Abstract

genes de desenvolvimento são silenciadas nas células estaminais embrionárias por uma marca de cromatina bivalente baseada histona. Tem sido proposto que esta marca também confere uma predisposição para hipermetilação aberrante do promotor de ADN de genes supressores de tumor (ETG) no cancro. Relatamos aqui que o silenciamento de uma proporção significativa desses ETG em células-tronco embrionárias e adultas humanos está associada a hipermetilação DNA promotor. Os nossos resultados indicam um papel para a metilação do DNA no controlo da expressão de genes em células estaminais humanas e sugerem que, para os genes reprimidos por hipermetilação do promotor em células estaminais

in vivo

, o processo aberrante em cancro pode ser entendido como um defeito no estabelecimento de um promotor não metilado durante a diferenciação, e não como um processo anômalo do

de novo

hipermetilação

Citation:. Calvanese V, Horrillo a, Hmadcha a, Suarez-Álvarez B, Fernandez AF , Lara E, et al. Genes (2008) Cancer hypermethylated em células estaminais embrionárias humanas. PLoS ONE 3 (9): e3294. doi: 10.1371 /journal.pone.0003294

editor: Maarten M. S. van Lohuizen, Holanda Cancer Institute, Holanda

Recebido: 30 de abril de 2008; Aceito: 01 de setembro de 2008; Publicado: September 29, 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Calvanese et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado principalmente pela União Europeia (LSHG-CT-2006-018739; ESTOOLS). QFP é financiado pelo Ramon Programa Cajal e do Departamento de Saúde do Governo espanhol (PI061267). O grupo Cancer Epigenética na CNIO é apoiada pela Saúde (FIS01-04) e Educação e da Ciência (I + D + I MCYT08-03, FU2004-02073 /BMC e Consolider MEC09-05) Departamentos do Governo espanhol, o Europeu Grant TRANSFOG LSHC-CT-2004-503438, ea Associação Espanhola Contra o Câncer (AECC). VC é um beneficiário de uma bolsa do Programa de Investigação Espanhol FPU. CLL e BSA são suportados pelo Ministério da Saúde do Governo espanhol (PI051707). O BACM é apoiada pela Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (0029 e 0030/2006 para PM) e, o Ministério espanhol da Saúde para PM (FIS PI070026). CB é apoiado pela Fundação Internacional Jose Carreras contra a Leucemia (EDThomas-05) eo ISCIII (FIS 3 + 3 contrato). O Instituto de Reconstructive Neurobiology recebeu financiamento adicional do DFG e da Fundação Hertie. BS, ABH e Anh são suportados pela Fundação Progreso y Salud e Instituto de Salud Carlos III-Red Española de Terapia Celular (RD06 /0010/0025). PWA, NH e HDM também são suportados pelo MRC

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

No curso do desenvolvimento embrionário. , as células são inicialmente totipotente mas, após algumas divisões, começam a perder a potência e são transformados em células pluripotentes, finalmente tornar-se terminalmente diferenciadas, células somáticas. A progressiva perda de potência durante a diferenciação tem implicações fundamentais para a doença porque a recuperação de pluripotência através de reprogramação nuclear é um dos principais desafios na medicina regenerativa [1], e porque a interrupção do processo de desenvolvimento que dá origem a uma célula somática terminalmente diferenciadas a partir da sua célula progenitora correspondente pode resultar na transformação maligna [2].

diferenciação de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) requer a repressão de factores de transcrição envolvidos na manutenção da pluripotência e a activação de genes de desenvolvimento. Ambos os processos são dirigidos por mecanismos epigenéticos específicos. Um exemplo do primeiro tipo é a repressão dependente da hipermetilação do promotor de genes de manutenção da pluripotência tais como NANOG e OCT4 como células estaminais diferenciar [3]. Até agora, a activação de genes de desenvolvimento durante a diferenciação de células estaminais após a metilação do DNA tem sido menos bem estudado. Em vez disso, esses genes de desenvolvimento têm sido relatados como estando em um estado reprimido durante os estágios iniciais de desenvolvimento, devido ao estabelecimento de um padrão específico de modificação das histonas, denominado “bivalente domínios”, que consiste em grandes regiões do H3 lisina 27 metilação abrigando regiões menores de H3 lisina 4 metilação [4]. Este estado da cromatina-repressor é mediado pelo grupo Polycomb de proteínas [5], [6] e é pensado para predispor a hipermetilação do promotor aberrante em cancro [7] – [9]. A constatação de que o tratamento de hESCs com a droga demetilante 5′-Aza-2′-desoxicitidina provoca diferenciação cardíaca e reativação do gene [10] nos levou a considerar se a metilação do DNA promotor poderia contribuir para o estabelecimento e manutenção da repressão específica do gene em hESCs . Para demonstrar a sua existência e sua suposta relação com a hipermetilação do promotor aberrante em câncer, comparou o padrão de metilação do DNA promotor de um painel de 800 genes relacionados ao câncer entre hESCs e diferentes tipos de tecidos adultos terminalmente diferenciadas e linhas celulares de cancro.

resultados

DNA metilação do promotor de perfis em hESCs, tecidos diferenciados normais e amostras de câncer

Nós usamos Illumina Goldengate metilação Arrays © para comparar o estado de metilação do DNA de 1.505 sequências (de 807 genes) em oito isolados independentemente hESCs linhas, 21 tecidos normais humanos primários (NPTs) correspondentes a seis tipos normais de tecido (NTTS) e 21 linhas celulares de cancro humano (CCLS) (ver Métodos). Os genes incluídos nas matrizes de metilação foram escolhidos com base na sua importância para o comportamento celular e diferenciação e incluiu genes previamente relatados para ser diferencialmente metilada, bem como supressores do tumor genes, os oncogenes e os genes que codificam para factores envolvidos no ciclo celular ponto de verificação [ ,,,0],11]. Em primeiro lugar, selecionou os genes autossômicos (766) a partir das matrizes de modo a excluir de metilação do DNA-dependente cromossomo X inativado genes. Como relatado anteriormente, o agrupamento não supervisionado das amostras utilizando exclusivamente os sinais de metilação dos genes autossômicos (1.421 seqüências) contidos nas matrizes possibilitou a classificação correcta de cada amostra dentro de seu grupo correspondente (hESC, NPT, ou CCL) (Figura 1A, e veja a Figura S1 nos dados suplementares on-line para este artigo), confirmando assim que cada grupo de amostras tem uma assinatura de metilação do DNA específica [11]. Em seguida, tentou classificar os genes na matriz em relação ao seu estado de metilação nos três tipos de amostra analisada (hESC, CCL, e NPT) (Figura 1A e Tabelas 1 e S1). Descobrimos que 65,31% (928 /1.421) das sequências não eram frequentemente hipermetilado em hESCs (array signal≤0.7 in≥25% (2/8) das amostras) e que metade deles (464/928) eram frequentemente hipermetilado em CCLs (sinal de matriz de 0,7 in≥25% (21/06) das amostras). A vasta maioria destas sequências (99,78%, 463/464) foram não metilado, em pelo menos um dos NTTS analisar (sinal matriz de 0,3 in≥1 /6 NTTS). Este resultado é consistente com a visão de que genes aberrante hipermetilado no câncer (ou seja, não hipermetilado em tecidos normais) não são hipermetilado em hESCs [8]. Chamamos esse grupo de genes Classe clássica um câncer hipermetilado genes (Tabelas 1 e S1).

(A) perfis de metilação de Classe AI (350), A-II (94), BI (20), e B-II (107) genes em hESCs (8), normais (21), e do cancro (21) amostras obtidas por matrizes Illumina. Os níveis de metilação variar de totalmente metilado (vermelho) para totalmente não metilado (branco). As colunas da direita mostram o estado de metilação de histonas H3 e ocupação Polycomb dos mesmos genes obtidos a partir de dados publicados anteriormente [5], [12], [16]. Azul, metilação em K4 e K27; laranja, metilação na sozinho K4; verde, não metilação no K4 ou K27; preto, presença da proteína SUZ12 Polycomb. (B) O enriquecimento do SUZ12 proteína Polycomb, a assinatura cromatina bivalente (K4 /K27) ou a ausência de ambas as marcas (nenhum) em genes de Classe A e Classe B (painel superior) e Classe I e Classe II genes (painel inferior) .

Significativamente, verificou-se que 34,69% (493 /1.421) das sequências foram frequentemente hipermetilado em hESCs (sinal de matriz 0,7 in≥25% (2/8) das amostras ). A maioria destes (79,72%, 393/493) também foram frequentemente hipermetilado em CCLs (sinal matriz 0,7 in≥25% (6/21)) das amostras). Novamente, muitos deles (32,32%, 127/393) foram não metilado, em pelo menos um dos NTTS analisar (sinal matriz de 0,3% in≥17 (1/6) NTTS) (Figura 1, e Quadros 1 e S1). Em contraste com a classe um câncer hipermetilado genes, os deste grupo também foram frequentemente hipermetilado em hESCs, por isso propomos que eles podem ser considerados membros de uma categoria diferente de genes do cancro metilado, que nós chamamos de genes do câncer Classe B hypermethylated. Dos 697 sequências frequentemente hypermethylated no cancro e não metiladas em pelo menos um dos NTTS analisados, 444 (66,70%) e 127 (18,22%) foram respectivamente classificados como genes de Classe A e Classe B (Figura 1, e as Tabelas 1 e S1) , o que indica, ao contrário das expectativas, que uma proporção substancial (cerca de 20%) de genes do cancro metilado também são frequentemente hipermetilado em hESCs.

Curiosamente, nem todos os genes frequentemente hipermetilado em CCLs eram completamente não metilada em todo o NTTS analisados ​​(Figura 1 e Tabelas 1 e S1). A frequência da hipermetilação em tecidos normais é apenas uma importância moderada para os genes da Classe A do câncer clássica metilados, como a maioria deles (78,83%; 350/444 sequências) são não metilado em NPTs. Por outro lado, apenas 20 sequências correspondentes aos genes da Classe B foram não metilado em todo o NTTS analisadas (Tabela 1). Quando um gene é metilada em algumas mas não em todos os tecidos normais, a metilação é provavelmente envolvidos na especificação de um tipo de tecido durante o desenvolvimento [12]. Quando o gene não é hipermetilado em hESCs, metilação selectiva do tecido dependente do tipo-deve ocorrer. Em contraste, quando o gene é frequentemente hipermetilado em hESCs, ele torna-se selectivamente mais provavelmente desmetilado na diferenciação como um mecanismo epigenético que é capaz de facilitar a especificação de tecidos. Por outro lado, quando um gene não metilado é em todas as células diferenciadas normais e hipermetilado em células estaminais, a perda de metilação do promotor que ocorre necessariamente durante a diferenciação é mais provável de estar envolvido nos processos de diferenciação precoce do que na especificação de tecidos [12]. Assim, definiu-se duas novas subcategorias para ambos os cancerosas metilado genes de Classe A e B: Sub-I, para genes que são sempre não metilado, em tecidos normais, e subcategoria II, para genes que são, por vezes, metilados em tecidos normais (Figura 1, e Quadros 1 e S1). A percentagem de genes de Classe B-II Classe A-II e é bastante semelhante (7,53% e 6,61%) (Tabela 1). No entanto, a percentagem de genes da classe A-I (24,63%) é muito maior do que na classe B-I (1,41%). Os genes nestas quatro categorias (A-I, A-II, B-I, B-II e) representa 58,2% de todas as sequências presentes nas matrizes de metilação. Ao considerar o estado de metilação dos três grupos de amostras (hESCs, NPTs e CCLs) fomos capazes de agrupar a maioria dos genes restantes na matriz em oito categorias adicionais (Tabela 1), que incluíam, por exemplo, duas categorias de genes que definimos como sendo constitutivamente metilado (metilada em hESCs, CCLs, e todos os NTTS; 11,19%) ou de forma constitutiva não metilado (não metilado em hESCs, CCLs, e todos os NTTS; 28,43%) de genes, respectivamente. Propomos, portanto, que a metilação do DNA não é importante para a regulação dos genes nessas categorias. A classificação de genes de acordo com o seu estado de metilação em hESCs, CCLs, e NTTS, e a interpretação do papel biológico da metilação do DNA dos genes em cada grupo está resumida na Tabela 1. Tabela S1 lista os genes em cada grupo.

é importante notar aqui que todas as percentagens anteriormente descritos referem-se aos 807 genes incluídos em matrizes de metilação, enquanto que a percentagem global de genes em cada grupo pode ser diferente, se a totalidade do genoma foram consideradas. O limiar de classificação que empregue para identificar genes frequentemente hipermetilado em hESCs (mais de 70% de promotor de CpG metilação em mais de 25% das amostras analisadas) é aquela que é vulgarmente utilizado para definir um gene como sendo frequentemente hipermetilado em cancro [13] . Para avaliar se as nossas observações são verdadeiras para limiares de classificação adstringentes que reexaminados os nossos dados em busca de: i) sequências hypermethylated na maioria dos hESCs analisados ​​(sinal matriz 0,7 in≥75% (6/8) da hESCs) e, ii ) sequências de “totalmente metiladas” em alguns dos hESCs analisados ​​(sinal matriz 0,8) in≥25% (2/8) do hESCs) (Tabela S2). Descobrimos que 5 BI e 84 sequências B-II montado o primeiro critério, e 13 BI e 86 sequências B-II equipado o segundo (Tabela S2), que indica que as nossas conclusões permanecem válidas, mesmo com esses limiares de classificação mais rigorosas.

foi recentemente demonstrado que prolongada

in vitro

cultura de hESCs está associada com instabilidade de metilação de ADN [14], [15]. Para avaliar se a hipermetilação do promotor de nossos genes da Classe B está associado com o

in vitro

processo de cultura, comparamos nossos dados com os publicados anteriormente por Bibikova

et al.

[11]. Esses autores utilizaram a plataforma de metilação Goldengate para comparar o estado de metilação dos 1505 sítios CpG contidos nas matrizes em dez linhas de células estaminais embrionárias humanas em passagens baixas e altas. Eles descobriram que, embora as alterações de metilação ocorreu com número de passagens, tais mudanças foram pequenas em comparação com as diferenças entre os tipos de células. Eles encontraram cinco genes (

ASCL2

,

GALR1

,

MEST

,

NPY,

e

SLC5A8) a ser consistentemente hipermetilado com o número de passagem (aumento do nível de metilação 0,34 em pelo menos duas linhas de células (20%)). Três desses genes (

ASCL2

,

NPY,

e

SLC5A8

) são membros da Classe B-I, mas, curiosamente, nenhum era um gene Classe B-II. Estes resultados sugerem que prolongou

in vitro

cultura era responsável apenas pela hipermetilação do promotor de uma pequena fração (3/97, 3%) dos nossos genes da Classe B, e que o efeito parece ser maior na classe BI genes.

Tal como referido anteriormente, foi recentemente proposto que o genes de desenvolvimento são silenciados em células estaminais embrionárias por uma marca de cromatina Polycomb-dependente bivalente à base de histona [4], [5], que é pensado para predispor a hipermetilação aberrante do promotor de ADN de ETG no cancro [7] – [9]. Como descobrimos que um subconjunto de genes do cancro metilado também pode ser metilado em hESCs queríamos investigar a relação entre a hipermetilação do promotor e do padrão de modificação da histona Polycomb dependente em hESCs. Para este efeito, comparou-se os dados de metilação para a de Classe AI, A-II, BI, e os genes B-II com o perfil modificação histona relatado anteriormente e ocupação Polycomb dos mesmos genes em células estaminais embrionárias [5], [12] , [16] (Figura 1 e Tabela S3). Consistente com um relatório anterior [9], descobrimos que cerca de 35% das sequências frequentemente hypermethylated no cancro e não metiladas em pelo menos um dos NTTS analisados ​​continham marcas de cromatina-repressiva em seus promotores (228-277 /697 abrigavam meK27 e 236/697 continha SUZ12). Curiosamente, comparando os dados de metilação com aqueles de Mikkelsen

et ai.

[16] observou-se que a grande maioria (96,4%) de genes que albergam meK27 também continha meK4 e que apenas cerca de 30% dos genes frequentemente hipermetilado no câncer apresentou o domínio cromatina bivalente (meK4 /meK27) em hESCs (Tabela S3).

Quando comparamos os padrões de cromatina e ocupação Polycomb na Classe AI, a-II, BI, e genes B-II descobrimos que cada grupo tem uma assinatura cromatina específico (p 0,00001). genes de classe A foram mais enriquecido em Polycomb e marcas bivalentes (47,5% e 45,5-57,3% de genes, respectivamente) do que os genes da classe B (19,7% e 21,4-32,7%, respectivamente) (P 0,00001) (Figura 1B e Tabela S4 ). O enriquecimento da marca bivalente em genes de Classe A é principalmente devido aos baixos níveis de esta assinatura cromatina em genes Classe B-II (Tabela S4). De facto, os genes de Classe B-I exibem níveis semelhantes de meK4 /meK27 aos genes da Classe A (Tabela S4) (p 0,00001). Curiosamente, os genes da classe II, foram muito menos frequentemente ocupadas por proteínas Polycomb e exibiram menos marcas bivalentes (33,3% e 26,5-38,8% de genes, respectivamente) (P 0,00001) do que os genes de Classe I (45,7% e 47,6-59,3 %, respectivamente), (Figura 1B e Tabela S4). Os níveis mais baixos da marca bivalente da classe genes II foram principalmente devido aos baixos níveis de esta assinatura cromatina em genes Classe B-II (Tabela S4). Na verdade, os genes da Classe A-II tinham níveis semelhantes de meK4 /meK27 aos dos genes classe I (Tabela S4) (p 0,00001).

ETG reprimidos pela hipermetilação do promotor em hESCs

Para testar as hipóteses formuladas a partir dos dados obtidos a partir das matrizes de metilação, colocamos nossa atenção em quatro genes da classe B (com frequência hypermethylated no cancro e hESCs) que foram previamente amplamente relatados para ser genes com propriedades supressores de tumores e que são frequentemente hypermethylated no câncer. Foram selecionados dois (MGMT e SLC5A8) [17], [18] a partir do subcategoria Classe BI (não metiladas em todos NTTS) e dois (PYCARD e RUNX3) [19], [20] a partir da Classe B-II (não metilado num número de NTTS). Em primeiro lugar, empregue a sequenciação de bissulfito de vários clones para determinar com precisão o estado de metilação de ADN promotor destes genes em hESCs e tecidos normais (Figura 2A, e as Figuras S2, S3, S4, S5). Em todos os casos, os dados de sequenciação de bissulfito corroboraram os resultados obtidos a partir das matrizes e mostrou que a hipermetilação observada em hESCs afectada a maioria dos CpGs que rodeiam o local de início da transcrição, dos genes seleccionados. MGMT e SLC5A8 (Classe IB) apresentou hipermetilação do promotor denso em hESCs mas não em tecidos diferenciados normais (Figura 2A, e as Figuras S2, S3), enquanto genes Classe B-II foram frequentemente hipermetilado em hESCs e às vezes em tecidos normais (Figuras S4, S5 ). Para compreender melhor o papel de hipermetilação do promotor de ETG nossos seleccionados em hESCs e NTTS, utilizou-Q-RT-PCR para medir a sua expressão em ambos os grupos de amostras (Figura 2B, e as Figuras S2, S3, S4, S5). Descobrimos que hipermetilação do promotor foi sempre associada com a repressão do gene, mas a sua ausência em tecidos primários somáticas não necessariamente envolvem a regulação positiva do gene. Por exemplo, enquanto

SLC5A8

foi hypomethylated em todos os tecidos normais analisados ​​(Figura S3A, B), que só foi sobre-expresso em cérebro, fígado e cólon (Figura S3C).

(A ) sequenciamento genômico Bissulfito de múltiplos clones do promotor MGMT em hESCs (i3, H14), tecidos primários normais (linfócitos Piscina, peito normal) e dois CCLs de linfóide e origem de mama (U937 e MDA-MB-231, respectivamente). Preto, CpG metilado; branco, CpG não metilado; vermelho, CpG não está presente. A barra verde acima do diagrama da ilha CpG MGMT indica a localização da sonda utilizada nas matrizes de metilação. (B) Relação entre a hipermetilação do promotor MGMT e expressão em células estaminais embrionárias humanas, as amostras normais e cancerosas. O painel superior mostra o sinal de metilação relativa obtida com as matrizes de metilação e o painel inferior os níveis de expressão de mRNA MGMT em relação ao GAPDH.

Perda de hipermetilação do promotor e ativação do gene durante o

in vitro

diferenciação de hESCs

Para demonstrar ainda que a diferenciação de hESCs está associada com menos de metilação do ADN na região promotora de certos genes, que induziu o

na diferenciação in vitro

da linha de células estaminais embrionárias humanas Shef -1 em duas linhagens de células (células semelhantes a fibroblastos e precursores neurais) (Figura 3A). Nós avaliamos a especificação das linhagens através de marcadores previamente publicados [21] (Figura 3A, painéis da direita) e depois usou matrizes de metilação para identificar genes que se tornaram hypomethylated durante a diferenciação. Verificou-se que 12,98% (37/285) dos genes hipermetilado em Shef-1 (que não foram metilados em todo o NTTS analisados) tornam-se não metilado durante

In vitro

diferenciação. Destes, 12 genes tornar-se não metilado durante a diferenciação neuronal e 25 durante a diferenciação espontânea (Tabela S5). Três destes genes eram comuns a ambos os grupos (Figura 3B) e dois deles pertenciam a Classe B-II. É de especial nota que, apesar de 9/25 dos genes metilados durante a diferenciação espontânea eram de Classe B-II, nenhum dos 12 genes metilados durante neurônio diferenciação pertencia a esta categoria.

(A) Esquerdo imagens mão, Shef-1 a linha de células estaminais (superior) e as mesmas células após a diferenciação neuronal (meio) e diferenciação espontânea de células semelhantes a fibroblastos (inferior). Os painéis da direita mostram os níveis relativos de mRNA de pluripotência (NANOG, Oct4), neuroectodérmico (PAX6, NEUROD1), e mesodérmica (COL1A1, FN1) marcadores antes e depois Shef-1 diferenciação. (B) Número de sequências hypomethylated durante Shef-1 neural (círculo vermelho) e (círculo azul) diferenciação espontânea, e sua sobreposição com genes Classe B-II (círculos pretos) Classe B-I e. (C) Bissulfito sequenciação genómica de vários clones do promotor DLC1 em Shef-1 A linha de células estaminais (superior) e as mesmas células após a diferenciação neuronal (meio) e diferenciação espontânea de células semelhantes a fibroblastos (inferior). O código de cor é o mesmo da figura 2. (D) Relação entre a hipermetilação do promotor DLC1 e expressão durante a diferenciação de células Shef-1. O painel superior mostra o sinal de metilação relativa obtida com as matrizes de metilação e o painel inferior os níveis de expressão de mRNA DLC1 relação ao GAPDH.

Para demonstrar que alguns ETG que são frequentemente hypermethylated no cancro e hESCs lata perdem a metilação durante a diferenciação, focamos nossa atenção em DLC1. Nós escolhemos este gene, porque as matrizes de metilação tinha demonstrado que perdeu metilação do promotor durante a diferenciação espontânea de Shef-1, e uma vez que é conhecido por ser um TSG que é frequentemente hipermetilado em cancro (Figura S6) [22], [23]. sequenciação de bissulfito de clones múltiplos corroboraram os resultados obtidos com as matrizes de metilação e mostrou que o promotor é hipermetilado em DLC1 Shef-1 e torna-se não metilado durante espontânea, mas não neural, diferenciação (Figura 3C). No Q-RT-PCR experiências DLC1 foi fracamente expresso na linha celular de Shef-1 e tornou-se sobre-expressos durante espontânea, mas não neural, diferenciação (Figura 3D).

ETG reprimidos por hipermetilação do promotor em células progenitoras de células-tronco hematopoiéticas

Tendo demonstrado que alguns genes do cancro são hipermetilado e reprimido em hESCs e que eles podem perder durante a metilação

in vitro

diferenciação de hESCs, investigámos se este fenómeno é restrito para o desenvolvimento embrionário ou, inversamente , é um mecanismo epigenético associada ao estado stemness independentemente do estágio ontogenético da célula. Utilizou-se matrizes de metilação para identificar genes hipermetilado em células CD34 + progenitoras de células-tronco somáticas (Figura S7), em comparação com linfócitos do sangue periférico e neutrófilos, dois tipos de células primárias adultos derivadas das células progenitoras hematopoéticas CD34 +. Foram identificados 362 sequências significativamente hipermetilado em células CD34 + (sinal de matriz de 0,7) (Tabela S6). A grande maioria destas sequências (92,27%, 334/362) também foram metilados em hESCs e mais eram frequentemente hipermetilado em CCLs (83,43%, 302/362) (Figura 4A e Tabela S6). Estes resultados sugerem que a hipermetilação de genes do cancro pode ocorrer em células estaminais, independentemente do estádio ontogênica (embrião versus adulto). A seguir, foram identificados nove sequências que foram significativamente hipermetilado em células CD34 + em relação a linfócitos periféricos, e 16 sequências que foram hipermetilado nestas células progenitoras em relação aos neutrófilos (Tabela S7). A maioria das sequências identificadas também foram frequentemente hipermetilado em hESCs (8/9 para linfócitos e 14/16 para neutrófilos) e CCLs (6/9 para linfócitos e 13/16 para neutrófilos). Além disso, não havia sequências comuns para linfócitos e neutrófilos e a maioria deles foi, por vezes, hipermetilado em NPTs. Curiosamente, 28 destas sequências foram anteriormente classificados como genes Classe B-II, embora nenhum deles era da classe BI (Figura 4A).

(A) O painel esquerdo mostra o número de sequências que são hypermethylated nas células somáticas estaminais CD34 +, e hipermetilado em hESCs e CCLs. Note-se que a maior parte das sequências hipermetilado em células estaminais somáticas são também hipermetilado em células estaminais embrionárias. O painel da direita mostra o número de sequências hypermethylated em células CD34 + (círculo preto) classificados como genes Classe B-II (círculo vermelho). Sequências hypermethylated em células CD34 + não foram classificados como genes Classe B-I (círculo azul). (B) a sequenciação genómica Bissulfito de vários clones do promotor AIM2 em Shef-1 e linhas de células estaminais I3 (superior), CD34 + hematopoiéticas progenitoras de células-tronco (meio), e células hematopoiéticas diferenciadas terminalmente (linfócitos periféricos e neutrófilos). O código de cores é que para a Figura 2. (C) Relação entre os

AIM2

e

RUNX3

hipermetilação do promotor e expressão em CD34 + progenitoras somáticas com células-tronco hematopoiéticas e células hematopoiéticas diferenciadas terminalmente (linfócitos periféricos e neutrófilos ). O painel superior mostra o sinal de metilação relativa obtida com as matrizes de metilação e o painel inferior os níveis de expressão

AIM2

e

RUNX3

mRNAs em relação ao GAPDH.

finalmente, para demonstrar que alguns genes do cancro metilado são também frequentemente metilado em células-tronco progenitoras somáticas e que a sua metilação é importante para a especificação das linhagens, foram considerados dois genes:

RUNX3

e

AIM2

. Foram selecionados

RUNX3

porque, de acordo com dados publicados anteriormente [24], os nossos matrizes de metilação mostrou que, em relação às células CD34 +,

RUNX3

foi hypomethylated em linfócitos periféricos, mas não em neutrófilos periféricos.

AIM2

foi selecionado porque ele foi previamente pensado para ser um TSG que é frequentemente hipermetilado no câncer (Figura S8) [25] e porque, ao contrário

RUNX3

, torna-se não metilado especificamente no mielóide linhagem (Figura 4B, C). Os dados de sequenciação de bissulfito confirmaram os resultados obtidos com as matrizes, que mostra que as células CD34 + e os linfócitos periféricos foram densamente metilado no promotor de

AIM2

gene enquanto que os neutrófilos periféricos estavam quase não metilado (Figura 4B). Para determinar o papel da hipermetilação do promotor de

AIM2

e

RUNX3

na diferenciação hematopoiética, foram utilizados Q-RT-PCR para analisar a sua expressão nos grupos de amostras (Figura 4C). Descobrimos que a hipermetilação do promotor foi sempre associada com a repressão do gene em ambos os genes e que a perda de metilação do promotor em

AIM2

e

RUNX3

em linfócitos periféricos e neutrófilos, respectivamente, foi associado com a sua re-expressão ( Figura 4C).

Discussão

aberrante hipermetilação do promotor de ETG e factores de diferenciação é uma alteração epigenética central em câncer [26], [27]. Os genes submetidos a tais alterações no câncer foram relatados para ser reprimida em hESCs por o estabelecimento de “domínios de cromatina bivalentes” que consiste em ativar (lisina H3 27 metilação) e reprimindo (H3 lisina 4 de metilação) marcas de histonas que mantê-los pronta para ativação, mas , ao mesmo tempo, predispõe a hipermetilação do promotor aberrante em cancros de adultos [7] – [9]. Aqui demonstramos que um outro nível de complexidade existe pelo qual alguns dos genes frequentemente aberrante hypermethylated no câncer também são frequentemente hipermetilado em hESCs. Nossos resultados sugerem que, como foi previamente proposto para células de rato [28], a metilação do DNA promotor pode ser um fator importante na regulação gênica em hESCs.

Com base no estado de metilação em hESCs nós estabelecemos duas categorias de câncer genes metilados: genes de classe a, que são frequentemente não metilado em hESCs e genes da Classe B, que são frequentemente hypermethylated em hESCs. À medida que, inesperadamente, que uma proporção substancial dos genes incluídas em ambos os grupos foram também frequentemente hipermetilado em tecidos diferenciados normais, estabelecemos duas novas subcategorias de genes do cancro metilado: subcategoria I, para genes que são na sua maioria não metilado em tecidos normais e subcategoria II , para genes que são, por vezes, hipermetilado em tecidos normais. A interpretação biológica de metilação aberrante dentro câncer metilado genes classes A e B e as suas duas subcategorias é completamente diferente. genes Classe A-I são frequentemente hipermetilado em câncer, mas não em tecidos normais ou hESCs. Estes genes não devem ser reguladas por metilação do DNA durante o desenvolvimento normal e, portanto, a hipermetilação no câncer deve sempre ser interpretado como um processo aberrante. genes de Classe A-II estão frequentemente metilado em CCLs e, por vezes, em tecidos normais, mas raramente em hESCs. A metilação desses genes podem ser importantes para a especificação das linhagens celulares e deve ser considerado aberrante em cancro quando ocorre em um tipo de tumor em cujo tecido normal correspondente não é hipermetilado. Classe genes de BI (excluindo

ASCL2

,

NPY,

e

SLC5A8

genes, cujo promotor hipermetilação DNA em linhas de células estaminais embrionárias humanas poderiam ser devido ao

in vitro

processo de cultura [11]) são frequentemente hipermetilado em hESCs e células cancerosas linhas, mas nunca em tecidos normais, o que sugere que a perda de metilação nos promotores destes genes pode ser uma influência importante sobre a perda de pluripotência durante o desenvolvimento. Sua hipermetilação no câncer deve ser sempre considerado como aberrante. genes de Classe II-B são frequentemente hipermetilado em hESCs e células cancerosas, mas, como são também por vezes metilado em tecidos normais, a hipermetilação no cancro só pode ser considerado aberrante em tipos de tumores em cuja duração normal de homólogos que são completamente não metilado. Para além disto, o facto de nem todos os genes frequentemente hipermetilado em cancro eram completamente não metilada em todos os tecidos normais analisados ​​é uma descoberta extremamente importante na epigenética do cancro [26], porque a hipermetilação do promotor de um gene, em um tipo de tumor em particular não deve ser