Sumário

nucleolina está implicada como desempenhando um papel na angiogénese, um processo essencial no crescimento de tumores e metástases. No entanto, a presença e relevância clínica nucleolin no câncer não pequenas humano pulmão de células (NSCLC) permanece em grande parte desconhecido. Neste estudo, nós exploramos a expressão ea implicação prognostica de nucleolin em pacientes com NSCLC cirurgicamente ressecados. Uma coorte de 146 pacientes com NSCLC submetidos a ressecção cirúrgica foi selecionado para tissue microarray. Neste micromatriz de tecido, expressão nucleolina foi medida por imunofluorescência. A coloração para CD31, um marcador de células endoteliais, foi realizada para marcar os vasos sanguíneos. Um modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para avaliar o significado prognóstico da nucleolin. nucleolina expressão foi observada em 34,2% de todos os pacientes, e 64,1% em doentes de expressão elevado CD31. A sobrevida livre de doença (DFS) foi significativamente menor nos pacientes com alta nucleolin (CD31

hiNCL

oi) em comparação com pacientes com vasos sanguíneos baixo tumorais (CD31

loNCL

lo) (5 ys de DFS 24% vs 64%,

p

= 0,002). Essa diferença foi demonstrado nas seguintes análises estratificadas: Estágio I (

p Art 0,001), carcinoma de células escamosas e carcinoma adeno (

p

= 0,028), pequeno tumor ( 5 cm,

p

= 0,008), e cirurgia sozinho (

p

= 0,015). A análise multivariada revelou ainda que a expressão nucleolin previu independentemente para pior sobrevida (

p

= 0,003). Este estudo demonstra que a nucleolina está associada com os resultados clínicos em pacientes com NSCLC pós-operatórias. Assim, os níveis de nucleolin expressão podem fornecer um novo marcador de prognóstico para identificar pacientes com maior risco de fracasso do tratamento, especialmente em alguns subgrupos

Citation:. Zhao H, Huang Y, Xue C, Chen Y, X Hou , Guo Y, et al. (2013) significado prognóstico da pontuação combinada de expressão endotelial de nucleolin e CD31 em ressecado cirurgicamente Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (1): e54674. doi: 10.1371 /journal.pone.0054674

editor: Mitsunobu R. Kano, da Universidade Okayama, Japão

Recebido: 16 de julho de 2012; Aceite: 17 de dezembro de 2012; Publicação: 31 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

pulmão é a principal causa de mortes por câncer nos. homens e mulheres [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por aproximadamente 85% de todos os cânceres de pulmão, e é tipicamente associada com resultados pobres. A taxa de recorrência de NSCLC é consideravelmente elevada em pacientes com ressecção completa do tumor primário, que representa a maior mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. Durante a fase I /II NSCLC, a taxa de recidiva é de cerca de 35-67% e os 5 anos varia de taxa de sobrevivência de 33-63% [2], [3]. Na verdade, a maioria das falhas de tratamento são em grande parte devido à recorrências distantes.

A angiogênese é um processo crítico durante o desenvolvimento de tumores e metástases [4], [5]. Demonstrou-se que a neoangiogénese seja um factor de prognóstico significativo tanto para a sobrevivência global e sobrevivência livre de doença em cancro do pulmão [6] – [12]. Numerosos estudos têm medido densidade de microvasos de tumor (MVD) por coloração com CD31. No entanto, a associação entre MVD e sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão continua por resolver [13].

nucleolin é uma proteína não histona ubíquo que foi inicialmente isolada do nucléolo [14]. Como uma proteína multifuncional, nucleolina desempenha papéis fundamentais em muitos processos importantes, incluindo a proliferação celular, montagem de ribossoma, ADNr transcrição, a embalagem de pré-ARN, e organização da cromatina nucleolar [15], [16]. No entanto, acumular evidência indica que pode shuttle nucleolina para o citoplasma e membrana do nucléolo [17] – [20]. Embora nucleolina está predominantemente localizada no nucléolo, que também foi encontrado na superfície celular de vários tipos de células numa forma fosforilada [21]. Recentemente, observou-se expressão nucleolina na superfície de células endoteliais nos vasos sanguíneos do tumor nascentes [22], [23]. Na ausência de nucleolina da superfície celular, as células endoteliais parcialmente perdido a sua motilidade e não conseguiu formar estruturas tubulares [24]. Além disso, como um novo receptor funcional para endostain, nucleolina é responsável pelas potentes actividades anti-angiogénicas e anti-tumorais de endostain [25], [26]. Estudos anteriores descobriram expressão nucleolin localizada à maioria dos vasos sanguíneos dos tumores de xenoenxerto, sugerindo o envolvimento potencial do nucleolin na angiogénese tumoral [23], [26]. No entanto, até agora, existem atualmente poucos relatos que estudam os efeitos da nucleolin em NSCLC humano.

Com base nos estudos anteriores de biomarcadores de prognóstico em pacientes com NSCLC [27], [28] e o envolvimento de nucleolin em angiogênese do tumor, a hipótese de que nucleolin pode servir como um marcador importante para neoangiog�ese tumor e está associada a um mau prognóstico no início de NSCLC após a cirurgia radical. Neste estudo, nós examinamos a relação entre a expressão nucleolin e variáveis ​​clinicopathogical em 146 pacientes com NSCLC operáveis.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Um total de 146 pacientes com NSCLC consecutivos tratados com a cirurgia radical de agosto de 2000 a novembro de 2004 no Centro de Câncer de Sun Yat-Sen University foram incluídos neste estudo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da Sun Yat-Sen University. Foram excluídos pacientes com história prévia de doenças malignas. amostras de tecidos tumorais e dados de acompanhamento estavam disponíveis para todos os casos incluídos. dados demográficos do paciente são apresentados na Tabela 1. O grau de diferenciação do tumor foi determinado de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde. O estado patológico do tumor-nódulo-metástase (TNM) foi avaliada pela classificação TNM da União Internacional contra o Câncer (UICC, 2002). sobrevivência livre de doença foi definida como o período a partir da data da cirurgia para a data da progressão da doença ou morte. Se nenhuma progressão da doença ou morte foi observado no fim do acompanhamento, a sobrevivência livre de doença foi definida a partir da data da cirurgia para o último momento da avaliação do tumor. A sobrevida global foi definido como o período compreendido entre a data da cirurgia até a data da morte ou do último follow-up. tempo metástase óssea foi definida a partir da data da cirurgia para a data de metástase óssea. Se nenhuma metástase óssea foi observado no último seguimento, o tempo de metástase óssea foi calculada como o intervalo entre a data da cirurgia para o último momento da avaliação do tumor. A data de início da quimioterapia neoadjuvante foi ignorado. A data final do estudo de acompanhamento foi de 3 de março de 2010. A mediana de acompanhamento foi de 70,8 meses. (Variação: 10.4-114 meses)

Construção de arrays de tecido (TMA)

a TMA foi construído de acordo com um método anteriormente descrito [29]. Resumidamente, o bloco individual do tecido dador e o correspondente hematoxilina e eosina (H E) -stained lâminas foram cobertas por tecido TMA amostragem. O tecido foi amostrado utilizando um instrumento de tecido arraying (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EUA). Um núcleo de diâmetro 0,6 mm de tecidos foi removida e re-incorporada para uma posição pré-determinada num bloco de parafina receptor. Três amostras de núcleo foram selecionados a partir de cada tumor primário. seções múltiplas (5 mm de espessura) foram cortadas do bloco TMA e montadas em lâminas revestidas com adesivo utilizando o Tape-Transfer System Parafina (Instrumedics, Hackensack, NJ, EUA).

Imunohistoquímica

De acordo aos métodos anteriormente descritos [23], [26], as secções desparafinadas foram incubadas a 4 ° C durante a noite com murganho anti-humano CD31 mAb (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, EUA) e de coelho anti-humano nucleolina pab (Protgen , Pequim, China). Após a lavagem com TBS-T (0,1% de Tween 20 em TBS), as amostras foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com FITC de cabra anti-ratinho e TRITC-conjugado de cabra anti-coelho (Jackson Immuno-Research Laboratories, West Grove, PA, EUA) durante 1 hora à temperatura ambiente. Os núcleos foram corados com DAPI. imagens de fluorescência confocal foram capturados a partir de pelo menos 4 campos aleatórios por corte a 100 × ampliação usando uma varredura a laser sistema de imagem confocal Nikon A1 (Nikon, Japão). As imagens foram obtidas e avaliadas com vários tubos fotomultiplicadores regulados pela Nikon software NIS Elements. Todas as lâminas foram revisadas por dois patologistas independentes que desconheciam a informação clínica e patológica.

Análise Estatística

software SPSS16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para dados análise.

livre de doença sobrevivência e sobrevida global foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. A associação de expressão nucleolin com características clínicas e patológicas foi avaliada usando o teste do qui-quadrado. As variáveis ​​estatisticamente significantes foram analisados ​​usando um modelo de riscos proporcionais de Cox univariada. A análise multivariada foi realizada em todos os parâmetros para testar valores prognósticos independentes. Os resultados foram considerados significativos para P . 0,05

resultados

Cohort Descrição e preditores clínicos

As características clínicas e patológicas de cada paciente estão listadas na Tabela 1. O tumor significa tamanho era de 4,25 cm (variação, 1-12 cm). Sessenta dos 146 pacientes (41%) que se submeteram à cirurgia também recebeu quimioterapia ou terapia de radiação. a progressão do tumor foi observada em 71 pacientes (49%), com recorrência à distância em 62 pacientes e recidiva local em 9 pacientes. Cinquenta e três pacientes (36%) morreram durante o tempo de seguimento. A taxa de sobrevida livre de doença estimada de 5 anos foi de 47% (IC 95%, 40,7% -59,3%), ea taxa de sobrevida global em 5 anos foi de 69% (IC 95%, 63,2% -78,7%) para todas as 146 pacientes. Como esperado, a análise univariada mostrou associações significativas de diferenciação câncer, tamanho do tumor, estágio N, e estágio patológico tanto com a sobrevida livre de doença e sobrevida global. No entanto, a modalidade de tratamento só foi associado à sobrevida livre de doença, mas não a sobrevida global (Tabela 1).

nucleolin Expressão em NSCLC

nucleolin foi detectada em 50 pacientes fora do grupo total de pacientes (34,2%). Uma análise mais aprofundada com fatores patológicos revelaram que a expressão nucleolin foi significativamente associada com tumores grandes (≥5 cm) (grandes contra pequenos: 44,4% vs 28,3%,

P

= 0,047). Não houve relação significativa entre nucleolin e outros fatores, tais como idade, sexo, tipo histológico, a diferenciação câncer e estágios patológicos.

Notavelmente, a alta expressão CD31 foi observada em 53,2% de toda a coorte (n = 78 ). Nucleolina foi co-localizada com o marcador CD31 pan-endotelial em todos os 50 pacientes com expressão nucleolina (64,1%). No entanto, nucleolin estava ausente em outros 28 pacientes com expressão CD31. Estes resultados sugerem um papel potencial para a nucleolina no desenvolvimento de angiogénese tumoral. Os pacientes foram divididos em três grupos com base no estado de nucleolina e a expressão de CD31 (Figura 1). Isto incluiu a elevada ocorrência de vasos sanguíneos do tumor com expressão nucleolin (CD31

hiNCL

oi), um número médio de vasos sanguíneos de mais de 10 /campo e morfologia típica dos vasos sanguíneos deve ser aparente. Além disso, o nível de expressão de NCL nesses vasos sanguíneos do tumor é significativamente mais elevada (pelo menos 2 vezes maior intensidade de fluorescência média, medida pela Nikon NIS Elements Software) do que o nível basal NCL dentro da região do tumor inteiro. Também foi observado aumento da co-localização entre as estruturas positiva tubulares CD31 e áreas positivas NCL. Os pacientes também foram subdivididos pela alta ocorrência de vasos sanguíneos do tumor sem expressão nucleolin (CD31

hiNCL

lo). Estes critérios incluem a densidade de vasos de sangue elevada semelhante como as do CD31

hiNCL

grupo oi, o nível de expressão da NCL sobre os vasos sanguíneos do tumor não foi significativamente maior ( 2 vezes, intensidade de fluorescência média) do que o basal NCL nível dentro de todo o tecido tumoral. Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre a co-localização de estruturas tubulares positivas CD31 e áreas positivas NCL.

O tumor dos vasos sanguíneos e nucleolin foram coradas com anti-CD31 (verde) e anti-nucleolin (vermelho) , respectivamente. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Imagens representativas dos três grupos foram mostrados aqui. (A) CD31

hiNCL

oi, (B) CD31

hiNCL

lo, (C) CD31

loNCL

lo. Barra de escala, 50 mm.

Em termos de vasos sanguíneos baixo tumorais (CD31

loNCL

lo), o número médio de vasos sanguíneos com estrutura tubular típica deve ser inferior a 10 /campo. Estes vasos sanguíneos do tumor não deveriam expressar alta nucleolin nem co-localizar com vasos positivos CD31. Dificilmente se observou qualquer seção baixa expressão dos vasos sanguíneos de alta densidade nucleolin entre as seções NSCLC.

univariada Análise de Sobrevivência

Foi realizada análise univariada para determinar o impacto de expressão nucleolin na sobrevida de pacientes com NSCLC com tumores ressecáveis. Os dados de sobrevivência é apresentada na Tabela 2. expressão nucleolin foi significativamente associada com a diminuição da sobrevida livre de doença (

P = 0,002

, figura 2), mas não teve impacto sobrevida global (

P = 0,841

). A análise estratificada revelaram uma associação significativa de expressão nucleolin com a sobrevida livre de doença em pacientes com carcinoma de células escamosas ou adeno (

P = 0,028

, figura 3), mas não em pacientes com adenocarcinoma (

P =

0,061). expressão nucleolin também foi associado com sobrevida livre de doença, quando estratificada por outras características do tumor, tais como a diferenciação baixo câncer (

P = 0,038

, figura 3), a diferenciação de alta /média câncer (

P =

0,01), o tratamento cirúrgico exclusivo (

P =

0,015), eo tamanho do tumor menor (

P = 0,008

, figura 3). Mais importante, nucleolin teve um impacto significativo na sobrevida livre de doença em estágio pacientes I (

P Art 0,0001, figura 3), mas não em pacientes com estágio II para a doença IIIA (

P =

0,374). No entanto, não houve diferenças significativas para a sobrevida global entre os três grupos nucleolin em relação às variáveis ​​de tumor clínicas e patológicas

HH:. CD31

hiNCL

oi, HL: CD31

hiNCL

lo, e LL: CD31

loNCL

lo

HH:. CD31hiNCLhi, HL: CD31hiNCLlo e LL:. CD31loNCLlo

perigos Uniltivariate análise de relação foi utilizada para avaliar a associação significativa entre nucleolin e sobrevida livre de doença. Em geral, os pacientes com expressão nucleolin (CD31

hiNCL

oi) tiveram um maior risco de recorrência em comparação com pacientes com vasos de baixo tumorais (CD31

loNCL

lo) CI (HR = 2,768, 95% 1.544 ~4.964,

P

= 0,001). Quando comparado com o CD31

hiNCL

grupo oi, o CD31

hiNCL

grupo lo tiveram um menor risco de recorrência (HR = 0,568, IC 95% 0.325~0.991,

P

= 0,046). Outras análises mostraram que o CD31

hiNCL

grupo oi teve também um maior risco de recorrência nos seguintes subgrupos: carcinoma de células escamosas e carcinoma adeno (HR = 3,907, IC 95% 1.285~7.462,

P =

0,012), baixa e média elevada diferenciação /(HR = 2,363, IC 95% 1.129~4.949,

P = 0,023

e HR = 4,201, IC 95% 1.568~11.253,

P =

0,004, respectivamente), pequeno tumor ( 5 cm) (HR = 3,382, IC 95% 1.505~7.603,

P

= 0,003), fase I (HR = 11.371, 95% CI 3.003~43.059,

P Art 0,001), e cirurgia sozinho (CI HR = 3.012, 95% 1.345~6.747,

P =

0,007). Nestas análises de subgrupos, em comparação com o CD31

loNCL

grupo eis que o CD31

hiNCL

grupo lo não foi associada a um maior risco de recorrência exceto em pacientes com mediana ou diferenciação alta câncer (HR = 2,826, IC 95% 1.081~7.386,

P

= 0,034). Assim, nucleolin pode tornar-se um marcador valioso para identificar o risco de recorrência em pacientes com estágio inicial NSCLC.

multivariados Riscos Rácio Análise

A análise de sobrevida multivariada pelo modelo de riscos proporcionais de Cox para a seleção de os fatores prognósticos para sobrevida livre de doença, incluindo os parâmetros clínico acima mencionados e os resultados de imunofluorescência costaining da densidade dos vasos sanguíneos e nível de expressão nucleolin, indicaram que tanto a expressão nucleolin em vasos tumorais e estágio clínico III são fatores independentes de mau prognóstico para livre de doença sobrevivência (

P = 0,003

e

P Art 0,0001, respectivamente, Tabela 3). No entanto, estágio avançado, mas não a expressão nucleolin foi um fator prognóstico independente para a sobrevida global (

P Art 0,001 para a fase II /III).

metástase óssea é uma complicação comum da NSCLC. As taxas de sobrevivência de 5 anos de pacientes “com metástase óssea e CD31

hiNCL

oi, CD31

hiNCL

lo, CD3l

loNC

lo are72%, 81%, e 82%, respectivamente. No entanto, nem CD31

hiNCL

oi nem CD31

hiNCL

grupos lo exibido um maior risco de metástase óssea em comparação com CD31

loNCL

lo (

P

= 0,556 e

P

= 0,338, respectivamente). Alto risco de metástase óssea só foi observado em pacientes com estágio avançado NSCLC (

P

= 0,014) (dados não mostrados).

Discussão

Neste estudo, verificou-se que nucleolina expressão foi detectada em 34,2% dos pacientes com tumores NSCLC ressecado. Isto pode ser relacionado com a co-localização de nucleolina e CD31, o que é consistente com observações anteriores de nucleolina em células endoteliais de tumores [23]. Nucleolina também é expresso condicionalmente na superfície de células endoteliais apenas durante a angiogénese de tumores [23]. Uma possibilidade para a heterogeneidade de expressão nucleolina na superfície da célula é a variação local de proliferação de células endoteliais em lesões angiogénicos in vivo [24]. Além disso, o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), matriz extracelular e intracelular de proteínas de motor são essenciais para a expressão de nucleolina na superfície das células endoteliais durante a angiogénese [24]. Estes estudos podem explicar por que nucleolin não é facilmente detectável em tecidos tumorais sem expressão de CD31 em nosso estudo. No entanto, estudos sobre a relação entre MVD e expressão nucleolin são poucos, especialmente no cancro do pulmão de não pequenas células. O tamanho da amostra não foi grande o suficiente para detectar pacientes com baixa CD31 e de alta nucleolin, e um tamanho de amostra maior é necessária para confirmar esta relação. são necessárias mais pesquisas com marcadores mais sensíveis dos vasos sanguíneos. Além disso, observou-se que um subgrupo de doentes com NSCLC expressa CD31, na ausência de nucleolina. Para determinar se CD31 sozinho pode servir como um marcador de prognóstico em NSCLC, dividimos os pacientes em três grupos: CD31

hiNCL

oi, CD31

hiNCL

lo e CD31

loNCL

lo

.

Descobrimos que a expressão nucleolin só foi associada com tumores grandes (5cm ≥), mas não com outros fatores patológicos, tais como sexo, idade ou grau histológico. Uma explicação poderia ser que os tumores maiores têm de oxigênio e nutrição fornecido pela angiogénese tumoral suficiente. Notavelmente, a nucleolina tem sido mostrado para ser positivamente correlacionada com a taxa de crescimento do tumor [24]. Em vários estudos recentes, os antagonistas específicos de nucleolina exibiu actividade anti-tumor por inibição da angiogénese de tumores [23], [26], [30], [31].

Este é o primeiro estudo para investigar o valor prognóstico nucleolina de expressão em doentes com NSCLC. Na análise de regressão multivariada de Cox, expressão nucleolin foi avaliada como um fator independente de sobrevida livre de doença em pacientes com NSCLC (HR = 2,414), sugerindo que nucleolin poderia desempenhar um papel importante no processo de reincidência do tumor de NSCLC. A angiogénese é um acontecimento essencial para a invasão pelo tumor e metástases. Após a remoção do tumor, o ambiente pró-angiogênico foi capaz de desencadear tumores dormentes a crescer rapidamente [32] – [34]. Isto é provavelmente devido a um aumento da expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou diminuição da expressão de endostatina e angiostatina pós cirurgia, o que pode alterar o interruptor pró-angiogénico [34], [35]. A angiogénese aumentada em conjunto com a entrada de mais células tumorais em circulação, assim, facilita a metástase do tumor [6], [36], [37]. Tem sido bem documentado que o aparecimento de neoangiogénese seja um indicador significativo de mau prognóstico tanto para a sobrevivência livre de doença e sobrevivência global no cancro do pulmão [6], [7], [9], [11], [38], [ ,,,0],39]. Em nosso estudo, a principal razão para as recidivas é a metástase distante (87,3%), que está intimamente relacionado com a angiogênese. Por outro lado, que não conseguiu encontrar a nucleolina que é um factor de prognóstico de sobrevivência global. Uma possível explicação é que os pacientes recebem diferentes estratégias de tratamento (como endostain, bevacizumab), após a progressão da doença, o que pode afetar o prognóstico de sobrevivência.

Em outra análise de sobrevivência, descobrimos que a expressão nucleolin foi significativamente associada com uma diminuição sobrevida livre de doença e um alto risco de recorrência, especialmente nos subgrupos com a fase I, tumor menor ( 5 cm) e cirurgia sozinho. Clinicamente, uma pequena fracção de neoplasia são bastante agressivas, mesmo nas fases iniciais, que poderia ser fatal [40]. Em alguns casos, a remoção do tumor primário pode acelerar a recorrência do tumor localmente ou sistemicamente [34], [41], [42]. Portanto, nucleolin pode servir como marcador útil para identificar pacientes com um resultado pobre e para orientar o tratamento pós-operatório na fase inicial NSCLC.

metástase óssea é uma complicação frequente de câncer de pulmão. Observações experimentais sugerem que as células de tumor com metástases ósseas têm a capacidade de induzir a proliferação celular endotelial, migração, bem como a diferenciação [43]. No entanto, no presente estudo, não conseguiu identificar uma associação da expressão de nucleolina com um elevado risco de metástase óssea. Um grupo maior pode ser útil para confirmar ainda mais a relação de expressão nucleolin e metástase óssea em NSCLC.

Em conclusão, avaliamos pela primeira vez a expressão de nucleolin em NSCLC. Os nossos resultados fornecem evidências de que a nucleolina se localiza com CD31 no tecido do tumor de NSCLC, sugerindo nucleolina também é encontrada na superfície das células endoteliais de tumor. Também demonstramos que a expressão nucleolin poderia ser usado como um fator prognóstico negativo de sobrevida livre de doença em pacientes com NSCLC tratados com cirurgia radical. O indicador de prognóstico de nucleolina também pode ser usado especialmente em pacientes com CEC + ADSCC, fase I, tumor pequeno, e a cirurgia por si só, indicando que a administração de fármacos anti-NL perioperatórios, tais como endostatina, pode ser útil.