Abstract

Fundo

MicroRNA-21 é regulado para cima em uma variedade de cancros como, mama, colorretal, pulmão, cabeça e pescoço, etc No entanto, o regulamento de miR-21 no carcinoma de células renais (RCC) ainda não foi estudada de forma sistemática.

Métodos e resultados

Nós medidos miR-21 níveis em 54 pares de cânceres renais e seus tecidos normais pareados por em tempo real PCR. O nível de miR-21 expressão foi correlacionada com 5 a sobrevivência ano eo estágio patológico. Estudos funcionais foram realizados após inibir miR-21 em linhas celulares de RCC. Estudamos

in vitro

e

in vivo

efeitos da quimioterapia preventiva genisteína agente em miR-21 expressão. Em 48 casos (90%), o miR-21 foi aumentado. Todos os pacientes com baixa expressão de miR-21 sobreviveram 5 anos, enquanto que com elevada expressão de miR-21, apenas 50% sobreviveram. maior expressão de miR-21 está associada com um aumento na fase de cancro renal. Estudos funcionais após inibição da miARN-21 em linhas de células RCC mostram paragem do ciclo celular, a indução de apoptose e reduzidas capacidades invasivas e migratórias. A análise Western blot mostrou um aumento na expressão de genes p21 e p38 MAP quinase e de uma redução no ciclina E2. A genisteína inibiu a expressão de miR-21 em células A-498 e nos tumores formados após a injecção de genisteína tratada células A-498 em ratinhos nus além de inibir a formação de tumores.

Conclusões

O presente estudo mostra uma clara correlação entre a expressão de miR-21 e as características clínicas de câncer renal. Assim, acreditamos que o miR-21 pode ser utilizado como um marcador de tumor e a sua inibição pode provar ser útil no controlo de cancros com sobre-regulada miR-21

citação:. MS Zaman, Shahryari V, Deng L, Thamminana S, S Saini, Majid S, et al. (2012)-regulação de MicroRNA-21 se correlaciona com cancro do rim Lower Survival. PLoS ONE 7 (2): e31060. doi: 10.1371 /journal.pone.0031060

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebidas: 1 de novembro de 2011; Aceito: 01 de janeiro de 2012; Publicação: 08 de fevereiro de 2012

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Associação de Veteranos Mérito Review, Programa de Associação de Veteranos Research Award Enhancement e os Institutos Nacionais de Saúde Grant RO1CA130860 (ao capital investigador, Dr. R. Dahiya). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que desempenham papéis importantes em numerosos processos celulares, incluindo o desenvolvimento, proliferação e apoptose [1]. Desde miARNs estão envolvidos em processos celulares críticos, estudos recentes têm demonstrado que eles também estão envolvidos na patogénese de várias doenças, incluindo as do rim. assinaturas de miARN característicos para vários cancros epiteliais, incluindo da mama, pulmão, pancreático, gástrico e cancros renais, foram relatados [2], [3], [4], [5]. evidência histológica mostra que existem várias variantes do carcinoma de células renais maligno,

viz.

de células claras, papilares, chromophobe e coleta de carcinomas do duto [6], [7], [8], [9]. Vários estudos têm demonstrado a expressão diferencial de miARN nestas variantes de carcinoma de células renais [10], [11], [12]. MicroRNA-21 é regulado para cima em uma variedade de tipos de câncer, como de mama, colorretal, pulmão, cabeça e pescoço, etc. No entanto, o regulamento eo papel funcional do miR-21 no câncer de rim ainda não foi sistematicamente estudadas. Neste estudo, mediram os níveis de miR-21 em 54 pares de cancros nos rins humanos e seus tecidos normais pareados por PCR em tempo real. O nível de expressão de miR-21 foi correlacionado com a sobrevivência de 5 anos e fase dos pacientes. A fim de determinar o papel de miR-21 em carcinoma de células renais (RCC), ensaios funcionais, tais como ciclo celular, apoptose, invasão, migração e, foram feitas depois de derrubar o miR-21 expressão em células A-498. análise de software e análise de PCR de matriz mostrou um aumento na expressão de p21 e de p38 MAP quinases, após a inibição de miR-21 e a diminuição da expressão de ciclinas e quinases dependentes de ciclina. Estes resultados foram validados por análise de Western. Além disso, também avaliado o efeito de um agente de quimioprevenção dietético, a genisteína (um produto de soja), sobre a expressão de miR-21 em ratos tumores. A genisteína a expressão reduzida de miR-21 em ratinhos injectados com células de genisteína tratados em comparação com os controlos de veículo. Este é o primeiro estudo que mostra a correlação da expressão de miR-21 com os parâmetros clínicos e o seu papel funcional no CCR. Em conclusão,-regulada miR-21 no câncer de rim pode ser um marcador tumoral bom para diagnóstico de câncer de rim.

Resultados

miR-21 é de até regulamentada em amostras de tecido de carcinoma renal e câncer renal linhas celulares

Para entender a relevância clínica do miR-21 no câncer de rim medimos níveis de miR-21 em 54 pares de cancros do rim e seus tecidos normais pareados por PCR em tempo real. Em 48 casos (89%), o miR-21 foi encontrado para ser aumentada (T /N [Tumor /Normal] foi maior do que 1,2). Expressão de miR-21 também foi medido em linhas de células de cancro renal, A-498, Caki-1, Caki-2 e células normais HK-2. miR-21 de expressão em células A-498 foi cerca de 7,3 × a de células HK-2, enquanto que da Caki-1 foi de 1,6 ×, e Caki-2, 3 ×.

Correlação de miR-21 com expressão palco e sobrevivência no cancro renal

O nível de expressão de miR-21 correlacionada com sobrevida de 5 anos e estágio dos pacientes. Para os pacientes com baixo miR-21 expressão (Figura S1), todos sobreviveram 5 anos após a cirurgia, enquanto que para aqueles com elevada expressão de miR-21 (Figura S2), apenas 50% sobreviveram (Figura 1). A curva de sobrevivência foi baseada no número de pacientes (36) para o qual temos informações sobrevivência de um total de 54 pacientes. Em grupos de pacientes que têm baixa expressão de miR-21 (T /N 1,2), de expressão elevada (T /N = 1,2-10) e muito elevada expressão (T /N 10), a percentagem de aqueles em fase precoce (fase I) diminuiu em 80%, 51,5% e 37,5%, respectivamente. Isto implica que a expressão aumentada de miR-21 correlaciona-se com um aumento da fase de cancro renal. Esta informação foi baseada no número de pacientes para os quais tinham a informação fase (46 dos 54 pacientes). Não houve correlação entre o grau do tumor e os níveis de miRNA-21.

A expressão de miR-21 em diferentes formas de câncer de células renais

A expressão de miR-21 foi classificada como quer baixo (T /N 1,2), alta (T /N = 1,2-10) e muito alta (T /N 10). As diferentes formas de cancros em que foi analisada a expressão de miR-21 eram carcinoma de células claras, carcinoma papilar e carcinoma tubular. Fora de um total de 54 amostras, 45 foram amostras de carcinoma de células claras, 8 foram papilar e uma foi o carcinoma tubular. Em ambas as células claras (71,1%) e carcinoma papilar (75%) a maioria das amostras teve alta expressão de miR-21 (N /T = 1,2-10). 17,7% de carcinoma de células claras tiveram muito elevada expressão. A única amostra de carcinoma de células renais tubular tinha muito elevada expressão de miR-21.

papel funcional de miR-21 em células A-498

Para elucidar o papel funcional de miR-21 em cancro renal que inibiram a expressão de miR-21 em células a-498 de cancro renal com um inibidor de miR-21 disponíveis comercialmente. controlo anti-miR-negativa # 1 foi usado como controlo negativo padrão para estas experiências. O nível de miR-21 foi reduzida em mais de 99%, em comparação com o controlo negativo (Figura S3). No caso dos anti miR-21-transfecção em células Caki-2 o mesmo nível de redução de miR-21 de expressão foi observado (Figura S4).

Efeito sobre A-498 do ciclo celular e apoptose.

os efeitos da inibição do miR-21 sobre o ciclo celular e apoptose foram analisados ​​por citometria de fluxo. O ciclo celular mostraram um aumento significativo (9,1%) na fase G0 /G1, com uma redução concomitante (6,8%) na fase G2 /M, o que indica que a redução de miR-21 de expressão em células A-498 inibiu a célula crescimento e causou G0 /paragem em G1 (Figura 2A). Ensaio de apoptose utilizando citometria de fluxo mostrou um aumento marginal no número total de células apoptóticas (início apoptóticas mais apoptóticos) (5,17%) no miR-21 anti-miARN inibidor de células transfectadas como comparado com o controlo negativo (1,79%) e simulada ( 2,49%) (Figura 2b). No caso de células Caki-2 inibição de miR-21 resultou num aumento significativo na apoptose sem qualquer alteração no ciclo celular (dados não mostrados)

(a) Efeito sobre o ciclo celular:. A citometria de fluxo de análise do ciclo celular mostraram um aumento significativo na fase G0 /G1 fase (9,1%), com uma redução concomitante na fase G2 /M (6,8%), indicando que a redução forçada de miR-21 de expressão em células a-498 poderia inibir a célula crescimento e causa G0 /G1 prisão (valor p 0,010). (B) Efeito sobre a apoptose: Apoptose ensaio mostrou um aumento marginal no número total de células apoptóticas (5,17%) no miR-21 anti-miARN inibidor de células transfectadas como comparado com o controlo negativo (1,79%) e simulada (2,49% ) (valor p 0,017).

Efeito na invasão celular e migração propriedades.

Para determinar se miR-21 afeta a migração de células do cancro renal e invasão a migração de células cytoselect de 24 poços e foi utilizado kit de invasão. células A-498 foram transfectadas com o inibidor anti-miR-21 e o controlo anti-miR-negativa. Tanto a invasão de células A-498 e de migração foram diminuídas em comparação com o controlo negativo. Menos de absorvância foi observado a 560 nm com miR-21-anti células transfectadas do que o controlo negativo em ambos os ensaios de migração e invasão (figuras 3a e 3b). A inibição da expressão de miR-21 teve um efeito mais pronunciado sobre a invasão em relação à migração, (redução de 50% vs 25%). Efeitos similares foram observados no caso de células Caki-2 em ambos os ensaios de invasão e de migração (dados não mostrados)

(a) Efeito sobre a invasão de células:. as propriedades invasivas das células A-498 foram reduzidos após a inibição de miR-21 em comparação com o controlo negativo, as células marcadas a-498 (Ampliação-40 ×); Absorvância a 560 nm (valor p 0,026). (B) Efeito sobre a migração celular: propriedades migratórias de células A-498 foram também diminuiu após a inibição de miR-21, em comparação com o controlo negativo, as células marcadas A-498 (ampliação de 40 vezes); Absorvância a 560 nm (valor p 0,016).

miR-21 aumenta a expressão de ciclina CDKN1A inibidor da quinase dependente (p21).

Para ver o efeito de miR-21 expressão em diferentes genes envolvidos no ciclo celular e apoptose foi utilizado matrizes de PCR. Uma vez que nós vimos um efeito significativo no ciclo celular por inibição de miR-21 em células A-498, decidimos primeiro a utilizar matrizes de PCR relacionados com genes do ciclo celular. ciclo celular matrizes de PCR baseados mostraram alterações na expressão de um certo número de genes. Um dos genes regulados para cima na matriz de PCR após a inibição de miR-21 foi o inibidor de quinase dependente de ciclina, CDKN1A também conhecida como p21 Cip1 ou. Outras matrizes de PCR mostrou uma alteração na expressão da MAP-cinase p38 gene. Subsequentemente, verificou-se este resultado utilizando MAP quinase matrizes de PCR baseados e obtido o mesmo resultado (dados não mostrados). Ambos os resultados foram validados por Western blotting (Figura 4). experiências de transferência de Western mostram claramente a regulação de ambas p21 e p38 genes da cinase MAP com miR-21 de inibição em comparação com o controlo negativo. Nós também verificamos a expressão de outros genes relacionados com o ciclo celular e apoptose e encontrou downregulation da ciclina E2. Também olhou para a expressão do mRNA de quinase dependente de ciclina, CDK2, CDK4, CDKE1 e CDKE2 e encontrou a sua expressão a ser significativamente reduzido após a inibição de miR-21 (dados não mostrados). Em experimentos de Western blot que fez check-CDK4, E1 e E2 como CDK2 já é conhecido por ser afectada pelo gene p21 [13], [14]. Observou-se uma alteração na expressão da proteína por apenas CDKE2.

A expressão de p21, cinase p38MAP e ciclina E2 após a inibição de miR-21 em células A-498, em comparação com o controlo negativo. GAPDH foi usada como um controlo de normalização. p21 e p38 MAP quinase foram-se regulada, enquanto que a expressão E2 ciclina foi encontrado para ser regulada negativamente.

In vitro

e

In vivo

efeitos da genisteína sobre células de cancro renal

a genisteína reduz a expressão de miR-21 em tumores de ratos.

Como mencionado anteriormente, vamos checar o efeito de um agente de quimioprevenção, genistein (um produto de soja), na expressão de miR-21 em tumores nu do rato. Em primeiro lugar A-498 células de cancro renal foram tratados com 25 mM genisteína por 4 dias e após a extração de RNA miR-21 expressão foi verificada. Observou-se a expressão para uma redução de 30% nas células tratadas genisteína em comparação com as não tratadas (Figura 5A). Para ver o efeito do tratamento de genisteína em ratos tumores e células de expressão de miR-21 A-498 foram de novo tratados com a genisteína (25 ^ M) e após 96 horas de tratamento, foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. Foram utilizados dois conjuntos de três ratos cada. Nos tumores de controlo DMSO os três ratinhos desenvolveram tumores de tamanho significativamente grandes, cerca de 800 milímetros

3 em volume (Figura 5b, painel esquerdo), enquanto que com as células genisteína tratado um pequeno tamanho do tumor foi observada em um dos três ratos, com aproximadamente 25 mm

3 em volume (Figura 5B painel direito,). Nos outros dois ratinhos uma delas teve um pequeno tumor no local da injecção (Figura 5b painel direito), enquanto que o terceiro ratinho tinha nenhum tumor. Após a formação de tumores palpáveis ​​com células de controlo, que os tumores excisados ​​e medida a expressão de miR-21 subsequente à homogeneização do tumor com Qiazol e extracção de RNA. A expressão de miR-21 foi encontrado para ser reduzida por ~ 40% em amostras tratadas de genisteína em comparação com as não tratadas (dados não mostrados).

(a) Efeito de genisteína (25 ^ M) sobre a expressão de miR-21 em células a-498: expressão de miR-21 foi encontrado para ser reduzida por ~ 30% em genisteína tratada células a-498, em comparação com células não tratadas. (B)

In vivo

efeito da genisteína no tamanho do tumor em ratinhos nus:. A genisteína foi capaz de reduzir significativamente a formação de tumor (setas preto, painel da direita)

Discussão

no presente estudo nós fornecemos evidências de que a regulação de miR-21 no carcinoma renal está associada com baixa sobrevivência de pacientes com câncer renal. A expressão de miR-21 em ambas as linhas celulares de cancro do rim e amostras de tecido de cancro do rim humano verificou-se ser superior em comparação com o normal, o que está em conformidade com estudos anteriores sobre o carcinoma de células renais e também outros tipos de cancro [15]. O nosso estudo mostra, pela primeira vez que pacientes com uma maior expressão de miR-21 em cancro renal tem uma menor probabilidade de sobrevivência. Além disso, menor expressão de miR-21 leva a uma maior taxa de sobrevivência. Nós também se correlacionou a expressão de miR-21 com o estágio do câncer para os pacientes que tiveram informações completas sobre o palco (34/39). O nosso estudo mostrou que, a alta expressão de miR-21 em amostras de doentes conduziu a um aumento da fase da doença. Para elucidar a importância de miR-21 em ensaios funcionais carcinoma de células renais foram realizados. ensaios de viabilidade celular, demonstrou um efeito anti proliferativa em células A-498 após a inibição de miR-21. A alteração mais significativa foi observada no ciclo celular em que a fase G0 /G1 foi dramaticamente aumentada (9,1%) com uma redução concomitante na fase G2 /M (6,8%). Isso nos levou a procurar potenciais genes do ciclo celular afectadas pela inibição de miR-21 em células A-498. ciclo celular PCR experimentos matriz mostrou que CDKN1A (p21) foi-se regulada após a inibição de miR-21 em células A-498. Estudos anteriores utilizando microarrays sugerem que a expressão de p21 correlaciona-se positivamente com a supressão de genes que são importantes para a progressão do ciclo celular [16]. p21 responde a uma variedade de estímulos que promove a actividade de crescimento de inibição em função da sua capacidade para inibir a actividade de quinase dependente de ciclina, CDK2. Numerosos estudos têm relatado que o gene p21 tem funções adicionais na regulação do ciclo celular, que são independentes da CDK2. Alguns exemplos são a sua associação com o factor de transcrição E2F1 e a supressão da sua actividade de transcrição [17]. Além disso, a p21 também suprime a factores de transcrição STAT3 [18] e MYC [19]. Em adição a p21 também promove a inibição do ciclo celular através da mediação de repressão dependente de p53 de genes tais como cdc25C, CDC2, CCNB1 e BIRC5 também conhecido como survivina [20], [21], [22]. Apesar de a p21 suprime genes envolvidos na progressão do ciclo celular ele também inibe a apoptose [23]. Quando as células enfrentam insultos genotóxicos ou agentes de desestabilização de microtúbulos, p21 protege-los de apoptose como um ciclo celular activo é necessário para medir a estes agentes e desencadear a apoptose. Isto pode explicar o aumento não é tão dramático no número de células que sofrem apoptose após a inibição de miR-21 em células A-498, em comparação com alterações na progressão do ciclo celular Figura 2b. No entanto, o efeito de p21 é contrariado por vários mecanismos que envolve a comutação de paragem do ciclo celular de apoptose pela repressão da transcrição selectiva do p21, a activação selectiva de genes ou defeitos pró-apoptóticos em expressão de p21 a jusante de p53 [24], [25 ], [26]. Em certos casos, a p21 também promove a apoptose através de ambos os mecanismos de p53-dependentes e independentes sob stress celular, mas o mecanismo de acção é ainda desconhecido [27]. Assim nós tentamos ver se p21 era um alvo direto de miR-21 utilizando o ensaio de luciferase 3 ‘, mas não conseguimos encontrar uma interação direta. Assim, verificamos a expressão da proteína de quinases dependentes da ciclina diferente CDK4, E1 e E2 e poderia encontrar uma diferença em apenas cyclinE2 (Figura 4).

A genisteína, um dos principais isoflavonas de soja, tem uma grande variedade de quimiopreventivo ações. Os efeitos anti-cancerígenos da genisteína têm sido atribuídas a várias vias de sinalização e os mecanismos que afectam a detenção do ciclo celular, apoptose, invasão, metástase e angiogénese, os atributos que poderia potencialmente prevenir a iniciação e progressão tumoral [28], [29]. A genisteína (40,5,7- trihydroxyflavone) é abundante em produtos de soja e tem sido identificada como um inibidor de tirosina-quinases de proteína e, assim, podem desempenhar um papel-chave no crescimento celular e apoptose [30], [31]. Tem sido relatado que têm propriedades estrogénicas e anti-neoplásica actividade em vários tipos de tumores [32]. Ele também foi encontrada para ter efeitos epigenética na próstata do rato [33]. Em um estudo anterior Hillman

et. ai.

têm mostrado que a combinação de genisteína com atos primários de irradiação do tumor mais eficazmente como uma abordagem terapêutica, em tumores estabelecidos nos rins, devido ao crescimento do tumor a ser inibida em ambos os locais primários e metastáticos. Em seu estudo genisteína sozinho demonstrou uma tendência a estimular o crescimento de tumor renal primária e aumentar a metástase [34]. Em nosso estudo, ter uma abordagem mais simples e têm demonstrado que células A-498 tratadas com genisteína apenas tumores reduzidos formados em comparação com controlos de veículo.

miRNAs regulam a expressão do gene, visando genes contendo seqüências de mRNA complementares [35]. Muitas vias celulares são afetadas pela função reguladora dos miRNAs e o mais proeminente destas vias controlar os processos de desenvolvimento e oncogênicos [36]. miR-21 foi um dos primeiros miARNs detectados no genoma humano [37] e foi encontrado para ser sobre-expresso em uma variedade de tipos de cancro [38]. Existem alguns estudos que documentam a relevância funcional de miR-21, mostrando a relação de causa e efeito entre miR-21 e transformação neoplásica. Estes estudos têm sido feitos sobre glioblastoma [39], o cancro da mama [40], carcinoma hepatocelular [41], o cancro colorectal [42] e em células de mieloma [43]. Um relatório recente sobre o papel de miR-21 no câncer renal mostra que modula a apoptose através da segmentação vários genes por Zhang

et.al [44]. No entanto até agora não há dados que relaciona correlação clínica de expressão de miR-21 com o palco e sobrevivência de pacientes com câncer renal. Além disso, mostramos o papel preventivo quimio da genisteína na inibição da formação de tumores

in vivo

diminuindo miR-21 expressão em tumores de ratos. Em conclusão, este é o primeiro relatório de correlacionar miR-21 níveis, com sobrevivência e estágio de pacientes com câncer renal e documenta o papel oncogênico de miR-21 através de várias vias celulares.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

formalina-fixo, (FFPE) amostras de cancro renal embebidos em parafina foram obtidos a partir dos Assuntos de Veteranos de São Francisco (VA) Medical Center. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê de UCSF em Pesquisa com Seres Humanos (Número de aprovação: H9058-35751-01). Todos os cuidados com os animais foi de acordo com as orientações do Centro Médico San Francisco Veterans Affairs e o estudo foi aprovado pelo San Francisco VA IACUC (número de protocolo: 08-003-01).

linhas de células e cultura de células

linhas celulares de cancro renais humanas a-498, Caki-1, Caki-2, e a linha celular renal normal HK-2 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As linhas celulares foram verificados por ATCC através do DNA (STR) de perfis. células HK-2 renal normal foram cultivadas como uma monocamada em queratinócitos isento de soro médio (K-SFM) complementado com 0,05 mg /ml de extracto de pituitária de bovino (BPE), 5 ng /ml de factor de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, EUA), 50 mg /ml de penicilina e 50 mg /mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A linha celular de cancro renal A-498 foi cultivada como uma monocamada em Meio Essencial Mínimo de Eagle, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, EUA). Caki-1 e Caki-2 foram cultivadas da mesma forma em meios McCoy’s5A (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, EUA). Todas as linhas celulares foram mantidas numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2 a 37 ° C. Um subconfluentes-498cells (60-70% confluentes) foram tratados com genisteína (25 ^ M). A genisteína (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, EUA) foi dissolvido em DMSO, e as células tratadas apenas com veículo (DMSO) serviu como controlo. genisteína fresco todos os dias foi administrada juntamente com uma mudança de meio, e as células foram incubadas durante 4 dias.

Quantitative real-time PCR

O ADNc da primeira cadeia foi preparado a partir de ARN total (1 ug) utilizando um sistema de transcrição inversa (Promega, Madison, WI, EUA). O RNA total foi extraído usando um kit RNeasy da Qiagen mini-(Valencia, CA, EUA). Para tempo real de reacção em cadeia da polimerase (PCR), de ADN complementar foi amplificado com Inventoried Ensaio de Gene produtos contendo dois iniciadores específicos do gene e uma sonda MGB TaqMan (6-FAM-corante marcado) usando um Master Mix rápida de PCR TaqMan Universal num 7500 rápido real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). condições de ciclos térmicos incluídos 95 ° C durante 20 segundos (s), 40 ciclos de 95 ° C durante 3 s e 60 ° C durante 30 s de acordo com o protocolo rápido Universal PCR TaqMan. GAPDH foi usada como um controle endógeno. Para experimentos de miARN em tempo real da cadeia de ADNc foi sintetizado utilizando o kit Applied Biosystems Taqman MicroRNA transcrição reversa, com 200 ng do total extraído miARN. RNU48 foi usado como um controle endógeno. Em tempo real experiências de PCR, onde miARNs foram isoladas a partir de amostras renais fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), let7-F foi usado como um controle endógeno. MiARN total foi extraído de amostras de FFPE usando um kit Qiagen de miARN FFPE.

matrizes de PCR por meio de PCR em tempo real

Para estudar o perfil de genes envolvidos em várias vias celulares expressão, específica via-

matrizes de PCR (array ciclo celular, apoptose de matriz, uma matriz de MAP-cinase, SABioscience) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram analisados ​​com o software do fabricante.

Micro dissecção de tecidos de câncer renal e extração de RNA de FFPE amostras de tumor renal humana

tecidos renais normais e cancerosas adjacentes foram obtidos a partir de 39 representativos blocos de tecido FFPE de peças de nefrectomia radical do Departamento de Patologia dos Assuntos de Veteranos (VA) Centro Médico de San Francisco. Os blocos eram de pacientes com câncer renal que foram operados no Centro Médico VA entre 1980-2009. Seções (4 mm) dos blocos foram preparados, H E manchado, e lâminas foram revisadas por um patologista placa certificada para marcar as áreas normais e cancerosas. Subsequentemente, 12 uM lâminas foram feitos a partir dos blocos e microdissecação foi realizada utilizando o marcado com H E lâminas coradas como um modelo. extração MicroRNA foi feito usando um kit de extração Qiagen FFPE miRNA. Os níveis de miR-21 foram avaliadas pelo ensaio TaqMan miR como descrito acima. Seguindo PCR, relativos miR-21 níveis de expressão em regiões cancerosas foram normalizados com os seus homólogos normais adjacentes.

transfecção celular

células A498 e Caki-2 foram transitoriamente transfectadas com um inibidor da miRNA- 21 ou anti-miR controlo negativo # 1 (a partir de Ambion, Austin, TX, EUA), utilizando X-tremeGENE siARN reagente de transfecção (Roche Diagnostics Indianapolis, IN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células foram semeadas em placas de 6 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca), 24 h antes da transfecção e foram transfectadas transitoriamente a uma confluência de 40-50%. transfecção simulada, com o reagente de transfecção, também foi utilizado como um controlo. A mistura de transfecção foi dissolvido em meios isentos de soro de Opti-MEM (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, EUA) e no momento da transfecção as células foram semeadas em meio (facilidade de cultura celular UCSF) de Eagle Mínimo Essencial, com 10% FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, EUA) e sem antibióticos. No dia seguinte o meio foi mudado para meio mínimo essencial de Eagle contendo ambos 1% de FBS e antibióticos (penicilina-estreptomicina, 100 ×, UCSF Cultura celular Facility). As células foram sedimentadas, após 72 h de transfecção para citometria de fluxo, RNA e extração de proteínas.

análise do ciclo celular

análise do ciclo celular foi realizada 72 h após a transfecção. As células foram colhidas, lavadas com PBS frio, UCSF Cell Culture Facility, e ressuspensas no corante nuclear 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA). As células coradas foram imediatamente analisados ​​com um citômetro de fluxo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

A apoptose ensaio

Para apoptose, as células em 72 h após a transfecção foram dupla manchadas com o corante de viabilidade 7 amino-actinomicina D e anexina V-FITC utilizando um kit de anexina V-FITC /7-amino-actinomicina D (Beckman Coulter) de acordo com o protocolo do fabricante. As células coradas foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

ensaios de migração e invasão

A cytoselect migração e invasão celular kit de ensaio de 24 poços (Cell Biolabs, Inc ., San Diego, CA) foi usado para ensaios de migração e invasão às 72 horas após a transfecção (8 uM, formato colorimétrico) de acordo com o protocolo do fabricante.

análise de Western

extractos Whole-cell foram preparadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA; Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA; 50 mmol L-1 de Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 de NaCl, 0,5% de desoxicolato, 0,1% SDS e 1,0% de NP-40) contendo um cocktail inibidor da protease (Roche, Basileia, Suíça). Os ensaios de proteína foram realizadas utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína total (40 ug) foi submetido a electroforese em 12% de gel SDS-PAGE e transferência de Western foi efectuada utilizando protocolos convencionais e detectados por quimioluminescência. Todos os anticorpos, que incluíram p21 (cat. No. 2552), p38 MAPkinase (cat. No. 9212) e cyclinE2 (cat. No. 4132) foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA, EUA), ao passo que de GAPDH (cat. não. sc-32233) foi de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

tratamento genisteína de células a-498 e injecção sub-cutânea em ratinhos nus

Como mencionado acima, a -498 células foram tratadas com 25? M de genisteína durante 96 horas. células de DMSO (veículo) tratadas serviu como controlo. Após 96 horas as células foram sedimentadas e ~ 2 milhões de células foram injectadas subcutaneamente (100 ul) no flanco direito de ratinhos nus (de 4 a 5 semanas de idade; Charles River Laboratories). Dois conjuntos de ratos, com três ratinhos cada, foram usados ​​para esta experiência. Um conjunto representavam os comandos do veículo (DMSO) e as outras células genisteína tratada. Tumores de controle e células genisteína tratados foram excisadas após 8 semanas quando os ratos controle tratados DMSO desenvolveram tumores aproximadamente 800 milímetros

3 em volume (comprimento de 16 mm em largura 10 mm). O ARN total foi extraído por homogeneização dos tumores em Qiazol e extracção de ARN usando o protocolo do fabricante (Qiagen). Expressão de miR-21 foi medida por PCR em tempo real.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando StatView versão 5.0 para Windows. teste t de Student foi utilizado para comparar os diferentes grupos. valores de p 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos

informação de apoio

Figura S1..

miR-21 níveis em pacientes com baixa expressão ( 1,2): Os baixos níveis de miR-21 em pacientes com sobrevivência de 100%

doi: 10.1371 /journal.pone.0031060.s001

(TIF. )

Figura S2.

miR-21 níveis em pacientes com alta expressão ( 1,2): Altos níveis de miR-21 em pacientes com sobrevida de 50%

doi: 10.1371 /journal.pone.0031060.s002

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Figura S3.

Os níveis de expressão de miR-21 após knockdown em células A-498: O nível de miR-21 foi reduzida em mais de 99% (1,0-0,030), em comparação com o controlo negativo

doi:. 10.1371 /Journal .pone.0031060.s003

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Figura S4.

Os níveis de expressão de miR-21 após knockdown nas células Caki-2: O nível de miR-21 foi reduzida em mais de 99% (1,0 a 0,011), em comparação com o controlo negativo

doi:. 10.1371 /Journal .pone.0031060.s004

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Reconhecimentos

Agradecemos Dr Roger Erickson para apoio e assistência com a preparação do artigo.