Sumário

A hipóxia e inflamação são estritamente interligado ambos concorrendo a progressão do câncer de próstata. Numerosos relatos realçar o papel de células tumorais na síntese de moléculas pró-inflamatórias e mostram que a hipoxia pode modular um número destes genes que contribuem substancialmente para o aumento da agressividade do cancro. No entanto, pouco se sabe sobre a importância do fenótipo do tumor neste processo. O presente estudo explora como características diferentes, incluindo a diferenciação e a agressividade, de tumor da próstata linhas celulares impacto na remodelação hipóxica da expressão de gene pró-inflamatória e malignidade. Realizamos nossos estudos em três linhas celulares com o aumento do potencial metastático: a LNCaP andrógeno-dependentes bem diferenciado ea DU145 e PC3 menos diferenciada e independente de androgénios. Analisamos o efeito que o tratamento hipóxico tem na modulação da expressão pro-inflamatória gene e avaliadas as isoformas HIF papel e jogar NF-kB em sustentar este processo. DU145 e PC3 células evidenciaram uma expressão maior normóxicas e uma indução hipóxica mais completa de moléculas pró-inflamatórias em comparação com a linha celular LNCaP bem diferenciada. O papel da HIF1α e NF-kB, os reguladores mestres de hipóxia e inflamação, respectivamente, na manutenção do fenótipo pró-inflamatório hipóxica foi diferente de acordo com o tipo de célula. NF-kB foi observado a ter um papel principal em células DU145 e PC3 em que o tratamento com o inibidor de partenólido NF-kB era capaz de neutralizar tanto o deslocamento pró-inflamatória hipóxica e activação HIF1α mas não em células LNCaP. Nosso destaque de dados que fenótipo de células de próstata tumor contribui em um grau diferente e com diferentes mecanismos para a expressão de genes pró-inflamatória hipóxico relacionada com a progressão do tumor

Citation:. Ravenna L, Principessa L, Verdina A, Salvatori L, Russo MA, Petrangeli e (2014) fenótipos distintos de células cancerosas humanas da próstata associados com a adaptação diferente à hipóxia e expressão gênica pró-inflamatórias. PLoS ONE 9 (5): e96250. doi: 10.1371 /journal.pone.0096250

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de setembro de 2013; Aceito: 04 de abril de 2014; Publicado em: 06 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ravenna et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Ministério da Universidade de Educação e Pesquisa (MIUR, COFIN 2006062242). Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro da próstata exibe uma população heterogénea de células, incluindo células cancerosas estaminais raras (CSC) e progenitoras pluripotentes (PS) embebidas numa massa de tipos de células em vários graus de diferenciação. A abundância relativa de CSC + PS e a diferenciação de células de massa correlacionou com a malignidade de tumores [1], [2]. No entanto, poucos dados estão disponíveis sobre o impacto do fenótipo de células tumorais em massa na adaptação ao estresse ambiental e, particularmente, à hipóxia. A hipoxia é uma redução do nível normal de tensão do oxigénio do tecido que pode ocorrer em patologias humanas. Estudos recentes têm mostrado que a hipoxia promove um fenótipo metastático mais agressivo em cancros humanos tais como cancros da mama [3], glioblastoma [4], da tiróide [5], cólon [6], pancreático [7] e em particular tumores da próstata [8] – [10], que está associada a um prognóstico pobre. A hipoxia factores induzível (HIFs) são reguladores-chave da resposta ao stress hipóxico transcricional [11]. Eles são heterodímeros constituídos por um O

2 subunidade α sensível e uma subunidade β constitutivamente expresso (HIF1β). Três isoformas indutíveis de HIFα estão presentes em mamíferos. HIF1α e HIF2α são as melhores isoformas caracterizadas e estruturalmente semelhantes [12]. HIF3α é o mais distantemente relacionado com numerosas variantes de splicing [13]. Na presença de oxigénio, HIF1α sofre degradação proteossómica. Sob condições hipóxicas, se acumula nos núcleos das células, forma heterodímeros com HIF1β e liga-se elementos de resposta a hipoxia em loci do gene alvo. Também HIF2α e HIF3α presente estabilização hipóxica e ligação a HIF1β embora com diferentes cinéticas. Ambos HIF2α e HIF3α apareça expresso de um modo específico de células e desempenham papéis não redundantes na adaptação à hipoxia e no crescimento do tumor hipóxico e progressão [14], [15]. A evidência crescente indica que o microambiente inflamatório é um factor que contribui ainda mais para o desenvolvimento do cancro que conduz na próstata [16], [17]. resposta inflamatória gene depende de vários factores de transcrição, entre os quais o NF-kB desempenha um papel central. A forma clássica de NF-kB é o heterodímero p50 /p65. Após a activação, os dímeros de NF-kB transloca para o núcleo, onde elas podem sofrer fosforilação, genes alvo e de ligação estimular a transcrição [18]. A conversa cruzada entre as vias de HIF a NF-kB e foi documentado extensivamente [19] – [21]. Com efeito, a subunidades p50 e p65 de NF-kB interagir directamente com o local de consenso NF-kB na promotor HIF1α e contribui para os níveis basais de ARNm e proteína HIF1α em alguns modelos de [22], [23]. Por outro lado, hipoxia parece activar a transcrição NF-kB de genes dependente [24]. No entanto, os mecanismos subjacentes que ligam a hipoxia à inflamação e inflamação à progressão do tumor ainda permanecem ainda desconhecidos. Relatórios recentes puseram em evidência o papel das células tumorais hipóxicas na síntese de moléculas inflamatórias relacionadas com a mama em [3], glioblastoma [4], da tiróide [25] e da próstata [26] progressão maligna do cancro. Além disso, eles demonstraram que uma via coordenada incluindo moléculas de inflamação e reparação está presente no tecido do tumor, na ausência de infiltrado de leucócitos detectável (CD45 +) e é sobre-regulada nas células transformadas.

O presente estudo foi realizado a fim de analisar a importância relativa das vias de HIF e NF-kB na modulação da expressão do gene inflamatória hipóxico em modelos de células de próstata apresentando fenótipos distintos com o aumento da diferenciação. Esclarecer o envolvimento específico destes dois percursos em células heterogêneas intratumorais poderia ter útil queda-out em pesquisa clínica e terapia [27]. Para este fim, foram realizadas as experiências no LNCaP bem diferenciada, dependentes de androgénios e sobre os, linhas de células menos diferenciadas, independente de androgénio DU145 e da próstata tumor PC3 com baixa, moderada e alta potencial metastático, respectivamente [28] – [32] . Levamos em consideração um conjunto representativo de genes relacionados à resposta imune inata muito envolvido na progressão do tumor de próstata que foram mostrados regulada no tecido tumoral [26], [33]. Estes incluem: o receptor de danos para os produtos de glicação avançada (RAGE) e o receptor de purina (P2X7R), o factor de crescimento epidérmico vascular A (VEGF) envolvidos na angiogénese tumoral, as enzimas induzíveis ciclo-oxigenase-2 (COX2) responsável por prostaglandinas síntese, a proteína de fase aguda pentraxina 3 (PTX3) e o receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4) do factor derivado de células do estroma, regulador de crescimento invasivo e formação de metástases. Além disso, foram analisados ​​os níveis de heme-oxigenase-1 (HO1), a enzima limitante da velocidade de degradação do heme, como um protótipo de regulador anti-inflamatório [34], [35]. Para avaliar o impacto de NF-kB na modulação conduzido hipóxia dos genes pró-inflamatórios analisados, foram estudados os efeitos do partenolido inibidor de NF-kB. A contribuição de HIF1α e da acção combinada de NF-kB e HIF1α foram analisados ​​nas células DU145 andrógeno-independente knockdown estavelmente para HIF1α.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP, DU145 e PC3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. LNCaP foram crescidas em meio RPM1-1640, DU145 e PC3 em meio D-MEM (Invitrogen) suplementado com 10% v /v de soro fetal de bovino inactivado (Thermo Scientific HyClone) e 100 U /ml de penicilina + 100 ug /ml de estreptomicina. dihydrocloride puromicina (Sigma-Aldrich), 2 ug /ml foi sempre adicionado ao meio de clones knockdown HIF1α. As células foram mantidas sob condições de normóxia padrão (95% de ar e 5% de CO

2) numa incubadora humidificada a 37 ° C. Para as experiências em condições de hipoxia, as células foram semeadas em placas em meio de crescimento completo com uma densidade de acordo com a duração do tratamento para alcançar subconfluência quando a análise foi realizada. No dia da experiência, o meio foi substituído com hipóxicas meios de cultura e de células pré-condicionados foram sujeitas a hipoxia em uma câmara incubador modular selado (Billups-Rothenberg) corado com 1% de O

2, 5% de CO

2 e 94% N

2 de acordo com as instruções do fabricante e cultivadas a 37 ° C. Partenólido (Sigma-Aldrich) tratamentos foram realizados a uma concentração de 5 uM para o tempo indicado, sempre precedido por um 2 horas de pré-tratamento em condições de normóxia.

Extracção de proteínas e ensaio Western blot

Os extractos nucleares foram preparados por um kit de extracto nuclear (Activo Motif). Um total de 5-20 ug de proteínas foram resolvidas em géis de poliacrilamida Tris-HCl e transferidas electroforeticamente para membranas de difluoreto de polivinilideno (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas em leite em PBS isento de gordura a 5% (Bio-Rad Laboratories) durante 1 h, sondados com o anticorpo primário apropriado durante a noite a 4 ° C e subsequentemente incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase durante 1 h à temperatura ambiente. Os imunocomplexos foram visualizados utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (Euroclone). As imagens digitais das bandas resultantes foram quantificadas por meio do pacote de software Quantity One (Bio-Rad Laboratories) e expresso em unidades densitométricas arbitrárias

Os seguintes anticorpos primários e secundários utilizados foram:. de ratinho anti-HIF1α (1:500 , BD Bioscience); rato anti-HIF2α e coelho anti-p50 (1:500, 1:1000, Novus Biologicals); coelho anti-HIF3α (1:1000, Sistemas Biológicos Aviva); rato anti-p65 (1:2000, Santa Cruz Biotechnology); coelho anti-fosfo NF-kB p65 (Ser 276) (1:1000, Cell Signaling); β ratinho anti-actina (1:10000, Sigma Aldrich); peroxidase de rábano silvestre conjugado anti-ratinho e anti-coelho (1:2000, Bio-Rad Laboratories).

isolamento do ARN e em tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa

O ARN total foi extraído por reagente Trizol e reversamente transcrito utilizando Superscript II reverse Transcriptase, e iniciadores aleatórios (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR quantitativo foi realizado com o Prism 7000 Sequence Detection System ABI (Life Technologies). Gene TaqMan kits Expressão ensaio foram usados ​​para HIF1α, HIF2α, HIF3α, VEGF, RAGE, P2X7R, COX2, PTX3, CXCR4, HO1 e 18S rRNA (Life Technologies) com condições de ciclismo padrão do fabricante. O nível de ARNm de cada gene foi quantificada utilizando uma curva padrão adequada e normalizadas para as de rRNA 18S gene de manutenção.

gene Estável silenciamento

bacteriana Glicerol Missão shRNA da sequência abrigando verificada shRNA vectores plasmídicos lentivírus ( os números de clone TRCN0000003810 e TCRN0000010819) que expressam curto RNA hairpin (shRNA) visando HIF1α (HIF1α shRNA) e os plasmídeos não-alvo shRNA negativos de controle (NTshRNA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. As culturas bacterianas foram amplificados e os plasmídeos shRNA purificado (PureLink, Invitrogen) e transfectado em células DU145. transfecções estáveis ​​foram realizadas utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 10

6 as células foram semeadas em pratos com 6 cm de diâmetro. No dia seguinte, as células foram transfectadas com 4 ug de plasmídeo num meio sem antibióticos. Seis horas mais tarde, o meio foi substituído com um meio padrão e, 24 h após o início da transfecção, as células foram tripsinizadas e semeadas a diferentes diluições. Após mais 24 h, o cloridrato de puromicina antibiótico selectivo foi adicionado a uma concentração final de 2 ug /ml. Dez colónias seleccionadas para cada vector de plasmídeo foram amplificados e testados quanto à expressão de ARNm de HIF1α. As colónias com um nível reduzido de ARNm HIF1α (~ 20% do valor médio em peso) para silenciar vectores plasmídicos e um nível comparável de ARNm às células WT para NTshRNA plasmídeo vector foram verificadas para a proteína nuclear HIF1α por western blot, após estimulação hipóxica 4 h. Para reduzir a variabilidade da resposta hipóxica, realizamos nossas experiências em três clones diferentes de knockdown e apresenta-se a média ± SE de os resultados obtidos a partir de cada clone. Para o controlo, foi utilizada uma mistura de três vectores plasmídicos não segmentação clones transfectados. NTshRNA DU145 e células wt não mostraram diferenças significativas nos níveis de normóxia e hipóxia de todos os parâmetros analisados. Por isso, indicamos como “peso” da média ± SE dos dados obtidos tanto a partir de células wt e NTshRNA DU145.

A análise estatística

Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes e os resultados representativos são mostrando. Valores em gráficos de barras são apresentados como a média ± SE. A significância estatística para comparações individuais de dados distribuídos normalmente foi determinada pelo teste t de Student ou Mann-Whitney Rank Sum para dados que não são normalmente distribuídos. Todas as estatísticas foram analisados ​​pelo programa PRISM. valores P inferior a 0,05 foram considerados significativos (* /° /# P 0,05, ** /oo /## P 0,01, *** /°°° /### P 0,001).

resultados

translocação nuclear de proteínas e mRNA transcrição de HIF1α HIF2α e HIF3α em células de cancro da próstata LNCaP hipóxicos, DU145 e PC3

translocação nuclear é uma medida da activação de isoformas HIF. Por conseguinte, o perfil caracterizado expressão nuclear de HIF1α, HIF2α HIF3α e nas linhas de células de tumor de próstata LNCaP, DU145 e PC3 seguintes privação de oxigénio (Figura 1A). No controle normóxica, proteína HIF1α foi indetectável ou presente a um nível muito baixo. Uma% de oxigénio aumentou a sua translocação nuclear em todas as linhas celulares examinadas com cinéticas semelhantes. acumulação nuclear começou logo após a privação de oxigênio (1 h), atingiu um pico após 4 horas e diminuiu perto do nível de base por 48 h. HIF2α estava presente no núcleo em todos os modelos celulares também em normoxia e a sua quantidade não apareça significativamente modulada em qualquer um dos modelos estudados. Uma proteína 72 kDa nuclear HIF3α foi detectado apenas em células DU145 norm�icas onde também foi observada uma indução final de partida após 24 horas de estimulação. A análise densitométrica evidenciou um aumento máximo de 2,8 ± 0,8 em comparação com dobras células normóxicas retirada após 48 h de oxigénio e um declínio lento para valores ainda superiores aos dos controlos após 72 h hipoxia (dados não mostrados).

celular foram expostos a 1% de o

2 a partir de 1 até 48-72 h, de acordo com o desenho experimental ou deixada sem tratamento. A expressão proteica foi detectada nos extractos nucleares por análise de imunotransferência. A experiência representativa para cada gene em cada linhas de células estudadas é mostrado. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. determinações B mRNA foram realizadas por PCR em tempo real, normalizado para o arrumação 18S rRNA genes e expressa como a indução vezes em relação aos controles norm�icas (fixado em 1). Os valores médios ± EP.

Os efeitos sobre os níveis de hipoxia HIF1α, HIF2α e ARNm HIF3α nos modelos celulares estudadas estão representados na Figura 1B. ARNm HIF1α foi expresso em todas as células não estimuladas. No ambiente hipóxico, o nível de ARNm HIF1α manteve-se inalterada durante 4 h e, em seguida, abruptamente diminuiu para 40-50% do valor base e ficou estavelmente baixo até 48 h de tratamento. Também ARNm HIF2α foi expressa em todas as linhas celulares de normóxia e mostrou um aumento ligeiro tarde e apenas no LNCaP dependente de androgénios, após privação de 24 e 48 h de oxigénio. HIF3α ARNm foi detectada apenas em DU145. Neste modelo celular, hipóxia determinado mRNA-regulação que precedeu o aumento da proteína nuclear, começando após 4 h e atingindo uma estimulação pico após 48 h (10,8 ± 1,5 indução vezes).

Ao todo, o nosso destaque de dados que a isoforma HIF1α, dos três analisadas, é o principal interveniente na resposta à hipóxia, independentemente do fenótipo da célula. activação HIF3α é célula específica e não parece estar relacionada com a agressividade de células cancerígenas.

A hipoxia ativa a via NF-kB em DU145 e PC3 mas não nas células LNCaP andrógeno-dependentes

avaliaram o efeito da hipoxia sobre o estado de NF-kB por meio de análise de western blot, quantificar a quantidade de p50 e p65 subunidades nucleares em experiências o tempo de curso de privação de oxigénio. Basal activação de NF-kB foi observada em todas as linhas celulares. translocação nuclear de ambas p50 e p65 foram significativamente aumentados em comparação com células normóxicas em PC3 (1-4 h) e DU145 (2-4 h), enquanto que a privação de oxigénio falhou para modular significativamente nível de NF-kB nuclear de células LNCaP no mesmo momento extensão (Figura 2).

células foram expostas a 1% de O

2 a partir de 0,5 até 24 h ou deixada sem tratamento. Após os tempos indicados, as células foram processadas e o conteúdo nuclear de p50 e p65 foi detectada por análise de imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Uma experiência representativa para cada gene em todos as linhas celulares estudadas é mostrado. densitometria de NF-kB p50 e p65 média relativa a p-actina ± SE também é evidenciado e expressos como unidades arbitrárias. * As células hipóxicas

vs células controle

norm�icas.

Estes resultados fornecem evidências de que a hipóxia tem um impacto diferente sobre NF-kB via de acordo com fenótipo de células tumorais.

upregulation hipóxica do fenótipo inflamatória relacionada com células de tumor da próstata em

, em seguida, estudaram o papel da hipoxia na modulação da síntese de moléculas pró-inflamatórias nas linhas de células de tumor da próstata descritos. Para este fim, seleccionado um número de membros representativos da família de genes envolvidos na inflamação e na reparação de tecidos sobre-expressos em tumores da próstata ou metástase e sua expressão em tempo-curso da aguda (2 e 4 h) e crónica (24, 48, 72 h) estimulação hipóxica foi medida por PCR em tempo real.

foram observadas diferenças qualitativas e quantitativas no nível de base e na indução hipóxica das moléculas selecionadas de acordo com o fenótipo celular e potencial metastático.

células LNCaP foram os produtores menos ativos das moléculas estudadas sob normoxia. Nós não detectaram transcrições para PTX3 e COX2 e todos os outros genes, exceto para CXCR4, foram significativamente menos transcrito em comparação com células DU145 e PC3 andrógeno-independente (Tabela 1).

A hipoxia foi capaz de induzir o VEGF, RAGE, CXCR4 e HO1 mas não P2X7R transcrição do mRNA. aumento ARNm RAGE foi limitado a estimulação aguda (4 h), enquanto que a transcrição de ARNm dos outros genes atingiu um pico 24 h após a privação de oxigénio e diminuiu em 72 h (Figura 3A).

As células foram expostas a 1% O

2 a partir de 2 até 72 h. Os níveis de ARNm de VEGF, RAGE, de P2X7R, a PTX3, COX2, CXCR4 e HO1 foram analisadas por PCR em tempo real e normalizado para o gene doméstico de rRNA 18S. Os gráficos mostram a relação entre a expressão de células tratadas com hipóxia relativamente a células de controlo normóxicas (fixado em 1). Os valores médios ± EP. * As células hipóxicas

vs células controle

norm�icas.

DU145 e células PC3 expressa um número maior de genes inflamatórios relacionados com selecionados que foram regulados positivamente em hipóxia com uma resposta mais completa e persistente em células PC3 mais agressivos. Em particular, DU145 evidenciado transcritos basais para todas as moléculas em estudo, para P2X7R. Em hipóxia, PTX3 mRNA mostrou um aumento precoce e por tempo limitado, enquanto a transcrição de VEGF, RAGE, COX2, CXCR4 e HO1 pico após 24 horas de estimulação e declinou por 72 h (Figura 3B). células PC3 expressaram níveis detectáveis ​​de ARNm basais todas as moléculas pró-inflamatórias analisadas. Também nesta linha celular PTX3 e RAGE foram maximamente induzida por hipoxia aguda após 2 e 4 horas de estimulação, respectivamente. Diferente dos outros modelos de celulares, o aumento hipóxica de expressão VEGF, P2X7R, COX2, CXCR4 e HO1 ainda estava em seu pico após 48-72 h de privação de oxigênio (Figura 3C).

Coletivamente, os resultados acima destacar que a expressão e hipóxico regulação positiva de moléculas tipicamente envolvidos na inflamação e metástase em tumor de próstata pode variar bastante de acordo com o fenótipo celular.

NF-kB inibidor parthenolide neutraliza a hipóxia induzida fenótipo pró-inflamatória no DU145 e PC3 mas não em células LNCaP e induz a transcrição HO1 em todos os modelos celulares

a observação de que a hipoxia tem um impacto diferente sobre a activação de NF-kB de acordo com o fenótipo linha celular levaram-nos a investigar o papel do NF-kB em a regulação positiva do fenótipo hipóxico-inflamatória relacionada em todas as células da próstata usando o partenolido naturais inibidor de NF-kB. Nas Figuras 4A, 4B e 4C os efeitos de 5 uM de partenólido a expressão da hipoxia modulado genes pró-inflamatórios em células LNCaP, células DU145 e PC3, respectivamente, estão representados, tanto em condições de normóxia e hipóxia. Para cada gene, apresentam-se os dados obtidos no ponto de tempo em que a hipoxia exercida seu aumento máximo na transcrição, como mostrado nas Figuras 3A, 3B e 3C. Parthenolide contrariado significativamente a hipoxia induzida por regulação positiva da maioria destes genes em células DU145 e PC3 em excepto para P2X7R e CXCR4 em células PC3. Pelo contrário, a droga não mostrou qualquer efeito significativo sobre a expressão das moléculas de hipoxia induzida em células LNCaP menos agressivos.

LNCaP (A), PC3 (B), células DU145 (C) foram mantidos em normóxia e exposto a 1% o

2 na presença e ausência de 5 uM partenolido. Os níveis de ARNm de VEGF, RAGE, de P2X7R, a PTX3, COX2, CXCR4 e HO1 foram analisadas por PCR em tempo real, normalizada para o arrumação 18S rRNA gene e expresso como a indução vezes em relação ao controlo não tratado normóxica (fixado em 1). Para cada gene que apresentam o efeito de partenólido nos pontos de tempo, onde hipoxia exercido um aumento máximo na sua transcrição. * hipóxicos células partenolídeo tratados

vs células

hipóxicos. C: células não tratadas de controlo de normóxia. P: células normóxicas Parthenolide tratada. H: células hipóxicas. HP:. Parthenolide tratada células hipóxicas

A acção de partenólido na modulação da HO1, uma enzima chave na luta contra os danos inflamatórios, foi completamente diferente (Figura 5). Parthenolide foi capaz de induzir precocemente e fortemente HO1 em todas as células de tumor da próstata de normóxia e de hipóxia com um efeito máximo após 4 h de estimulação. Este efeito diminuiu gradualmente, mas ainda estava presente após 24 horas de tratamento em LNCaP e DU145 e após 48 h em células PC3. Nestes pontos de tempo o efeito de partenólido e hipóxia na expressão HO1 foram aditivos.

LNCaP, as células PC3 e DU145 foram mantidos em condições de normóxia e exposto a 1% O

2 na presença e ausência de 5 uM parthenolide. Os níveis de ARNm para HO1 foram analisadas por PCR em tempo real, normalizada para o arrumação 18S rRNA gene e expresso como a indução vezes em relação ao controlo não tratado normóxica (fixado em 1). Demonstramos o efeito de partenólido após 4 h de tratamento, quando a droga maximamente HO1 expressão regulada positivamente em culturas de normóxia e após 24 h (LNCaP, DU145) e 48 h (PC3) de estimulação quando hipoxia exercido um aumento máximo na sua transcrição. Os valores médios ± EP. * Normoxic e células partenolídeo tratada hipóxicos

vs células controle

norm�icas. C: células não tratadas de controlo de normóxia. P: células normóxicas Parthenolide tratada. H: células hipóxicas. HP: partenolídeo tratada células hipóxicas

Estes resultados demonstram que o NF-kB desempenha um papel fulcral na deslocação da DU145 e PC3 mais agressiva, mas não células de tumor da próstata LNCaP hipóxico no sentido de uma pró-inflamatória, mais maligna. fenótipo. Além disso, em todas as linhas celulares, o NF-kB parece estar envolvido numa inibição independente de hipóxia do HO1 anti-inflamatória do gene.

Parthenolide afecta a activação dependente HIF1α e HIF3α hipoxia em linhas celulares DU145 e PC3

O controle da ativação HIFs e, especialmente, de HIF1α por NF-kB é uma questão de debate. Testamos se parthenolide teve qualquer impacto sobre a acumulação nuclear de HIF1α após a estimulação hipóxica 4 h que induziu o maior nível de translocação nuclear em nossas condições experimentais. A Figura 6A mostra que o partenolido inibidor de NF-kB diminuiu significativamente acumulação nuclear de proteína HIF1α em DU145 e PC3 células (~ 30%, P 0,05). Curiosamente, o nível nuclear HIF1α não foi afectada pela inibição de NF-kB apenas em células LNCaP que não mostrou uma significativa activação de NF-kB em hipoxia.

Um LNCaP, células DU145 e PC3 foram mantidos em condições de normóxia e expostos a 1% o

2 durante 4 h, na presença e ausência de 5 uM partenolido. HIF1α conteúdo foi medida na fracção nuclear por análise de imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Para cada gene de uma experiência representativa é mostrada. A média de densitometria de HIF1α em relação ao p-actina é também evidenciada e expresso em unidades arbitrárias. células DU145 B foram incubadas sob condições de hipóxia ou de normóxia durante 48 h, na presença e ausência de 5 uM partenolido. HIF3α conteúdo foi medida na fracção nuclear por análise de imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Para cada gene de uma experiência representativa é mostrada. A média de densitometria de HIF3α em relação ao p-actina é também evidenciada e expresso em unidades arbitrárias. Os valores médios ± EP. C: células não tratadas de controlo de normóxia. P: células normóxicas Parthenolide tratada. H: células hipóxicas. HP: parthenolide trataram células de hipóxia. * hipóxicos células partenolídeo tratados

vs células hipóxicas

.

Conforme descrito na Figura 1A, a regulação HIF3α foi célula específica e sua expressão foi limitada a células DU145 entre os modelos de tumor de próstata examinados. Investigou-se se o NF-kB também desempenhado um papel na activação dependente de hipoxia de HIF3α e observou-se que partenolídeo diminuição significativa do nível nuclear HIF3α após estimulação hipóxica 48 h (~ 65%, P 0,01). (Figura 6B)

no seu conjunto, estes dados enfatizam que pode afectar partenolídeo activação HIF1α hipóxico apenas nas células tumorais, onde o NF-kB é sensível à privação de oxigénio. Um efeito inibidor do partenolido é observado também em HIF3α.

Papel de HIF1α na remodelação do fenótipo pró-inflamatórios em células DU145. ação combinada de HIF1α knockdown e parthenolide

Ao contrário do LNCaP, em células DU145 e PC3 menos diferenciados, NF-kB via estava profundamente envolvido na remodelação do fenótipo pró-inflamatória sob hipóxia. Para definir a contribuição de HIF1α neste processo, criamos clones knockdown HIF1α estável (HIF1α shRNA) de células DU145. A Figura 7A mostra o nível de proteína HIF1α nuclear em peso, em células transfectadas com vector NTshRNA e num HIF1α shRNA clone representativo transfectadas de os três escolhidos para as experiências, após 4 horas de privação de oxigénio. O nível muito baixo de proteína nuclear em células knockdown HIF1α deriva de 87% ± 1 gota significativo de mRNA HIF1α (dados não mostrados). Quanto às células do tipo selvagem, caracterizamos clones NTshRNA e HIF1α shRNA em normóxia e hipóxia para o nível de proteína nuclear de HIF2α e HIF3α mRNA e e para o status de NF-kB. células knockdown HIF1α confirmada HIF2α a falta de responsividade ao tratamento hipóxico nas nossas condições experimentais (dados não apresentados). Ambos ARNm e proteína HIF3α foram induzidos por hipoxia sustentada, em muito menor grau do que em células wt (Figuras 7b, 7c). Além disso, partenolídeo não afectou significativamente HIF3α nível de proteína nuclear após a estimulação de 48 h hipóxico (Figura 7C). Também em células HIF1α knockdown hipóxia aumentou a actividade de NF-kB como mostrado pelo nível aumentado nuclear de p50 e p65, em 1% de oxigénio (Figura 7D), mesmo se o tempo de activação foi menor do que em células wt.

um tipo selvagem, e NTshRNA HIF1α shRNA transfectadas células DU145 foram mantidos em condições de normóxia e hipóxia sob (1% O

2) durante 4 h. HIF1α conteúdo foi medida na fracção nuclear por análise de imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. C: células não tratadas de controlo de normóxia. H: células hipóxicas. as células do tipo selvagem e B HIF1α shRNA foram mantidos em condições de normóxia e hipóxia sob para 24, 48 e 72 h. nível de ARNm para HIF3α foi analisada por PCR em tempo real e normalizado para o gene doméstico de rRNA 18S. O gráfico mostra a relação entre a expressão em células tratadas com hipóxia relativamente a culturas de células de controlo de normóxia (fixado em 1). Os valores médios ± EP. as células do tipo selvagem C e HIF1α shRNA foram mantidos em condições de normóxia e hipóxia sob durante 48 h, na presença e ausência de 5 uM partenolido. O conteúdo de proteína nuclear HIF3α foi detectada por análise de imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. C: células não tratadas de controlo de normóxia. P: células normóxicas Parthenolide tratada. H: células hipóxicas. HP: parthenolide trataram células de hipóxia. células D HIF1α shRNA foram mantidos em condições de normóxia e hipóxia sob durante 1, 2 e 4 h. O conteúdo nuclear de p50 e p65 foi detectada por análise de imunotransferência. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A análise densitométrica de p50 e p65 em relação ao p-actina foi expressa em unidades arbitrárias e mostrado como indução vezes em relação às culturas de células de controlo (normóxicas definidos em 1). Os valores médios ± EP. * células hipóxica HIF1α shRNA

vs

HIF1α shRNA controle normóxica.

Em seguida, mediu a expressão dos genes inflamatórios relacionados com selecionados em experimentos de tempo de curso de aguda (2, 4 h ) e crónica (24, 48, 72 h) estimulação hipóxica na ausência e na presença de 5 uM partenolido. Como esperado, as células NTshRNA não diferiram de forma significativa a partir de células wt em todos os parâmetros analisados ​​(dados não mostrados). Portanto, reunidos os dados obtidos em ambos em peso e em células NTshRNA DU145. Os resultados em células HIF1α shRNA eram bem diferentes. Foram comparados os seus valores com os obtidos em células wt expressando os níveis de mRNA de cada gene em células HIF1α shRNA como indução vezes em relação ao nível normóxica média observada em células wt que foi fixado em 1. A Figura 8A resume os nossos resultados para o VEGF, RAGE, a PTX3, COX2 e CXCR4 expressão do gene nos pontos de tempo, onde hipoxia exercidas seu aumento máximo na transcrição (2 h para a PTX3, 48 h para o VEGF, COX2 e CXCR4). valores Normoxic VEGF e PTX3 RNA foram significativamente menores no knockdown em comparação com células wt, confirmando um papel para HIF1α em sua expressão basal. A hipoxia regulada positivamente de forma significativa de VEGF, COX2 e expressão de CXCR4 para níveis comparáveis ​​aos observados nas células wt. A PTX3 foi também induzida por hipoxia, mas em menor grau no que diz respeito às células wt. Não foi observada a indução hipóxica de expressão RAGE. Cinco parthenolide mM neutralizada significativamente a regulação positiva de genes de VEGF, PTX3, COX2 e CXCR4 a um nível semelhante ao que foi observado em células wt.