclina-inducible

PSMA1

construto shRNA. Uma semana após o início da

PSMA1

knockdown, os tumores foram irradiados com uma dose de 20 Gy em fracções de cinco. Após os tratamentos RT,

PSMA1

knockdown foi interrompido, e os ratos foram acompanhados por até 100 dias após a formação do tumor (Fig. 7C). ratos não tratados apresentaram rápido desenvolvimento de tumores. Ratos tratados com RT ou inducible

PSMA1

knockdown em células tumorais também mostraram crescimento tumoral progressivo e sobrevida. Os ratinhos tratados simultaneamente com ambos os tratamentos, porém, mostraram um mínimo ou nenhum crescimento de xenoenxerto e 100% de sobrevivência (Fig. 7D-E). formação de focos FANCD2 induzida por IR também foi reduzida em espécimes de tumor mostrando indutível

PSMA1

knockdown (Fig. 8A). A redução destes focos podem servir no futuro como um biomarcador para a redução da ativação induzida pelo IR da FA via /AR, na sequência da inibição do proteassoma. Um aumento significativo de focos γ-H2AX induzidos por IR em amostras de tumor persistiu em 1, 6 e 24 horas com

PSMA1

knockdown em relação ao controle, indicando atraso de reparação do ADN DSB. (Fig. 8B-C).

(A) FANCD2 imunofluorescência em 10 Gy irradiação não irradiados versus xenoenxertos de NCI-H460 recuperadas a partir de ratinhos com ou sem induzida pela doxiciclina

PSMA1

expressão no tumor shRNA células. Barra = 10 uM. (B) imunohistoquímica γ-H2AX em tumores de xenoenxerto de NCI-H460 com ou sem induzida pela doxiciclina

PSMA1

shRNA knockdown, recuperado a partir de ratinhos 1, 6 e 24 horas após a irradiação com 10 Gy. Barra = 10 uM. (C) Quantificação de imuno-histoquímica para γ-H2AX em (B). As células com ≥5 focos foram classificados como positivos (n 400 células). Todos os resultados são a média ± SEM. Os valores de P foram calculados utilizando um teste t de Student de duas caudas.

Os resultados dramáticos observados com

PSMA1

knockdown estão em contraste com os observados anteriormente com bortezomib

In vivo

, incluindo modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) de adenocarcinoma de pulmão [40]. Dados os resultados com

PSMA1

knockdown, a capacidade de bortezomib para radiossensibilizar xenoenxertos NCI-H460 foi examinada para determinar se pode haver maior efeito tumoricida com esta terapia de combinação. Não houve diferença significativa na sobrevivência de ratinhos tratados com radioterapia, com ou sem o bortezomib (Figura S5). Para determinar se isso foi devido à baixa penetração de drogas tumor, a atividade do proteassoma tipo quimotripsina foi examinada em tumores tratados com ou sem bortezomib em comparação com tumores com ou sem knockdown PSMA1. Não foi substancialmente mais inibição do proteosoma seguinte knockdown PSMA1 comparada com a seguinte bortezomib (Figura S6). Isto sugere que a limitada eficácia observada com bortezomib

in vivo

pode estar relacionada à má penetração da droga tumor, o que explicaria as discrepâncias nos resultados de

in vitro

e

in vivo

.

Discussão

O objetivo deste estudo foi estabelecer uma base racional para a inibição do proteosoma como uma estratégia para NSCLC radiossensibilização. Nós fundamentado que desde DNA double rupturas dos filamentos (LAP) se correlacionam com a citotoxicidade da radiação ionizante (IR) [26], os agentes que retardam a reparação dessas pausas podem agir como radiosensitizers. Assim, observou-se diminuição na recombinação homóloga (HR), após a inibição do proteosoma, atrasos significativos no DNA DSB reparar o

in vitro

e

in vivo, Comprar e níveis reduzidos de expressão e danos IR induzida localização local de proteínas de reparo do DNA. Os inibidores do proteassoma função, pelo menos em parte, por bloqueio da via de NF-kB através da interferência com a degradação de IκBα, que inibe a actividade de NF-kB a jusante [34], [35]. Bortezomib diminuiu a expressão induzida por IR com a inibição de proteassoma, da Anemia de Fanconi (FA) /genes BRCA, a maioria dos quais têm locais de ligação de NF-kB putativos [33]. Importante, nós salvamos radiossensibilidade induzida por bortezomibe silenciando IκBα, apoiando o mecanismo proposto. Os inibidores do proteassoma, por conseguinte, parece radiossensibilizar NSCLC, interferindo com a reparação de DSB de ADN por redução da expressão de genes-chave RH NF-kB-indutíveis.

Uma explicação alternativa para os efeitos de inibição de proteassoma em radiossensibilidade é através da indução da apoptose . Vários estudos têm demonstrado um aumento da apoptose após bortezomib tratamento [41]. A apoptose não foi mostrado como o modo predominante de morte celular em NSCLC irradiado. Por exemplo, doses elevadas, tais como 20 Gy de irradiação de A549 ou células NCI-H460 produzir taxas de apoptose de apenas 5-35% [42]. as células NCI-H460 tratadas com ambos 2 Gy IR e bortezomib mostraram um aumento da apoptose em comparação com qualquer dos tratamentos por si só. De nota, a persistência do DNA LAP após irradiação de células expostas a inibidores de proteassoma também pode-se contribuir para a apoptose.

Observamos redução crescimento de xenoenxertos NSCLC com a inibição do proteassoma combinado com RT. GEMMs de câncer de pulmão pode ser usado para confirmar o efeito em tumores primários de pulmão tratados

in situ

. Explorando isso de várias GEMMs pode ter a vantagem adicional de identificar genótipos que particularmente respondem a proteassoma inibição. Por exemplo, os tumores resultantes de ratos abrigar inducible

KRAS Comprar e

TP53

mutações responderam ao bortezomib, ao contrário de tumores de camundongos com mutante

KRAS Comprar e do tipo selvagem

TP53

[40]. Observamos diferenças marcantes na sobrevivência com knockdown proteassoma inducible em xenoenxertos NSCLC expressando tipo selvagem

TP53

, que está em contraste com estes resultados. Propomos que a combinação com radiação pode desbloquear o potencial de inibição de proteassoma a uma ampla gama de genótipos tumorais.

A adopção de inibidores de proteassoma na clínica vai exigir melhoria na prestação de tumor. Bortezomib rendeu relativamente pouca inibição do proteassoma em nossos estudos de xenotransplante em comparação com induzida pela doxiciclina

PSMA1

shRNA knockdown. Estratégias, incluindo encapsulamento liposomal, que tem sido empregada com sucesso para a doxorrubicina [43], ou a utilização de inibidores de proteassoma de segunda geração, tais como carfilzomib, marizomib ou MLN9708 [44] pode melhorar a penetração de tumores sólidos e inibição do proteassoma.

A resultados da inibição do proteosoma em pacientes com NSCLC tratados sem radioterapia têm sido mistos [16], [17]. A inibição do proteosoma foi examinado com quimioradioterapia concomitante no julgamento I uma fase de doze pacientes [45]. Neste estudo escalonamento de dose, os pacientes com doença de Fase III A-B patologicamente documentado recebeu carboplatina semanalmente e paclitaxel, em conjunto com o bortezomib 0,3-0,7 mg /m

2 duas vezes por semana, durante a radioterapia para uma dose de 61,2 Gy em 34 fracções diárias, seguido por ressecção cirúrgica. Não houve toxicidades agudas imprevistos durante chemoradiotherapy; Grau 2-3 mielossupressão era comum, como esperado com carboplatina e paclitaxel. Infelizmente no entanto, três dos nove pacientes que foram submetidos à ressecção cirúrgica morreram no pós-operatório; dois morreram dois a três dias de pós-operatório e um terceiro morreu 21 dias de pós-operatório. Concluiu-se que a toxicidade retardada era grave e imprevisível. No entanto, todos os três pacientes tinham sido submetidos a pneumonectomia direita após altas doses de quimioradioterapia neoadjuvante. pneumectomia direita após terapia neoadjuvante tem sido associada a aumento significativo do risco de mortalidade, independentemente da adição de novos agentes sistémicos. Por exemplo, houve uma taxa de mortalidade relatada 18% relacionados com o tratamento após pneumonectomia direita, em comparação com uma taxa de 4% após pneumonectomia esquerda, após a radioterapia neoadjuvante a uma dose média de 54 Gy com quimioterapia concomitante [46].

o que foi notável sobre o estudo de Fase I [45] foi a alta taxa de resposta patológica completa (pCR) observada em pacientes tratados com quimioradioterapia neoadjuvante incluindo bortezomib. Espécimes de cinco dos nove pacientes (56%) que se submeteram à ressecção cirúrgica mostrou uma PCR e mais dois mostraram 99% de necrose. Isso se compara favoravelmente com a taxa de pCR 17,7% observada em INT-0139 seguinte quimioradioterapia neoadjuvante entre os 164 pacientes que se submeteram à ressecção [47]. Estes dados sugerem que, com cuidado, a inibição do proteassoma pode valer a pena explorar ainda mais combinado com quimiorradioterapia radical, talvez em candidatos não-cirúrgicos ou para tumores do lado esquerdo ou outros que não irá exigir pneumonectomia direita para ressecção.

Finalmente, proteassoma inibidores podem desproporcionalmente beneficiar os pacientes cujos tumores dependem de reparação mediada por HR de LAP DNA induzidos pela radiação. Por exemplo, elevado nível de expressão da proteína RAD51 tem sido associada com a diminuição da sobrevivência de doentes com NSCLC [48]. Além disso, os tumores pouco diferenciados NSCLC aumentaram a expressão de genes de RH [49]. Em uma análise de dados de microarranjos publicados de 442 pacientes [9], altos níveis de

RAD51

e

BRCA1

foram, cada um associado com diminuição da sobrevida global (Figura S7). Esses recursos podem servir como biomarcadores preditivos de resposta a inibidores de proteassoma como radiosensitizers. Além disso, as reduções de DSB de ADN em focos proteína de reparação induzidas por radiação, incluindo FANCD2 e BRCA1, a seguir ao tratamento com inibidores de proteassoma, podem servir como biomarcadores para uma resposta em tumores tratados.

Materiais e Métodos

Reagentes

O bortezomib foi comprado de Selleck Chemicals (Houston, TX). estoques de 800 mM em DMSO foram armazenadas a -20 ° C, e antes da sua utilização foram diluídas e armazenado a 4 ° C durante até uma semana. Todos os tratamentos foram em uma concentração final de 30 nM para A549 ou 50 nM para NCI-H460, a menos que indicado de outra forma. Os anticorpos seguintes foram utilizados nas diluições listados para imunotransfer�cias ocidentais: PSMA1 (ARP40417, Sistemas Aviva Biologia, San Diego, CA, 1:2000), PSMB5 (BML-PW8895, Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nova Iorque, 1:1000), FANCD2 (SC-20022, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:200), vinculin (SC-25336, Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), anti-rato (NA931v, GE Healthcare UK United, Little Chalfont, Buckinghamshire , Reino Unido, 1:3000) e anti-coelho (NA934v, GE Healthcare Reino Unido, 1:3000) peroxidase de rábano ligada a anticorpos secundários. Os anticorpos seguintes foram utilizados nas diluições indicadas para imunofluorescência: BRCA1 (sc-6954, Santa Cruz Biotechnology, 01:50), RAD51 (PC-130, EMD Millipore, Billerica, MA, 1:1000), FANCD2 (SC-20022 https://array.nci.nih.gov/caarray/project/details.action?project.experiment.publicIdentifier=jacob-00182.