Abstract
Purpose
Para examinar o
in vitro
e
in vivo
eficácia do inibidor duplo PI3K /mTOR NVP-BEZ235 no tratamento de
PIK3CA
do tipo selvagem cancro colorectal (CRC).
projeto Experimental
PIK3CA
linhas de células do tipo selvagem mutante e humanos CRC foram tratados
in vitro
com NVP-BEZ235, e os efeitos resultantes sobre a proliferação, apoptose e sinalização foram avaliados. tumores do cólon de um modelo de camundongo geneticamente modificado (GEM) para esporádica do tipo selvagem
PIK3CA
CRC foram tratados
in vivo
com NVP-BEZ235. Foram examinados os efeitos resultantes sobre o crescimento tumoral macroscópica /regressão, proliferação, apoptose, angiogênese e de sinalização.
Resultados
In vitro
tratamento de linhas celulares de CRC com NVP- BEZ235 resultou em bloqueio PI3K transitória, diminuição sustentada do mTORC1 de sinalização /mTORC2, e uma diminuição correspondente na viabilidade celular (mediana IC
50 = 9,0-14,3 nM). Efeitos semelhantes foram observados em linhas de células de CRC emparelhados isogénicas que diferem apenas na presença ou ausência de um activador
PIK3CA
alelo mutante.
In vivo
tratamento de camundongos portadores de tumor do cólon com NVP-BEZ235 resultou na inibição de PI3K transiente e sustentada bloqueio da mTORC1 de sinalização /mTORC2. vigilância de tumores longitudinal por colonoscopia óptica demonstraram um aumento de 97% no tamanho do tumor em murganhos de controlo (p = 0,01) contra uma diminuição de 43% (p = 0,008) em murganhos tratados.
ex vivo
análise dos tumores tratados com NVP-BEZ235 demonstraram uma diminuição de 56% na proliferação (p = 0,003), não há efeitos sobre a apoptose, e uma redução de 75% na angiogénese (p = 0,013).
Conclusões
Estes estudos fornecem a justificativa pré-clínico para estudos que examinaram a eficácia do inibidor duplo PI3K /mTOR NVP-BEZ235 no tratamento de
PIK3CA
do tipo selvagem CRC.
Citation: Roper J, Richardson MP, Wang WV, Richard LG, Chen W, Café EM, et al. (2011) A dupla PI3K /mTOR inibidor NVP-BEZ235 induz a regressão do tumor em um modelo de camundongo geneticamente modificada de
PIK3CA
de Tipo Selvagem câncer colorretal. PLoS ONE 6 (9): e25132. doi: 10.1371 /journal.pone.0025132
editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, Espanha |
Recebido: 14 de junho de 2011; Aceito: 25 de agosto de 2011; Publicação: 26 de setembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Roper et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Instituto Nacional do Câncer (2U01CA084301) e do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e renais (NIDDK) (5K08DK7803325, R03DK088014 e T32-DK07542). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
em 2011, o cancro colorectal (CRC) continuará a ser a terceira causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer em os EUA [1]. Apesar da crescente arsenal de agentes quimioterapêuticos, a média de sobrevivência de pacientes com câncer colorretal metastático é ainda inferior a 20 meses, o que reforça a necessidade urgente para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas [2].
alvo da rapamicina em mamíferos ( mTOR) é uma cinase de serina /treonina que regula a proliferação celular e a apoptose. mTOR liga a proteína reguladora associada de mTOR (rapina) e LST8 mamífero /G-proteína β-subunidade como proteína (mLST8 /GβL) para formar o complexo mTOR 1 (mTORC1), que promove a tradução através da fosforilação de p70 S6 quinase (S6K), proteína ribossomal S6 (S6), e fator de iniciação eucariótico 4E proteína de ligação 1 (4E-BP1). Alternativamente, a mTOR pode ligar companheiro rapamicina e minúsculas de mTOR (Rictor), mLST8 /GβL, e de mamífero proteína cinase activada pelo stress interagindo proteína 1 (mSIN1) para formar mTOR complexo 2 (mTORC2) [3], [4].
A fosfatidilinositol a montante 3-quinase (PI3K) via de sinalização pode ativar mTOR. As PI3Ks de Classe IA são activada pelo factor de crescimento cinases de tirosina receptoras (RTKs) e são compostas de um heterodímero que consiste numa subunidade p110α /p110β catalítico e um regulador de p85 [5]. O
PIK3CA
(fosfatidilinositol 3-quinase, catalítica, α-polipéptido) gene que codifica a p110α está frequentemente mutado em muitos cancros humanos, incluindo CRC [6]. As mutações pontuais em
PIK3CA
aglomerado em dois pontos de acesso: E545K no domínio helicoidal (exão 9) e H1047R no domínio quinase catalítico (exão 20). Estas mutações aumentar a actividade p110α e promover o crescimento de células de CRC, invasão, migração e
In vitro
através da activação da via PI3K [7]. Mutações nos domínios helicoidais e catalíticas de
PIK3CA
conferem fenótipos essencialmente idênticas em linhas celulares de CRC humanos [7]. AKT é um efector a jusante crítico da via PI3K e promove o crescimento e sobrevivência celular através de um certo número de mecanismos, incluindo a fosforilação de TSC2, o que resulta na activação mTORC1 [5]. ativação completa de AKT é alcançado após fosforilação em Thr308 e Ser473 por PDK1 e mTORC2, respectivamente [5], [8] – [11].
Por causa de seu papel central na carcinogênese, o bloqueio mTORC1 é um atrativo terapêutica estratégia para CRC. O tratamento de ratinhos Apc Δ716 com o everolimus mTORC1 inibidor inibe a proliferação celular e angiogénese de tumor, resultando numa redução no número e tamanho dos tumores intestinais [12]. Temos relatado recentemente que o tratamento de um modelo de camundongo geneticamente modificado (GEM) para CRC esporádicos com os rapamicina resultados inibidores mTORC1 em uma redução de 80% no crescimento tumor individual, como observado pela vigilância colonoscopia longitudinal [11]. No entanto, a eficácia clínica de bloqueio mTORC1 pode ser atenuada pela perda concomitante de um ciclo de feedback negativo dependente do mTORC1 sobre a sinalização de PI3K (reflectido pelo aumento da fosforilação de AKT em Thr308), e continuou a activação mediada por mTORC2 de AKT através da fosforilação em Ser473 [9 ] – [14]. Com efeito, uma Fase I de ensaios clínicos examinaram a eficácia do inibidor de everolimus mTORC1 em tumores sólidos avançados demonstrou um benefício modesto em apenas um de 16 pacientes com cancro colo-rectal e em geral, o aumento da fosforilação de AKT Ser473 em [13]. Tomados em conjunto, verifica-se que as estratégias terapêuticas em que a PI3K e mTOR são simultaneamente inibida pode ser mais eficaz.
NVP-BEZ235 (Novartis) é uma bandeja dual-classe I de PI3K e inibidor de mTOR quinase que tem sido demonstrado reduzir o crescimento do tumor em um número de modelos diferentes vários rato geneticamente (GEM) e xenoenxerto e está actualmente em ensaios clínicos [14] – [50]. Houve a sugestão de que o uso de tais agentes pode ser limitada a tumores com mutações de activação em
PIK3CA
[51], [52]. Como ativar
PIK3CA
mutações são vistos em apenas 17% dos CRC, isso implicaria tais agentes podem ser direcionados para apenas uma pequena proporção de pacientes [53]. Porque NVP-BEZ235 inibe a do tipo selvagem e formas mutantes da
PIK3CA
com eficácia comparável [32], a hipótese de que NVP-BEZ235 pode ter eficácia significativa no tratamento de
PIK3CA
wild- digite CRC.
neste artigo, descrevemos os resultados de
in vitro
tratamento estudos que demonstram a eficácia comparável de NVP-BEZ235 contra ambos
CRC humana PIK3CA
do tipo selvagem mutante e linhas de celular. Também descrevemos os resultados de
in vivo
tratamento estudos que demonstram a eficácia significativa em um modelo GEM para esporádica do tipo selvagem
PIK3CA
CRC. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem uma base racional pré-clínica convincente para ensaios clínicos para examinar o uso de NVP-BEZ235 no tratamento de
PIK3CA
pacientes com CCR do tipo selvagem.
Materiais e Métodos
O tratamento in vitro
de CRC linhas celulares
HCT116 humano (
PIK3CA
mutante; domínio quinase em H1047R), DLD-1 (
PIK3CA
mutantes; domínio helicoidal na E545K) e SW480 (
PIK3CA
do tipo selvagem) linhas celulares de CRC humanas (ATCC) e isogênico DLD-1
PIK3CA
células mutantes e do tipo selvagem (obtidos a partir de B. Vogelstein) foram mantidas em DMEM (Invitrogen) com 10% de FBS e 1 x penicilina /estreptomicina (Invitrogen). As células foram plaqueadas a diferentes densidades iniciais (HCT116: 3.000 células /poço, DLD-1: 5.500 células /poço, SW480: 4.500 células /poço, DLD-1
PIK3CA
mutante: 7.000 células /poço, e DLD -1
PIK3CA
do tipo selvagem: 9.000 células /poço) para contabilizar cinética de crescimento diferenciais. Após 16 horas, as células foram incubadas com concentrações crescentes de NVP-BEZ235 (Novartis), e meio de crescimento contendo o fármaco foi trocado a cada 24 horas. A viabilidade celular foi avaliada 16 horas após o plaqueamento inicial e 48 horas após o início do tratamento com fármaco utilizando o ensaio colorimétrico MTS CellTiter 96® Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular (Promega), de acordo com as instruções do fabricante. A viabilidade das células após o tratamento com fármaco foi normalizada com a das células não tratadas também cultivadas durante 48 horas. IC
50 valores foram calculados utilizando regressão não linear de 4 parâmetros em GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Para a análise de Western Blot, as células foram plaqueadas com 0 nM ou dose inibitória máxima (500 nM) de NVP-BEZ235 durante 2, 6, 24, ou 48 horas.
A sequenciação de tumores do cólon a partir de um modelo da gema por CRC esporádica
C57BL /6J
Apc
camundongos knockout condicionais (Apc CKO) foram tratados com adeno-Cre, como descrito anteriormente [11]. Após necropsia, 10 amostras de tumor foram recolhidas em 1 ml de ARN Mais tarde (Invitrogen, Inc), armazenado durante a noite em 4 ° C, em seguida, removidos a partir de ARN posterior e arquivado em -80 ° C. O ARN foi extraído de amostras utilizando RNeasy (Qiagen, Inc.), e o cDNA foi gerado com transcriptase reversa (RT Omniscript, Qiagen, Inc). Iniciadores concebidos pelos autores do estudo foram usadas para criar 553 pb e 477 pb amplicons (PCR realizada utilizando Platinum PCR SuperMix High Fidelity, Invitrogen, Inc) que mede códons 532-554 do exão 9 (domínio helicoidal; 9F: 5 ‘GCAGTGTGGTGAAGTTTCCA 3’, 9R: 5 ‘TGGCCAATCCTTTGATTTGT 3’) e c1011-1062 do exão 20 (domínio de cinase; 20F: 5 ‘ACTGCGTGGCAACCTTTATC 3’, 20R: 5 ‘TGATGGTGTGGAAGATCCAA 3’) do
gene PIK3CA
, respectivamente, que incluem regiões mutação hotspot. Sanger seqüenciamento dos amplicons foi realizada no Centro de biopolímeros na Harvard Medical School, e os resultados analisados com Sequencher 4.10.1 (gene codifica, Inc).
In vivo
tratamento de um modelo GEM para CRC
camundongos Apc CKO esporádicos foram tratados com adeno-Cre e seguido por colonoscopia óptica, como descrito anteriormente [11]. Como uma métrica colonoscópico para o tamanho do tumor, o tamanho do tumor Índice (ETI) foi calculada como (área do tumor /área do lúmen do cólon) x 100 (%). Portador de tumor os murganhos foram distribuídos aleatoriamente para tratamento com veículo de controlo sozinha (n = 8) ou 45 mg /kg de peso corporal NVP-BEZ235 em 10% de 1-metil-2-pirrolidona /90% de PEG 300 (n = 8) pela gavagem oral diariamente durante 28 dias. A dose de tratamento foi escolhida com base na literatura indicando que o peso de 40-50 mg /kg de corpo de NVP-BEZ235 trata eficazmente modelos de tumores de murinos, sem efeitos adversos [15], [24], [26], [28], [32], [ ,,,0],47]. Com base em estudos farmacocinéticos demonstram concentração máxima do tecido, uma hora após a administração de NVP-BEZ235, os ratinhos portadores de tumor foram sacrificados uma hora após a dose de tratamento final [32]. volume do tumor do cólon foi avaliada usando pinças (largura x comprimento x altura) e os tumores foram colhidos para a análise de western blot e imunohistoquímica.
Western blot análise
As concentrações de lisados celulares ou tumorais inteiras foram determinados pela Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). 10? G e 25? G de lisado de proteína de célula inteira e tumor, respectivamente, foi separado em gel de SDS /PAGE a 10%, transferido para membrana de nitrocelulose, bloqueadas em 1% de BSA durante uma hora, incubou-se à temperatura ambiente durante duas horas com o anticorpo primário e uma hora com o anticorpo secundário. A detecção foi realizada utilizando os ™ ECL ™ ocidentais reagentes de detecção Blot Amersham (GE Healthcare). p-AKT Thr308 (1:1000 diluição), p-AKT Ser473 (1:2000 diluição), AKT total (1:1000 diluição), p-S6 Ser240 /244 (1:3000 diluição), p-S6 Ser235 /236 (1:1000 diluição), S6 (1:1000 diluição), clivado da caspase 3 (1:1000 diluição), e PARP clivada (1:1000 diluição) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). β-actina (diluição 1:5000) foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroxidase AffiniPure Donkey Anti- Coelho anticorpo secundário Ig (1:10,000 diluição) foi obtido a partir de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) [11].
Imunohistoquímica
Cinco mm secções de tecido embebidos em parafina foram desparafinados em xileno, seguido por re-hidratação álcool. A recuperação de antígenos foi realizada em 1 × tampão de citrato (pH 6,0) (Zymed) usando um Decloaking Secção médica (Biocare Medical). As lâminas foram bloqueadas à temperatura ambiente com peroxidase de reagente bloqueador (DAKO), burro normais /soro de coelho, e avidina /biotina Kit de bloqueio (Vector Laboratories). As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário e 30 minutos à temperatura ambiente com anticorpo secundário. O kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) foi utilizado para detecção de acordo com as instruções do fabricante. As lâminas foram coradas com o DAB + Substrato Cromogénio Sistema Líquido (Dako) por instruções do fabricante e contrastadas com solução de hematoxilina de Mayer e solução de Bluing de Scott. p-AKT Ser473 (diluição 1:50), p S6-Ser240 /244 (diluição 1:50), p S6-Ser235 /236 (1:100 de diluição), foram obtidos a partir de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). CD31 (diluição 1:100) foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). KI-67 (1:100 diluição) foi obtido a partir de US Biológica (Swampscott, MA). ensaio TUNEL (Apoptag) foi adquirido a partir da Millipore (Billerica, MA) [11]. O índice de proliferação Ki-67 foi calculado como o número médio de Ki-67 de células positivas /número total de células glandulares por campo de alta potência (média de 16 campos de alta potência) x 100, e a densidade de microvasos (MVD) foi calculado como o número de células positivas CD31 por campo de alta potência (média de 16 campos de alta potência). índice de positividade de TUNEL foi calculado como o número médio de células positivas TUNEL /número total de células glandulares por campo de alta potência (média de 16 campos de alta potência) × 100. As medições foram realizadas por três cegos, observadores independentes em cada quatro de controle e quatro tumores tratados.
Estatísticas
Comparações de volume tumoral final, Ki-67, MVD, e células em apoptose entre controle e NVP- coortes tratados com BEZ235 foram calculados utilizando os dois-rabo-de-Amostras independentes teste t. valores pré e pós-tratamento da ETI foram comparados com o Wilcoxon signed-rank test. P 0,05 foi considerado significativo para todas as análises. Todas as análises foram calculadas usando SPSS 18.0 para Windows (IBM, Inc).
Resultados
In vitro
NVP-BEZ235 tratamento de linhas celulares de CRC humanos diminui a proliferação celular, mas tem nenhum efeito sobre a apoptose
Para examinar os efeitos do
in vitro
tratamento NVP-BEZ235 da viabilidade celular, três linhas celulares de CRC humanas (HCT116, DLD-1 e SW480) foram tratados com o aumento quantidades de NVP-BEZ235 durante 48 horas, e a viabilidade celular foi avaliada através de um ensaio colorimétrico MTS. Estes estudos revelaram uma diminuição dependente da dose semelhante da viabilidade após o tratamento NVP-BEZ235 (média IC
50 de três experiências separadas = 14,3 ± 6,4, 9,0 ± 1,5, e 12,0 ± 1,6 nM para HCT116, DLD-1 e SW480 linhas de células, respectivamente; p = 0,74) para todas as três linhas celulares (Figura 1A). Para determinar se o decréscimo observado na viabilidade celular após o tratamento com NVP-BEZ235 resultou a partir de uma indução de apoptose, análise de Western blot para a caspase-3 clivada e PARP clivada foi realizada, revelando nenhum aumento nestes marcadores apoptóticos com tratamento NVP-BEZ235 (Figura 1B ). Tomados em conjunto, estes estudos sugerem que
in vitro
tratamento com resultados NVP-BEZ235 em uma redução equivalente na proliferação celular em duas linhas celulares de CRC abrigar distinta
PIK3CA
mutações (HCT116 e DLD-1) , bem como em uma
PIK3CA
célula de tipo selvagem cancro colorectal (SW480), sem efeito sobre a apoptose.
(a) a viabilidade celular de HCT116, DLD-1, e células SW480 CRC linhas foi avaliada por ensaio de MTS após o tratamento com concentrações crescentes (0-500 nM) de NVP-BEZ235 durante 48 horas. Os resultados apresentados são a média de três experiências independentes. (B) Análise de Western blot para p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, p-S6
Ser235 /236, caspase 3 e clivada PARP foi realizada após 2, 6, 24 e 48 horas de incubação com (-). 0 ou (+) 500 nM NVP-BEZ235
In vitro
NVP-BEZ235 tratamento de linhas de células humanas CRC resulta na inibição mTORC1 e mTORC2 sustentada, mas PI3K transitória bloqueio
Para examinar os efeitos do
in vitro
tratamento NVP-BEZ235 em PI3K (p-AKT
Thr308) , mTORC1 (p-S6
Ser235 /236 e p-S6
Ser240 /244), e mTORC2 (p-AKT
Ser473) de sinalização mTOR, foi realizada análise de western blot. Depois de duas horas de tratamento NVP-BEZ235, os níveis de p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, e p-S6
Ser240 /244 foram significativamente diminuiu. Considerando uma redução sustentada foi observada nos níveis de p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, e p-S6
Ser240 /244, a inibição completa de p-AKT
Thr308 foi perdido em menos de seis horas (Figura 1B). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que
in vitro
NVP-BEZ235 tratamento resulta na inibição sustentada da sinalização mTORC1 e mTORC2, mas que o bloqueio PI3K é transitória.
A eficácia de
in vitro tratamento
NVP-BEZ235 de linhas celulares de CRC humanos não depende de PIK3CA mutacional estatuto
A eficácia comparável de tratamento NVP-BEZ235 em
PIK3CA
mutante (HCT116 e DLD-1) e
PIK3CA
tipo selvagem (SW480) linhas celulares de CRC humanos sugere que a sua eficácia clínica não pode ser limitada aos pacientes cujos tumores contêm ativando
PIK3CA
mutações. Continuar a analisar esta possibilidade, que avaliou o efeito do NVP-BEZ235 na proliferação celular e sinalização celular intracelular em
PIK3CA
linhas de células do tipo selvagem mutante e emparelhados. O
PIK3CA
linha de células mutante foi derivado de DLD-1 através da ruptura do tipo selvagem
PIK3CA
alelo por alvo recombinação homóloga, enquanto o
PIK3CA
células do tipo selvagem a linha foi derivada através da ruptura do mutante
PIK3CA
alelo (uma simpática oferta do B. Vogelstein) [7]. Como tal, a composição genética destas células difere apenas no
PIK3CA
lócus, tornando estes controlos isogénicas outra forma perfeita. Encontramos IC50 semelhantes para NVP-BEZ235 tanto em
PIK3CA
células DLD-1 do tipo selvagem e mutante (média de IC
50 de três experiências separadas = 15,1 ± 6,0 e 12,1 ± 4,3 nM para DLD-1
PIK3CA
linhas de células do tipo selvagem e mutante, respectivamente; p = 0,82, Figura 2A). A análise de Western blot de p-AKT e p-S6 revelou a inibição sustentada da p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, e p-S6
Ser240 /244; No entanto, a inibição de p-AKT
Thr308 era transiente em ambas as linhas celulares (Figura 2B). Além disso, o tratamento com NVP-BEZ235 não aumentou os níveis de PARP clivada da caspase-3 clivada e em qualquer uma das linhas de células (Figura 2B). No geral, estes resultados sugerem que
PIK3CA
estado mutacional não prever a eficácia do tratamento NVP-BEZ235 em linhas celulares de CRC humanos.
(A) A viabilidade das células do tipo selvagem mutante e isogênico
PIK3CA
células foi avaliada por ensaio de MTS após o tratamento com concentrações crescentes (0-500 nM) de NVP-BEZ235 durante 48 horas. Os resultados apresentados são a média de quatro experiências independentes. (B) Análise de Western blot para p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, p-S6
Ser235 /236, caspase 3 e clivada PARP foi realizada após 2, 6, 24 e 48 horas de incubação com (-). 0 ou (+) 500 nM NVP-BEZ235
In vivo
NVP-BEZ235 induz tratamento a regressão do tumor em um modelo GEM para esporádica PIK3CA do tipo selvagem CRC
para examinar os efeitos do
in vivo
tratamento NVP-BEZ235 no crescimento do tumor do cólon, foi utilizado um modelo GEM novo para CRC esporádica que recentemente descrito [11]. Adenovírus expressando Cre recombinase (adeno-Cre) foi usado para induzir tumores de cólon em floxed
Apc
ratos. Os tumores dos 10 ratinhos foram analisadas quanto à presença de mutações de activação por sequenciação directa dos exões 9 e 20 do gene da
PIK3CA
. Nenhuma mutação foi identificada, o que sugere que estes ratinhos são representativos de
PIK3CA
de tipo selvagem CRC. colonoscopia óptica foi usado para embaralhar o tratamento de tumores do cólon de tamanho comparável com veículo ou droga de controlo de 45 mg /kg de NVP-BEZ235 por gavagem oral diariamente durante 28 dias. Notamos há toxicidade ou efeitos colaterais durante esse regime de tratamento de drogas. crescimento longitudinal posterior ou a regressão de tumores do cólon individuais foi determinada por colonoscopia óptico, como anteriormente descrito [11]. Para cada tumor, o tamanho do tumor em relação um Índice (ETI) métrica foi calculada como o tamanho do tumor (T) normalizada para a área luminal do cólon (G) (Figura 3A).
ratinhos com tumores do cólon foram distribuídos aleatoriamente para tratamento com controle diluente (n = 8) ou 45 mg /kg de NVP-BEZ235 (N = 8) por gavagem oral diariamente durante 28 dias. Resultante do crescimento do tumor do cólon ou regressão foi serialmente examinado por colonoscopia óptica. (A) Tamanho de Tumor Índice (ETI) foi calculada como a área do tumor (T) dividido pela área do lúmen (L) x 100. (B) colonoscopia tumor Representante imagens fixas durante o período de tratamento de 28 dias. (C) O volume de tumor de controle e NVP-BEZ235 tratados com tumores na necropsia (média 65 mm
3 vs. 5 mm
3; p = 0,01). (D) ETI final versus volume do tumor (R
2 = 0,89, P 0,0001). Mudança na média ETI para (E) controle (32% pré-tratamento vs. 57% pós-tratamento, P = 0,01) e (F) tratado (32% vs 20%, P = 0,02) coortes.
Um curso de tempo representativa de imagens para colonoscopia de controlo (n = 8) e os tumores tratados com NVP-BEZ235 (n = 8) é mostrado na Figura 3B. O volume do tumor na necropsia foi significativamente maior no controle versus grupos tratados (65 mm
3 vs. 5 mm
3; p = 0,01; Figura 3C). De acordo com nossas análises anteriores [11], a ETI final em ambos os grupos de tratamento positivamente correlacionada com o volume do tumor na necropsia (R
2 = 0,89, p = 0,0001; Figura 3D). A ETI média no grupo controle aumentaram significativamente durante o período de tratamento (32% vs. pré-tratamento de 57% de pós-tratamento, p = 0,01; Figura 3E), enquanto que na coorte de NVP-BEZ235 diminuiu significativamente (36% vs. 20%, p = 0,008; Figura 3F). Cada tumor no grupo de controlo aumentou em tamanho; tumores tratados todos diminuíram de tamanho. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que
in vivo
tratamento com NVP-BEZ235 resulta na regressão significativa em
tumores do cólon do tipo selvagem PIK3CA
.
In vivo
tratamento NVP-BEZ235 de um modelo GEM para resultados esporádicos CRC na inibição mTORC1 e mTORC2 sustentada, mas PI3K transitória bloqueio
para examinar os efeitos do
in vivo tratamento
NVP-BEZ235 em PI3K e a sinalização da mTOR, análise de western blot foi realizada em tumores do cólon que foram colhidas de uma hora após a administração final de droga nos dias 5 e 28 de tratamento. A análise de transferência de Western para os níveis de p-AKT
Thr308, p-S6
Ser240 /244, e p-AKT
Ser473 foi realizada como substitutos para a activação das vias de PI3K, mTORC1, e mTORC2, respectivamente. Um decréscimo sustentado dos níveis de p-AKT
Ser473 e p-S6
Ser240 /244 foi observada nos tumores dos ratinhos tratados com NVP-BEZ235, como comparado com o controlo de diluente (Figura 4A e 4B). Estes resultados foram confirmados por imuno-histoquímica do tumor (Figura 4C). Tal como acontece com os nossos
in vitro
estudos, uma diminuição inicial nos níveis de p-AKT
Thr308 foi observada em cinco dias após o tratamento, mas normalizado por 28 dias (Figuras 4A e 4B). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que
in vivo
NVP-BEZ235 tratamento resulta na inibição sustentada mTORC1 e mTORC2, mas o bloqueio PI3K transitória.
Os ratos com tumores de cólon foram randomizados para o tratamento com diluente de controlo ou 45 mg /kg de NVP-BEZ235 por gavagem oral diariamente durante cinco dias. A análise de Western blot de p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, e p-S6
Ser240 /244 foi realizada para os tumores tratados com (-) diluente de controlo ou (+) NVP-BEZ235 para ( A) e cinco (B) 28 dias. (C) A imuno-histoquímica da P-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, e p-S6
Ser235 /236 foi realizada para os tumores tratados com diluente de controlo ou NVP-BEZ235 durante 28 dias.
In vivo
NVP-BEZ235 tratamento de um modelo GEM para CRC esporádica inibe a proliferação, não tem efeito sobre a apoptose e angiogênese blocos tumor
para examinar os efeitos de
in vivo
tratamento NVP-BEZ235 sobre a proliferação celular, tumores do cólon foram examinados por imuno-histoquímica para a proliferação marcador Ki-67. Esta análise revelou que a proliferação diminuída de 56% após 28 dias de tratamento com NVP-BEZ235 (p = 0,003, Figura 5A). Para avaliar o efeito do tratamento com NVP-BEZ235 na apoptose celular, os tumores do cólon foram examinados por ensaio de TUNEL. Não foram observadas diferenças entre os tumores tratados com diluente controle e NVP-BEZ235 (p = 0,9, Figura 5B). Como as PI3K e mTOR vias desempenhar um papel significativo na angiogénese tumoral [54], [55], foram examinados os efeitos do tratamento com NVP-BEZ235 sobre a densidade de microvasos (MVD) por meio de imuno-histoquímica para o marcador endotelial CD31. Esta análise revelou que MVD reduzida em 75% após 28 dias de tratamento com NVP-BEZ235 (p = 0,013, Figura 5C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que
In vivo
tratamento com NVP-BEZ235 resulta numa diminuição significativa na proliferação do tumor, não induz a apoptose celular, e inibe a angiogénese do tumor.
(A) representativas imuno-histoquímica para o marcador de proliferação Ki-67 após tratamento com diluente de controlo ou NVP-BEZ2355 durante 28 dias (p = 0,003). índice de proliferação Ki-67 foi calculada como média do número de células tumorais positivas por campo de alta potência. (B) de TUNEL imuno-histoquímica foi realizada em tumores tratados com diluente de controlo ou NVP-BEZ235 durante 28 dias (p = 0,9). TUNEL foi quantificada como percentagem positiva células por campo de alta potência. (C) para a imuno-histoquímica representativas PECAM marcador endotelial após o tratamento com diluente de controlo ou 45 mg /kg de NVP-BEZ2355 (p = 0,013). densidade de microvasos foi calculado como média do número de vasos positivos por campo de alta potência.
Discussão
Por causa de seu papel central na iniciação e progressão do CRC, o bloqueio da mTOR e PI3K vias de sinalização emergiu como um alvo atraente para o desenvolvimento de novas terapias de CRC [10], [56] – [59]. Nós e outros têm demonstrado a eficácia da inibição da via mTORC1 em modelos pré-clínicos de CRC [11], [12]. No entanto, um estudo clínico precoce examinar inibidores mTORC1 em pacientes de CRC humanos demonstraram resultados modestos, talvez devido à perda de um circuito dependente de mTORC1 feedback que limita a activação de PI3K e /ou a activação mediada por mTORC2 continuou de AKT [3], [60]. Tomados em conjunto, parece inibidores duplos de PI3K /mTOR, tais como NVP-BEZ235, são necessárias para a eficácia terapêutica máxima.
Alguns estudos têm sugerido que o
PIK3CA
cancros mutantes são “oncogenicamente viciado” sinalização de PI3K, que conduz ao aumento da sensibilidade à terapia de inibidor de PI3K [7], [61], [62]. No entanto, um grupo relatou nenhuma associação entre o
status e resposta mutacional PIK3CA
aos inibidores de PI3K [63]. No entanto, um outro grupo relatou exclusivamente segmentação
PIK3CA
pacientes mutantes para a terapia de PI3K /mTOR [64]. Como
PIK3CA
mutações são vistos em apenas 17% dos CRC humana, esta abordagem limitaria significativamente o impacto clínico de tais agentes [53]. Porque NVP-BEZ235 inibe igualmente as formas mutantes e do tipo selvagem de
PIK3CA
, a hipótese de que NVP-BEZ235 teria eficácia significativa no tipo selvagem humana
PIK3CA
CRC [32]. Em apoio a esta, encontramos sensibilidade comparável ao
in vitro
tratamento NVP-BEZ235 em
PIK3CA (mutação domínio HCT116, quinase; DLD-1, mutação domínio helicoidal)
mutante e
PIK3CA
de tipo selvagem (SW480) linhas celulares de CRC, bem como em
PIK3CA
isogénicas linhas celulares de tipo selvagem mutante e combinados. A sequenciação directa das regiões de ponto de acesso em exons 9 e 20 da
PIK3CA
nos tumores do cólon validado nosso modelo GEM como um substituto para
PIK3CA
do tipo selvagem CRC, que usamos no nosso
in vivo
NVP-BEZ235 estudos de tratamento. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o tratamento NVP-BEZ235 pode ter benefício clínico no 83% dos pacientes de CRC com o tipo selvagem
PIK3CA
. Para avaliar ainda mais este recurso, procurou-se analisar se NVP-BEZ235 seria eficaz em um modelo GEM para esporádica
PIK3CA
do tipo selvagem CRC.
Traditional
in vivo
abordagens de validação alvo dependem de plataformas de xenoenxerto. Infelizmente, estes modelos não são verdadeiramente preditivos de resposta em pacientes humanos, porque eles derivam de linhas celulares de tumores alta passagem cultivadas
in vitro
. Estas linhas de células são implantadas em locais ectópicos que não se assemelham o microambiente do cólon e, portanto, não conseguem recapitular a natureza heterogénea do câncer e seu estroma de sustentação [65]. Embora os modelos de câncer GEM resolver estes problemas, a maioria dos modelos GEM empregam germ-line ou modificação de todo o tecido de genes conhecidos por ser mutado em CRC humano. Além disso, muitos modelos CRC GEM presentes principalmente com tumores intestinais pequenas [66]. Para modelar com precisão humana esporádica CRC, temos descrito recentemente um procedimento em que adeno-Cre é administrado a ratos floxed para inativar somaticamente o
gene
Apc de forma estocástica e restringir a formação de tumores no cólon distal. A localização anatômica reprodutível destes tumores permite o uso de colonoscopia óptica para examinar tumores individuais de uma forma longitudinal [11].
Para examinar a eficácia de
in vivo
tratamento NVP-BEZ235, nós Utilizamos o nosso modelo GEM para CRC esporádica. Em nossos estudos, houve forte correlação entre os tamanhos de tumor finais avaliadas pela colonoscopia em relação necropsia (R
2 = 0,89), validando o nosso protocolo dimensionamento tumor colonoscopia-based. De acordo com a nossa
in vitro
tratamento NVP-BEZ235 de linhas celulares de CRC humanos, tumores do cólon a partir do modelo GEM diminuiu em 43% no tamanho depois de
in vivo
tratamento com NVP-BEZ235, enquanto tumores de controlo aumentaram de tamanho até 97% (p 0,0001).