Abstract

O câncer de próstata (PCA) a mortalidade é impulsionado por tumores altamente agressivos caracterizadas por metástase e resistência à terapia, e esta agressividade é mediado por vários factores, incluindo a activação de percursos de sobrevivência de stress no microambiente tumoral pró-inflamatório. LEDGF /p75, também conhecida como o auto-antigénio DFS70, é um co-activador de transcrição de stress implicado no cancro, a SIDA, e auto-imunidade. Esta proteína é alvo de auto-anticorpos em certos subconjuntos de pacientes com CaP e condições inflamatórias, bem como em alguns indivíduos aparentemente saudáveis. LEDGF /p75 é sobre-expresso em CaP e outros cancros, e promove a resistência à morte celular induzida por quimioterapia por meio da transactivação de proteínas de sobrevivência. Nós relatamos neste estudo que a superexpressão de LEDGF /p75 em células CaP atenua necrose induzida por estresse oxidativo, mas apoptose não induzida por estaurosporina. Esta constatação foi consistente com a observação de que enquanto LEDGF /p75 foi robustamente clivado em células apoptóticas num fragmento p65 que carece de actividade de sobrevivência de stress, que permaneceu relativamente intacto em células necróticas. A sobre-expressão de LEDGF /p75 em células CaP levaram à sobre-regulação de transcrição e de proteínas níveis da tiol-oxidorredutase ERp57 (também conhecido como GRP58 e PDIA3), enquanto que a sua depleção levado a regulação negativa ERp57 transcrição. ensaios de imunoprecipitação e transcrição repórter cromatina mostrou ligação LEDGF /p75 para o promotor e transactivação ERp57, respectivamente. A análise imuno-histoquímica revelou a co-expressão significativamente elevada destas duas proteínas em tecidos de tumor da próstata clínicos. Os nossos resultados sugerem que LEDGF /p75 não é um inibidor de apoptose, mas sim um antagonista da necrose induzida pelo stress oxidativo, e que a sua sobre-expressão em CaP leva à sobre-regulação ERp57. Estas descobertas são de importância no esclarecimento do papel do /p75 via de sobrevivência estresse LEDGF em CaP

Citation:. Basu A, Cajigas-Du Ross CK, Rios-Colon L, Mediavilla-Varela M, Daniels-Wells TR, Leoh LS, et al. (2016) LEDGF /p75 superexpressão Atenua oxidativo necrose induzida pelo estresse e regula positivamente a Oxirredutase ERP57 /PDIA3 /GRP58 no câncer de próstata. PLoS ONE 11 (1): e0146549. doi: 10.1371 /journal.pone.0146549

editor: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos

Recebido: 08 de setembro de 2015; Aceito: 19 de dezembro de 2015; Publicação: 15 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Basu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede 5R25GM060507, 5P20MD001632 e 5P20MD006988, e por Loma Linda University School of Medicine Centro de Saúde disparidades e Medicina Molecular. CKCD, MMV, LRC, e SRM foram apoiados por bolsas de formação de pós-graduação sob concessão R25GM060507. SAM foi apoiada por um estágio de formação em investigação médica sob concessão 5P20MD006988. HB é empregado por uma empresa-Novartis comercial Pharmaceutical Oncology. Os financiadores (NIH, Novartis) forneceu apoio sob a forma de salários para os autores (CAC, CKCD, MMV, LRC, SRM, SAM, HB), mas não tem qualquer papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições”

Conflito de interesses:. Um dos autores, HB, é empregado por uma empresa-Novartis comercial Pharmaceutical Oncology. Novartis forneceu apoio sob a forma de salário para HB, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Esta filiação comercial não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de mortes por câncer entre os homens no Estados Unidos, afetando homens desproporcionalmente afro-americanos em comparação com outros grupos raciais /étnicas [1]. CaP iniciação e progressão tem sido associada à inflamação crónica e maior dano oxidativo nesta glândula [2,3]. Como um mecanismo de sobrevivência neste ambiente de tensão, as células CaP activar percursos de sobrevivência de stress que promovem propriedades agressivas do tumor, incluindo a resistência à morte celular e quimioterapia [4-6]. factor de crescimento derivado de epitélio da lente de 75 kD (LEDGF /p75) é uma oncoproteína emergente que promove a sobrevivência de células de mamífero, na presença de factores de stress ambientais que aumentam o dano oxidativo celular [7-14]. Também conhecida como p75 co-activador de transcrição, PC4 e proteína interagir SFRS1 (PSIP1), e densa fina auto-antigénio salpicado de 70 kD (DFS70), esta proteína multifuncional ganhou relevância no estudo do cancro, a SIDA, a auto-imunidade, e olho doença (revisto em refs. [9,10]). Como o co-factor celular fundamental para a integração do HIV em cromatina anfitrião, LEDGF /p75 tem atraído atenção considerável durante a última década, e vigorosos esforços estão em curso para alvejar esta proteína para o tratamento de HIV-AIDS [15].

O papel emergente da LEDGF /p75 como um estresse oncoproteína foi descoberto por vários estudos de nosso grupo e outros que documentam sua sobre-expressão em diversos tipos de câncer humano, e sua capacidade para induzir características associadas com a agressividade do tumor em células de câncer [10 -14,16-19]. Além disso, LEDGF /p75 aberrante é expressa em leucemias humanas, e interage com o complexo de transcrição Menin-MLL (linhagem mista de leucemia) para activar a expressão de genes e leucemogênese [20,21] associadas a cancro. O potencial de LEDGF /p75 como um alvo promissor para o tratamento do câncer tem sido destacada por estudos que mostram que a sua inibição ou regulação baixa atenua as propriedades agressivas de células cancerosas [14,17,19,21,22].

A nossa grupo e outros demonstrado anteriormente que LEDGF /p75 é o alvo de uma resposta de auto-anticorpos em um subconjunto de pacientes APC, bem como em indivíduos aparentemente saudáveis ​​e pacientes com diversas doenças inflamatórias crónicas ([23], também revisto em refs. [9, 10]). Também informou que LEDGF /p75 é sobre-expressos em tumores de próstata e que esta superexpressão promove a resistência das células CaP à morte celular lisossômico independente de caspase induzida pelo docetaxel taxano de drogas (DTX), o padrão ouro para CaP quimioterapia [11,13,23] . Curiosamente, LEDGF /p75 regulação positiva ocorre naturalmente durante a selecção de células CaP DTX-resistentes [24]. Em concordância com estas observações, vários estudos mostraram que LEDGF /p75 sobre-expressão em células cancerígenas promove a resistência a drogas que induzem danos no ADN e morte celular oxidativo lisossomal [12-14,18,25], levando um grupo referir-se a esta proteína como um “guardião da estabilidade lysosomal no câncer humano” [14]. As funções de protecção de stress de LEDGF /p75 parecem ser mediados através da sua capacidade para participar na reparação do ADN e transcricionalmente activar proteínas de sobrevivência de stress, tais como proteína de choque térmico 27 ​​(Hsp27), peroxiredoxina 6 (PRDX6), e vasculares factor de crescimento endotelial C (VEGF -C) [18,26-30].

foi observado anteriormente que LEDGF /p75 superexpressão em células CaP não protegeu contra a apoptose dependente da caspase desencadeada por TRAIL (fator de necrose tumoral relacionada com a apoptose ligando indutor), um indutor da via apoptótica de receptor de morte [13] bem caracterizado. TRAIL, estaurosporina (STS), e outros indutores de apoptose de chumbo para a caspase-3 mediada por clivagem de LEDGF /p75 num fragmento p65 proeminente que não tem actividade pró-sobrevivência e aumenta a morte celular em condições de stress [22,23,30]. Além disso, a clivagem de caspase-3 mediada por LEDGF /p52, a variante de splicing alternativo de curto LEDGF /p75, gera um fragmento de p35 que ab-roga a actividade de transcrição de LEDGF /p75 [30].

Devido à sua clivagem e inativação durante a apoptose, LEDGF /p75 não pode agir como um inibidor clássico de apoptose, mas sim como um protetor montante do DNA e integridade lisossomal sob um estado aumentado de estresse oxidativo celular. Portanto, nós nos concentramos no presente estudo em investigar a capacidade de LEDGF /p75 para proteger as células CaP contra a necrose induzida por estresse oxidativo, e contribuir para a regulação positiva de proteínas retículo endoplasmático de 57 kD (ERp57) em CaP. ERp57, também conhecido como glicose proteína regulada de 58 kD (GRP58) e da família de proteínas dissulfureto-isomerase Um membro 3 (PDIA3), é um tiol-oxidorredutase multi-funcional e uma proteína de chaperona responsável por manter a dobragem adequada de glicoproteínas recém-sintetizadas [31 , 32]. Nossos resultados indicam que LEDGF /p75 superexpressão atenua a morte celular por necrose induzida por estresse oxidativo e contribui para ERp57 regulação positiva no contexto do CaP.

Materiais e Métodos

Os estudos envolvendo anticorpos humanos, células de câncer linhas e tecidos da próstata foram realizados sob a aprovação da Loma Linda University Institutional Review Board.

linhas de células, anticorpos e reagentes

as linhas metastático de células de câncer de próstata DU145 (Cat. # HTB -81) e PC3 (Cat. # CRL-1435), a linha K-ras transformado de células epiteliais da próstata RWPE-2 (Cat. # CRL-11610), derivado a partir da linha de células de próstata normais RWPE-1, e a células de osteossarcoma a linha U2OS (Cat. # HTB-96) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). As células foram cultivadas como recomendado pelo fornecedor, num incubador humidificado com 5% de CO

2 a 37 ° C. Foram utilizados os anticorpos seguintes: anticorpos monoclonais de ratinho anti-β-actina (1: 5000, Sigma-Aldrich) e anti-ERp57 (1: 200, Enzo Life Sciences); policlonal de coelho anti-LEDGF /p75 (1: 1000, Bethyl laboratórios Inc); anticorpo B policlonal de cabra anti-Lamin C-20 (1: 1000 de Santa Cruz Biotechnology.); autoanticorpos humano a topoisomerase I (1: 100, Topo I), uma simpática oferta do Dr. Eng M Tan (Instituto de Pesquisa Scripps, La Jolla, CA); anti LEDGF-/p75 anticorpo policlonal de coelho Scripps-Ab5087 (1: 1000), também doada pelo Dr. Eng Tan M.; e peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpos IgG secundário (1: 5000, ThermoFisher Scientific). Terc-butil-peróxido de hidrogénio (TBHP), um peróxido orgânico, foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich. STS e N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metilcumarina (Ac-DEVD-AMC, caspase-3 fluorogénico /7 substrato) foram adquiridos a Axxora. A ampla cetona inibidor da caspase benzylocarbonyl-Val-Ala-Asp-fluorometil (z-VAD-fmk) foi comprado de Biomol International.

Morte e viabilidade celular Ensaios

A morte celular foi induzida pelo tratamento com os agentes citotóxicos TBHP (50, 75, 100, e 150 ^ M) ou STS (4 uM) durante até 24 h. Em algumas experiências, as células foram pré-incubadas com 100 uM de Z-VAD-fmk, durante 1 h antes da exposição a estes agentes. A morfologia celular foi visualizado sobre um microscópio Olympus equipado com IX70 Modulação de Contraste Hoffman (Olympus americana) e um sistema de imagem digital de Mancha (Diagnostic Instruments). Para determinar a viabilidade das células, as células semeadas em placas de 96 poços (3 x 10

4 células por poço) foram tratados com TBHP ou STS, lavadas com salina tamponada com fosfato (PBS), e fixadas em paraformaldeído a 4% durante 1 h à 4 ° C. As células foram então lavadas três vezes com água destilada, e uma solução de violeta de cristal Accustain (Sigma-Aldrich) (1: 4) foi adicionado a cada poço seguido por incubação durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas com água destilada para remover o excesso de corante e depois secou-se à temperatura ambiente. ácido acético (10% v /v) foi adicionado a cada poço durante 10 minutos, e foi medida a absorvância a 570 nanómetros (nm) utilizando um leitor de microplacas μQuant (Bio-Tek Instruments).

DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol) coloração foi usado para visualizar cromatina condensada ou fragmentado em células tratadas com TBHP ou STS. Resumidamente, as células foram semeadas em oito poços (3 x 10

4) Lab-Tek

® permanox

® lâminas de câmara (ThermoFisher Scientific), tratou-se depois de 24 h com os diferentes agentes citotóxicos, lavadas com PBS , e, em seguida, fixadas e permeabilizadas com uma solução de metanol /acetona (3: 1 v /v) durante 10 minutos a -20 ° C. A solução de fixação foi removido e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 5-10 minutos para secar. Lamelas foram montadas usando Vectashield meio de montagem contendo DAPI (Vector Laboratories). Coloração DAPI foi visualizada utilizando Olympus BX50 e microscópio de fluorescência e as imagens foram obtidas com um sistema de imagem do ponto (Diagnostic Instruments).

Os ensaios de actividade da caspase foram realizados como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas pretas, placas de 96 poços claras de fundo (3 x 10

4 células por poço). Na conclusão do tratamento com TBHP ou STS, as células foram incubadas com 50 uL de tampão de caspase 3X [HEPES 150 mM, pH de etileno 7,4, cloreto de sódio 450 mM, cloreto de potássio 150 mM, cloreto de magnésio 30 mM, 1,2 mM de glicol-bis (2 -aminoethylether) –

N

,

N

,

N ‘

,

N’ -tetraac�ico

(EGTA), 30% de sacarose, 10% CHAPS, e 1,5% de NP-40], na presença de ditiotreitol 30 mM (DTT), phenylmethanesulphonylfluoride 3 mM (PMSF), e 75 uM do substrato peptídico fluorogénico Ac-DEVD-AMC (caspase-3/7) para 2 h a 37 ° C. Isto foi seguido por incubação de células à temperatura ambiente durante 12 h, e a medição da absorvância a excitação de 360 ​​nm e de emissão de 460 nm num leitor fluorescente de microplacas FLX800 (Bio-Tek Instruments). atividade Dobre foi determinada através da normalização a um dos valores de absorbância para células não tratadas, Controle.

Medição de Espécies Reativas de Oxigênio

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi avaliada com base na oxidação intracelular de 2 ‘, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-dA, Invitrogen) para formar o composto fluorescente 2′, 7’-dicholorofluorescein (DCF). As células foram semeadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 3 x 10

4 culas por po, cultivadas durante 24 horas, e, em seguida, tratados com TBHP ou STS por até 12 horas. DCFH-DA (0,5 uM) foi então adicionado às células, seguido por incubação durante 20 minutos a 37 ° C. As células foram lavadas com PBS e em seguida ressuspensas em 0,5 mL de PBS. A intensidade da fluorescência foi determinada por citometria de fluxo utilizando um citómetro de FACScalibur (BD Biosciences).

quantitativa PCR em tempo real

quantitativa PCR em Tempo Real (qPCR) foi realizada como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de células utilizando o RNeasy Mini Kit mais (Qiagen). ARN (0,5? G) foi trancribed inversa em ADNc utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (BioRad). qPCR foi realizado no sistema de detecção de PCR MyiQ em tempo real com iniciadores, utilizando o IQ SYBR Green Supermix (BioRad) de acordo com as recomendações do fabricante. As sequências dos iniciadores para LEDGF /p75 e ERp57 foram concebidos utilizando o software Primer3 e comercialmente sintetizados por Integrated DNA Technologies (IDT) (Tabela 1). valores de ARNm alvo foram normalizados usando desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH) de ARNm e os dados foram expressos em relação aos valores normalizados dos controlos correspondentes. As amostras foram analisadas em três experimentos independentes, cada uma em triplicado.

Geração de células APC com superexpressão estável ou o esgotamento de LEDGF /p75

cDNA /p75 LEDGF foi previamente clonada em nosso laboratório no plasmídeo de expressão de mamífero pcDNA3.1 (Invitrogen) [22]. Resumidamente, tanto vector vazio pcDNA3.1 e pcDNA3.1-

LEDGF /p75

plasmídeos foram transfectados em RWPE-2 e PC3 células usando o método de Fugene 6 (Roche). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 6 poços. Selecção de transfectantes estáveis ​​foi alcançada através da adição de G418 (330μg /ml) (ThermoFisher Scientific) às culturas de células. As colónias sobreviventes foram expandidas e a expressão de LEDGF /p75 em células estavelmente transfectadas com vector vazio ou pcDNA3.1-

LEDGF /p75

foi confirmada por qPCR e immunoblotting.

células PC3 com superexpressão estável ou o esgotamento de LEDGFp75 utilizam vetores virais foram generosas doações de Professores Zeger Debyser e Rik Gijsbers (Katholieke Universiteit Leuven, Bélgica). células que sobre-expressam PC3 foram geradas por transdução com vectores retrovirais eles codificam ADNc LEDGF /p75 de comprimento completo tal como descrito anteriormente [24,33] células PC3 com depleção estável de LEDGFp75 foram gerados usando ARN de interferência baseado em vetor lentiviral intensificada, como descrito anteriormente [34] . Resumidamente, ARN de gancho de cabelo curto (sh) foi usada para knockdown estavelmente LEDGFp75 enquanto shSCR serviu como o controlo não interferente shRNA. As células transduzidas foram seleccionadas com zeocina (200? g /ml) e a sobre-expressão LEDGF /p75 ou depleção em clones seleccionados foi avaliada por qPCR e immunoblotting.

knockdown de ARN mediada por interferência de LEDGF /p75 em células CaP

knockdown transiente de LEDGF /p75 em células CaP foi conseguida por fornecimento de RNAs curtos inibidores específicos (siRNAs) em células utilizando o método Oligofectamine (Invitrogen, Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, LEDGF /siARN p75 (siLEDGF /p75) e um mexidos ARNic em cadeia dupla (SISD, controlo negativo) foram concebidos como descrito anteriormente [24], e sintetizado por IDT. A sequência /p75 siLEDGF correspondia aos nucleótidos 1340-1360 (5′-AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ‘) em relação ao primeiro nucleótido do codão de iniciação da estrutura de leitura aberta LEDGF /p75. Esta sequência corresponde a uma região no C-terminal de LEDGF /p75 que não é compartilhada por sua curta alternativa variante de processamento LEDGF /p52. A sequência para SISD foi 5’- GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 ‘. As células foram transfectadas com 40 nm siRNAs e cultivadas durante 72 horas antes da análise.

Docetaxel-resistente células CaP

Docetaxel (DTX) PC3 resistente à (PC3-DR) e DU145 (DU145-DR linhas de células) foram desenvolvidos por cultura de células PC3 e DU145, na presença de DTX de um modo de escalonamento de dose [35]. As células que sobreviveram à cultura inicial em 1 nM DTX foram passados ​​4 vezes antes de aumentar a concentração de DTX a 5,5 nM e subsequentemente de 11 nM. células resistentes foram mantidos continuamente em 11 nM DTX.

Análise Immunoblotting

Immunoblotting foi realizado essencialmente como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, as proteínas de lisados ​​de células inteiras a partir de células de CaP foram separadas por SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, ThermoFisher Scientific), seguido por transferência para difluoreto de polivinilo (PVDF) membranas (Millipore). As membranas foram bloqueadas com uma solução de leite em pó a 5% preparada em tampão TBS-T (Tris-HCl a 20, pH 7,6, 140 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) e sondadas com anticorpos primários. Após várias lavagens com TBS-T, as membranas foram incubadas com peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anticorpos secundários e lavou-se de novo várias vezes com TBS-T. bandas de proteínas foram detectados por quimioluminescência aumentada (ThermoFisher Scientific Pierce).

Kinetworks ™ Estresse /choque térmico proteína Tela

O Kinetworks ™ Estresse /Calor Tela Choque Protein (Kinexus Bioinformatics Corporation) foi usado para quantificar e comparar os níveis de 25 proteínas de estresse e choque térmico diferentes de expressão em imunotransfer�cias de lisados ​​de células inteiras a partir de células RWPE-2 com superexpressão de forma estável células LEDGF /p75 e controle estavelmente transfectadas com vector vazio pcDNA. Esta plataforma era um serviço de matriz à base de anticorpo para o rastreio simultâneo de várias proteínas de stress em lisados ​​de células que fosse comercialmente disponíveis no momento em que iniciada deste estudo. lisados ​​celulares foram sondados por immunoblotting contra um painel de anticorpos proteína de choque estresse /calor [36]. procedimentos immunoblotting e quantificação de imuno proteína do stress indivíduo foram realizadas por Kinexus.

baseado em luciferase transcrição do repórter de Ensaios

ERp57 promotor (

ERp57pr

) ensaios de repórter de transcrição à base de luciferase foram realizada como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, RWPE-2, PC3, DU145 e as células foram co-transfectadas com o vector de expressão que codifica LEDGF /p75 (pcDNA3.1-

LEDGF /p75

) ou vector vazio (pcDNA3.1), e o repórter vetor (pLightSwitch vector vazio, ou pLightSwitch-

ERp57pr

) (Painéis Genomics /Ativo Motif). Às 48 horas pós-transfecção, as células foram lisadas e os ensaios de luciferase foram efectuados utilizando o Reagente de Ensaio da Luciferase Lightswitch (Painéis Genomics /Activo Motif). células U2OS foram transfectadas com um vector de expressão LEDGF /p75 diferente, pCruzHA-

LEDGF /p75

, ou pCruzHA vazio, e ensaio da luciferase nestas células foi realizada utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase da Promega. unidades de luz relativas foram obtidos num luminómetro MicroLumatPlus Lb 96V (Berthold Tech), e os valores da luciferase foram normalizados para a concentração de proteína de lisados ​​de células co-transfectadas com vectores vazios e pLightSwitch-

ERp57pr

. Estudante de

t

análise -test foi realizada usando o Microsoft Excel. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes em triplicado.

Cromatina imunoprecipitação Assays

Estes ensaios foram realizados essencialmente como descrito anteriormente [37]. Resumidamente, as células PC3 e U2OS foram fixadas em formaldeído a 1% durante 10 minutos e submetida a ensaio da cromatina imunoprecipitação (ChIP) utilizando o kit de ChIP-expressa enzimática (Activo Motif). Anti-LEDGF /anticorpos p75 (A300-848A, Bethyl) foi utilizado para imunoprecipitar complexos de proteína-cromatina. cromatina imunoprecipitada foi então digerido enzimaticamente. A PCR foi efectuada utilizando iniciadores específicos para amplificar o promotor ERp57 (Tabela 1). Ambos imunoglobulina não específica G (IgG) de anticorpos e de entrada cromatina foram utilizados como controle.

imuno-histoquímica (IHQ) Análise de microarrays de tecido do cancro da próstata

CaP Human Tissue microarrays (TMA), disponível comercialmente da Novus Biologicals e US Biomax Inc. foram utilizados para análise IHC de LEDGF /p75 e ERp57. Três diferentes CaP TMA (dois de US Biomax Inc. e um de Novus Biologicals) foram usadas para aumentar o tamanho da amostra. Resumidamente, adquirimos da US Biomax o PR807 e PR807a TMAs, cada um contendo núcleos individuais de 3 casos livres de doenças normais de tecidos, 7 casos de tecidos adjacentes normais, e 50 casos de tecido APC. Nós também utilizamos o IMH-303 TMA (Novus Biologicals), contendo 40 CaP núcleos de tecido e 9 combinados tecidos adjacentes normais. Os fabricantes desses TMA fornecidos apenas limitada informações básicas clínico-patológico (idade, sexo, estádio do tumor em alguns casos) que corresponde aos núcleos dos tecidos, sem identificadores do paciente. Nenhuma informação foi disponibilizada na raça ou etnia do paciente, tipo de tratamento, instituições que recolhidos os tecidos, acompanhamento de rotinas, e as técnicas de manipulação de tecidos. Os pacientes limitada de dados de acompanhamento associados ao TMA nos impediu de realizar uma análise de sobrevida de Kaplan-Meier e outra correlação de análises clínicas.

TMA foram coradas utilizando um i6000 Biogênica auto-Stainer (Biogenex Corporation), como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, embebidos em parafina secções de tecido em lâminas TMA foram desparafinados e as lâminas foram submetidas a recuperação de antigénios. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por meio de tratamento com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol a 10%, e de potência de bloco

© reagente de bloqueio universal (Biogenex Corp.) foi usado para bloquear a proteína de ligação não específica. IHC coloração de LEDGF /p75 foi realizado utilizando o anticorpo policlonal de coelho Scripps-Ab5087, que é específico para LEDGF /p75 e não reage com a variante de splicing curto LEDGF /p52 [11]. IHC coloração de ERp57 foi feito usando o monoclonal anti-ERp57 (Enzo Life Sciences). TMA lâminas foram incubadas durante a noite com anticorpos primários, lavadas e depois incubadas com Multi-Link

© anticorpo secundário biotinilado (Biogenex Corp.), seguida de incubação com peroxidase de etiqueta supersensíveis acoplado a estreptavidina

© (Biogenex Corp.). A imunocoloração foi detectada por activação da peroxidase do cromogénio 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) (Biocare Medical). TMAs foram contra levemente com hematoxilina (Sigma) e montadas com Permount (ThermoFisher Scientific). Para a amostra de controlo negativo, o anticorpo primário foi omitido e substituído com soro de coelho ou rato pré-imune. As secções de tecido foram examinadas sob um microscópio Olympus BX50, e as imagens foram adquiridas usando uma câmera digital Mancha RT3

TM câmera (Diagnostic Instruments).

imunocoradas TMAs foram marcados cegamente para LEDGF /p75 imuno por um patologista placa certificada (HR). Um sistema de pontuação quatro camadas (0 = negativo, 1 = fraco, 2 = moderada, 3 = forte) foi usada para avaliar a intensidade da coloração. Tecidos com dezenas de 0-1 foram considerado de baixa coloração de intensidade, enquanto que tecidos com dezenas de 2-3 foram considerados como tendo alta coloração intensidade. Os espécimes de tecido que apresentam má qualidade foram excluídos das análises. Estes estudos foram realizados sob aprovação do Conselho de Revisão Institucional

A análise estatística dos dados IHC e sua relação com os resultados clínicos dos pacientes foi feito usando o pacote de software SAS. (Versão 9.2; SAS Institute). Para facilidade de análise estatística, as amostras de tecido foram agrupados em duas categorias com base nas suas pontuações. coloração ‘Low’ foi determinada como agrupados pontuações de intensidade de coloração de 0 e 1, enquanto a coloração ‘alta’ tinham juntado dezenas de 2 e 3. A correlação entre os níveis de expressão de LEDGF /p75 e ERp57 no tumor e controle (livre de doença normal, + normal adjacente ) tecidos foi determinada por meio do teste do qui-quadrado. Os valores de probabilidade abaixo de 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

LEDGF /p75 superexpressão atenua oxidativo necrose induzida pelo estresse, mas não induzida por estaurosporina apoptose em células CaP

tBHP, a mais homólogo estável de peróxido de hidrogénio que é amplamente utilizado em modelos de necrose induzida por stress oxidativo [38-40], e o STS indutoras de apoptose foram expostos a células APC, para activar necrótico e morte celular por apoptose, respectivamente. Ambos os agentes reduziu a viabilidade celular na linha de células de próstata RWPE-2 (Figura 1A). No entanto, enquanto as células STS-tratados apresentaram as características apoptóticos clássicas caracterizadas pela formação de bolhas e condensação da cromatina e fragmentação, células tratadas com TBHP exibiu a morfologia necrótica típica caracterizada por inchaço citoplasmática e núcleos condensados ​​sem fragmentação da cromatina (Fig 1B e 1C). O tratamento com STS conduziu a um aumento dependente do tempo da actividade da caspase-3, consistente com a indução de apoptose, enquanto que o tratamento com TBHP não levou a activação de caspase-3 (figura 1D). Lamina B, uma clássica da caspase-3 de substrato, foi clivado no seu assinatura fragmento apoptótico de 45 kD durante STS-induzidos a apoptose, mas não durante a morte celular induzida por TBHP (Figura 1E), consistente com a observação prévia de que esta proteína não é clivada durante morte celular necrótica [41]. Tomados em conjunto, estes resultados foram consistentes com evidências disponíveis que TBHP é um forte disparo de morte celular necrótica induzida por estresse oxidativo [38-40].

A. células RWPE-2 foram tratadas com 100 uM TBHP ou 4 mm de STS para induzir a necrose ou apoptose, respectivamente. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de violeta de cristal. B. Mudanças na morfologia celular associados a necrose ou apoptose em 2-RWPE células tratadas com TBHP STS ou, respectivamente, durante 24 horas. morfologia C. Nuclear de células RWPE-2 (tratados como no painel B) visualizadas por coloração DAPI. D. caspase 3 actividade foi medida após tratamento com TBHP ou STS. E. Clivagem de lamina B para a sua assinatura apoptótica fragmento 45 kD foi detectada por imunotransferência em RWPE-2 células tratadas com STS, mas não em células tratadas com TBHP. Linhas indicam bandas correspondentes às proteínas intactas e a seta aponte para o fragmento de clivagem. F. Immunoblot mostrando superexpressão estável de LEDGF /p75 em RWPE-2-

LEDGF /p75

clones, em comparação com RWPE-2

Vec

(vazio pcDNA3.1 vetor) clones e RWPE não transfectadas 2 células. G. cristal violeta ensaio de viabilidade mostram que a sobre-expressão de LEDGF /p75 em células RWPE-2 promove a resistência à morte celular induzida por TBHP mas não STS. Cada gráfico representa a média de pelo menos 3 experiências independentes realizadas em triplicata (*

P . 0

05)

.

valores

P foram determinados em relação ao controle usando o Student

t

-teste. Os dados representam a média dos experimentos, pelo menos independentes.

Para determinar se LEDGF /p75 antagoniza necrose induzida TBHP, geramos células RWPE-2 com superexpressão de forma estável esta proteína (Fig 1F). Estas células apresentaram uma atenuação significativa da morte celular necrótica induzida TBHP em comparação com células transfectadas de forma estável com o vector pcDNA3.1 vazio (Figura 1G). Como esperado, LEDGF /p75 sobre-expressão não atenuou a apoptose induzida por STS (Figura 1G), provavelmente devido à sua clivagem por caspases [22,23,30].

reproduzido e expandido estes achados no osso células CaP metastático, PC3. Semelhante a nossas observações em células RWPE-2, o tratamento de células PC3 com qualquer STS ou TBHP reduziu a viabilidade celular de uma forma dependente do tempo (Fig 2A). Como esperado, zVAD-fmk, um inibidor de caspases ampla atenuada apoptose induzida por STS, mas não teve efeitos inibidores sobre a necrose induzida por TBHP (Fig 2A). Embora zVAD-fmk atenuou significativamente a apoptose STS-mediada, não inibiu completamente a morte celular medida que o tempo progredia (Fig 2A), consistente com observações anteriores de que STS induz a morte celular independente de caspase ou necroptosis sob condições comprometida-caspase em certas linhas de células [ ,,,0],42,43]. Consistente com nossas observações em células RWPE-2, as células PC3 STS-tratados exibiram a formação de bolhas característica e extensa condensação da cromatina e fragmentação associada a apoptose, enquanto que as células tratadas com TBHP exibiu inchaço citoplasmático sem fragmentação nuclear (Fig 2B e 2C). Como esperado, o tratamento com STS, mas não com TBHP, conduziu à activação de caspase-3 (figura 2D).

. células PC3 foram tratadas com 100 uM TBHP ou 4 mm de STS para induzir necrótico ou apoptótico de morte celular, respectivamente, na presença e ausência do inibidor de caspase zVAD ampla-fmk. A viabilidade celular foi avaliada às 6, 12, 24 h pós-tratamento e, em 6 h 18 h de tratamento, mais de recuperação. B. Mudanças na morfologia celular associados a necrose ou apoptose em células PC3 tratadas com TBHP e STS, respectivamente, durante 24 h. morfologia C. Nuclear de células PC3 visualizadas por coloração DAPI. D. caspase 3 actividade foi medida após tratamento com TBHP ou STS. E. Clivagem do Topo I num seu apoptótica assinatura (70 kD) e necrótica (70 kD e 45 kD) fragmentos foi detectada por imunotransferência em células PC3 tratadas com STS ou TBHP, respectivamente (painel superior). A clivagem do LEDGF /p75 para a sua assinatura fragmento apoptótico (65 kD) foi detectada em células tratadas com STS, mas não em células tratadas com TBHP (painel inferior). p-actina foi utilizado como controlo de carga.