Abstract

Bezielle (BZL101) é uma droga oral candidato que tem mostrado promissor eficácia e excelente nível de segurança nos ensaios clínicos de fase cedo para avançado câncer de mama. Bezielle é um extrato aquoso da erva

Scutellaria barbata

. Temos relatado anteriormente que Bezielle foi selectivamente citotóxicos para as células cancerosas, enquanto poupando células não transformadas. No tumor, mas não em células não transformadas, Bezielle geração de ROS induzidas e grave dano do DNA seguido de hiperactivação da PARP, a depleção do ATP celular e NAD, e a inibição da glicólise. Mostramos aqui que as mitocôndrias de células tumorais “são a principal fonte de espécies reativas de oxigênio induzidos por Bezielle. O tratamento com Bezielle induz níveis progressivamente mais elevados de superóxido mitocondrial, bem como do tipo de peróxido de ROS. A inibição da respiração mitocondrial impede a geração de ambos os tipos de ROS e protege as células de morte induzida por Bezielle. Além de glicólise, Bezielle inibe a fosforilação oxidativa em células tumorais e esgota a capacidade de reserva mitocondrial de células a capacidade para produzir ATP privando. As células tumorais falta mitocôndrias funcionais manter a atividade glicolítica na presença de Bezielle apoiando assim a hipótese de que as mitocôndrias são o principal alvo de Bezielle. Os efeitos metabólicos da Bezielle em relação as células normais não são significativas, de acordo com os baixos níveis de dano oxidativo que Bezielle inflige sobre eles. Bezielle é, por conseguinte, uma droga que tem como alvo células de cancro selectivamente mitocôndrias, e distingue-se de outros tais drogas pela sua capacidade de induzir não só a inibição da OXPHOS mas também da glicólise. Este estudo fornece uma melhor compreensão do mecanismo da citotoxicidade de Bezielle, e com base na sua seletividade para células cancerosas

Citation:. Chen V, Staub RE, Fong S, Tagliaferri M, Cohen I, Shtivelman E (2012 ) Bezielle seletivamente alvos mitocôndrias das células cancerosas para inibir a glicólise e OXPHOS. PLoS ONE 7 (2): e30300. doi: 10.1371 /journal.pone.0030300

editor: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canadá |

Recebido: 20 de julho de 2011; Aceito: 12 de dezembro de 2011; Publicação: 03 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi suportado inteiramente pela Bionovo, Inc. Sem financiamento externo foi recebido para este estudo. O financiador desempenhado um papel na decisão de pesquisar Bezielle como um agente anti-câncer, mas não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses.: os autores reconhecem que eles são trabalhadores remunerados e os detentores de ações de Bionovo, Inc, e que este estudo, em sua totalidade, foi apoiado por fundos da Bionovo. Bezielle (BZL101) é proprietária droga candidatos botânico de Bionovo (FDA-IND: 59.521) para o tratamento de câncer de mama metastático. Bionovo de Patente dos Estados Unidos No. 7.700.136 cobre um método de tratamento de cancro da mama utilizando um extracto de Scutellaria Barbata. Esta patente também cobre o uso de formulação BezielleR proprietária da Bionovo como uma monoterapia para o tratamento de câncer de mama. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Bezielle (BZL101, FDA IND # 59,521) é um extrato preparado a partir das partes aéreas de erva

Scutellaria barbata

que tem propriedades anti-câncer.

S. barbata

extracto foi mostrado ter uma actividade citotóxica contra várias linhas de células de tumor in

in vitro

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7 ], [8], [9], [10] e atividade antitumoral

in vivo

[11], [12], [13] em modelos de renal, hepatocelular e carcinoma da próstata. Mais importante ainda, dois ensaios clínicos em fase inicial com Bezielle mostrou eficácia promissor e excelente nível de segurança para o tratamento de câncer de mama avançado [14], [15]. Nos pacientes dezesseis ensaio clínico de Fase Ia, os quais passaram por vários tratamentos antes da inscrição foram avaliáveis ​​para resposta. Quatro pacientes tinham doença estável para 90 dias (25%) e 16/03 tinha SD para 180 dias (19%). Cinco pacientes apresentaram regressão tumoral objectiva [15]. pequeno ensaio subsequente escalonamento de escala com uma formulação melhorada de Bezielle mostrou uma eficácia semelhante prometendo [14]. A necessidade de novos medicamentos para reduzir a morbidade e mortalidade dos cancros metastáticos não pode ser subestimada. Em particular, são urgentemente necessários medicamentos por via oral disponíveis com menos toxicidade. Bezielle cumpre estas necessidades não satisfeitas, e estudos clínicos mais amplos para fornecer dados mais definitivos em relação à segurança e eficácia são planejadas.

Temos relatado anteriormente que Bezielle mata seletivamente células tumorais enquanto poupadores células não transformadas

in vitro

[8], [15]. Esta selectividade pode explicar o seu perfil de segurança superior demonstrada em ensaios clínicos iniciais, quando comparado com outros agentes citotóxicos aprovados. Até à data, as análises dos efeitos celulares de Bezielle revelaram que a base para a selectividade do Bezielle é a indução de níveis elevados de espécies de oxigénio reactivas (ROS) em células tumorais que é fortemente atenuados em células normais. ROS induzida por Bezielle causar danos no DNA e activação hiper extensa de PARP-1 em células tumorais. Significativamente, Bezielle induziu uma modesta danos no ADN em células não transformadas que foi reparado e não envolvem uma activação de hiper [8] PARP. Em células tumorais, a activação de PARP empobrecido NAD + e ATP que são usados ​​para sintetizar poli-ADP ribose para PAR-ylation de um número de proteínas celulares envolvidos na reparação do DNA danos, o controlo da transcrição e da regulação do ciclo celular [16], [17] , [18]. Depleção de citosólica NAD + é a causa mais provável da inibição selectiva subsequente de glicólise [19], [20], [21] que é observado em tumores tratados Bezielle mas não em células normais [8]. A inibição da glicólise, bem como o colapso do estado redox (que se manifesta na depleção de NADPH e GSH nas células tumorais tratadas por Bezielle) são a causa provável da morte celular desencadeada por Bezielle. Com efeito, os nossos resultados mostram que Bezielle induz a morte necrótica, principalmente, [8] que é conhecido por estar associado com a hiperactivação da PARP-1 [21], [22], [23]. A análise combinada detalhada recente proteômica e metabolômica de células de câncer de mama tratados com Bezielle revelou indução de danos estresse oxidativo seguido de redistribuição de fluxos metabólicos [24]. Especificamente, três famílias de enzimas envolvidas na manutenção do potencial redox foram afectados por Bezielle: glutationa e as proteínas relacionadas e peroxirredoxinas-tiorredoxina. O maior subconjunto de proteínas afetadas por Bezielle foram aqueles envolvidos em vias metabólicas, incluindo a glicólise, ciclo de Krebs e metabolismo de ácidos graxos. Estes dados suportam a hipótese de que Bezielle afeta criticamente células tumorais metabolismo através danos oxidativos.

Neste estudo, analisamos ainda mais os mecanismos de morte celular induzida Bezielle e sua seletividade. Nós relatamos que as mitocôndrias são o alvo celular primária de Bezielle, e as conseqüências celulares descritos anteriormente de tratamento com Bezielle são acionados através dos efeitos desse extrato botânico na mitocôndria. Ao examinar os efeitos metabólicos da Bezielle descobrimos que Bezielle inibe não só a glicólise, mas também a fosforilação oxidativa, comprometendo, assim, ambas as vias de produção de energia celular.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

Bezielle extracto foi preparado como descrito anteriormente para o material de qualidade clínica [15]. Resumidamente, a erva bruta seca foi moída até um pó fino, adicionado a uma razão de 1:10 (peso para volume) de água para pré-aquecido e cozido a 80 ° C durante 30 minutos. O sobrenadante foi separado dos sólidos insolúveis por centrifugação a 5000 rpm, e sujeita a uma liofilização. O pó resultante foi dissolvido em água a 50 mg /ml e filtrado em condições estéreis antes da utilização.

iodónio de difenileno (DPI), N-acetil-cisteína, apocinina, FCCP (p-trif luorometoxi carbonil cianeto fenil-hidrazona), antimicina A e outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma. indicadores fluorescentes de ROS CM-H

2DCFDA e MitoSox Red eram de Molecular Probes /InVitrogen. Os anticorpos para PAR eram de Becton-Dickinson, para Nox4 de Epitomics, a subunidade 2 da IV complexo mitocondrial de Mitosciences, a LC3 de Abgent, e SQSTM de sinalização celular.

cultura celular e tratamentos

Todas as linhas celulares foram obtidas da ATCC. MDAMB231 foram propagadas em RPMI com FCS a 10%. MCF10A foram propagadas em meio DME /F12 com 5% de FCS, 50 ug /ml de extracto de pituitária, 10 ug /ml de insulina, 0,5 ng /ml de hidrocortisona e de 0,02 ug /ml de EGF (Sigma). Hs578T células SKBr3 e foram cultivadas em DMEM com FCS a 10%. Preparação do extracto aquoso de Bezielle foi descrito anteriormente [8]. As células foram tratadas com Bezielle a 250 ug /ml (peso seco por volume), a menos que indicado de outra forma nas legendas de figuras, ou com água (rotulado como “não tratado” ao longo do papel). Todos os tratamentos com Bezielle foram feitas em plena piruvato falta meios de crescimento.

foram preparados Medição da ROS

stocks frescas de ROS indicadores CM-H

2DCFDA e MitoSox Vermelho em DMSO a uma concentração de 0,5 mM e diluídos em meio de crescimento quente para a concentração de 2,5 uM. O meio contendo um dos corantes indicadores foi adicionada às células. Depois de incubação das culturas com as sondas de 20 minutos, as células foram lavadas com PBS, tratadas com tripsina e colhidas para análise por FACS. Fluorescência de CM-H

2DCFDA foi coletado no canal FL1, e por MitoSox vermelha no canal FL2. Cada experiência incluiu células que não foram submetidas a tratamento com Bezielle. Os níveis de fluorescência destas células não tratadas foi atribuído um valor arbitrário de 1, e de fluorescência de células tratadas Bezielle é mostrada nas figuras como “dobrar aumento” em relação às células não tratadas

Lentivírus -. Mediada por siRNA e expressão do gene

Para silenciamento Nox4, seis shRNA constrói no plasmídeo vector LKO foram comprados da Open Biosystems /Thermo. Os vírus foram produzidos em células HEK293 que de acordo com as instruções do fabricante e utilizado para transduzir células, seguido de selecção em concentrações pré-determinadas de puromicina.

As medições de viabilidade celular, número de células e apoptose

A viabilidade celular foi determinado usando o kit de CCK-8 (Dojindo). análise de morte celular foi realizado usando a coloração com iodeto de anexina V /propídio seguido por citometria de fluxo. As células foram recolhidas por tripsinização nos seus meios de cultura, lavaram-se com PBS e coradas com anexina V-FITC (BioVision) e iodeto de propídio (PI), e analisadas imediatamente após uma incubação de 5 minutos, utilizando o software CellQuest no FACScan (Becton Dickinson). os níveis de ATP foram quantificados com ATP kit de ensaio de bioluminescência SH II (Roche Applied Science).

A quantificação de glutationa reduzida usando sonda fluorescente monobromobimane

As células em placas de 96 poços foram tratados como se desejar, o meio de tratamento foi removido e substituído com meio contendo 8 uM monobromobimane (MBB). A fluorescência foi lida num leitor de placa com filtros definidos na excitação de 360 ​​nm e emissão a 460 nm.

análise Western blot

lisados ​​celulares totais foram sujeitas a electroforese em SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose . As membranas foram colocados a hibridar com anticorpos em concentrações recomendadas durante a noite a 4 ° C e os anticorpos primários ligados foram detectados usando anticorpos secundários conjugados com peroxidase. As manchas foram desenvolvidos utilizando o kit de quimioluminescência aumentada SuperSignal (Pierce) e fotografada no Kodak Imager ISR2000.

Ensaio Cometa

ensaios Comet foram realizadas utilizando o kit de ensaio do cometa de Trevigen de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram colhidas, lavadas e ressuspensas em PBS. As células foram combinadas com baixo ponto de fusão de agarose, que funde a 37 ° C e pipetados até lâminas cometa. A agarose foi permitida solidificar a 4 ° C durante 30-40 min, e as lâminas foram imersas em solução de lise frio (Trevigen, Inc.) durante 30 min a 4 ° C. As lâminas foram imersas numa solução próxima alcalino recentemente preparado (NaOH a 300 mM e EDTA 1 mM) durante 20 min e sujeitas a electroforese no mesmo tampão alcalina a 15 V (0,5 V /cm) e 300 mA durante 25 min. As lamelas foram enxaguadas em água e fixadas em etanol a 70% durante 5 min. Após secagem ao ar, os núcleos foram corados com SYBR Green (Trevigen, Inc.) e visualizados sob um microscópio de fluorescência. As percentagens de células com cometas foram quantificados por dois observadores cegos à identidade das lâminas. Nuclei também foram fotografados e analisados ​​com o software de análise de imagem TriTek CometScore. momento de cauda de oliva, definido como o produto da percentagem de ADN na cauda e deslocamento entre a posição dos centros médios de massa nas cabeças e caudas, foi determinada para pelo menos 40 células por amostra.

analisa metabólica com Seahorse XF96 extracelular Flux Analisador

As células foram cultivadas durante a noite em XF96 PET placas de 96 poços em números experimentalmente predeterminados (10 × 10

3 células por poço para MDAMB231 e 12 × 10

3 células por poço para MCF10A). fluxos metabólicos foram analisados ​​no cavalo marinho XF96 analisador de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [25]. Basal ECAR (taxa de acidificação extracelular, em mph /min), OCR (taxas de consumo de oxigénio, em pMoles O

2 /min) e PPR (normalizado de taxa de produção de protões, em nmol de H + /min) os valores foram medidos por 4 ciclos. Cada ciclo consistiu de uma mistura de 3 minutos, meios de tempo e um tempo de 5 minutos medições. Após a medição dos níveis basais de ECAR e OCR para 4 ciclos, o desacoplador FCCP mitocondrial em 1 uM foi automaticamente injectados nas cavidades experimentais, a fim de quantificar a capacidade respiratória máxima, ou de reserva mitocondrial. Após um ciclo de medições inibidor do complexo mitocondrial III antimicina A a 5 ^ M foi injectado nas cavidades experimentais, e um outro ciclo de medição foi realizada para verificar que o consumo de oxigénio foi de origem mitocondrial. Cada ponto experimental foi uma média de 6 a 10 poços réplica, em cada experiência, e as experiências foram repetidas pelo menos 3-4 vezes. Os dados experimentais foram considerados aceitáveis ​​apenas quando variações nos valores de pH entre os ciclos de mistura e medida fosse inferior a 0,05-0,1 unidades de pH. Isto assegurou que os dados ECAR não foram artificialmente alteradas por alterações nos valores de pH, e, de facto, estreitamente paralelo alterações nos valores de PPR. Normalização dos valores obtidos em ensaios de XF96 foi realizada utilizando quantificação de ADN celular em placas experimentais com o ensaio de CyQUANT (Promega). Todos os dados são expressos como XF96 ECAR ou OCR valores normalizados para o conteúdo de DNA.

Resultados

O papel da mitocôndria na indução de espécies reativas e morte celular por Bezielle

relataram anteriormente que Bezielle é citotóxica selectiva para linhas celulares de cancro da mama, mas não a células não transformadas, tais como células mamarias imortalizadas e fibroblastos primários, que são relativamente resistentes ao seu efeito citotóxico [8]. Desde então, temos testado citotoxicidade de Bezielle em mais de duas dezenas de linhas celulares de cancro e quatro linhas de células imortalizadas diferentes e células primárias. Observou-se que, em média, as células não transformadas são muito menos sensíveis a Bezielle que a linha de células de cancro (manuscrito em preparação). Figura 1A ilustra essas observações com duas linhas celulares: linha de carcinoma de mama MDAMB231 e imortalizado linha epitelial MCF10A. Temos observado que a sensibilidade à Bezielle, em geral, não se correlaciona directamente com a taxa de proliferação de linhas de células (dados não apresentados). Assim, a taxa de proliferação das células não transformadas MCF10A é realmente um pouco maior do que a das linhas celulares de cancro MDAMB231, e é muito mais elevada que a de outras linhas de células cancerosas da mama que são sensíveis à Bezielle [8].

A. Bezielle induz a morte celular em células tumorais, mas que é menos citotóxica para as células não transformadas mamárias. A linha celular de cancro da mama e MDAMB231 linha não transformada MCF10A foram tratados com Bezielle nas concentrações indicadas, durante 24 horas, e a viabilidade celular foi quantificada utilizando o kit de ensaio de CCK-8. Os resultados são a média ± E.P. (N = 4). B. As células foram tratadas com Bezielle a 250 ug /ml para metade de uma hora ou 6 horas, carregados com as sondas sensíveis ROS e analisadas por citometria de fluxo para verde (H

2DCFDA) ou vermelha (MitoSox) fluorescência. Os resultados são expressos como vezes de aumento de fluorescência nas células tratadas em comparação com as células carregadas com sonda não tratados. Os resultados são a média ± E.P. (N = 3). Diferenças significativas entre MDAMB231 e MCF10A são indicados (** P 0,01). análise de mancha de Western de C. MDAMBRho 0-células seleccionadas em baixa concentração de brometo de etídio confirma a eliminação da subunidade mitocôndrias codificada 2 do complexo IV respiração, e, portanto, a inibição da OXPHOS. D, Análise de indução de ROS em Rho 0-células realizados como descrito em análise seja da indução da morte celular por Bezielle em Rho 0-células realizados como descrito em A. As diferenças significativas entre os grupos indicados são indicados (* P 0,05; ** P . 0,01)

A indução de morte em células cancerosas por Bezielle é uma consequência directa da indução de ROS e estresse oxidativo, porque a co-tratamento com antioxidantes N-acetil-cisteína (NAC) ou piruvato de danos no ADN e morte celular inibida [8]. Nosso objetivo foi identificar as fontes celulares do ROS induzida Bezielle. As linhas celulares foram tratadas com Bezielle para diferentes tempos e carregado com indicadores de células-permeável de ROS CM-H

2DCFDA que se torna fluorescente em resposta ao peróxido de tipo radicais de oxigénio [26], ou MitoSox vermelho, altamente selectivos para superóxido mitocondrial [ ,,,0],27]. Temos observado um aumento dependente do tempo gradual ROS em linhas celulares de cancro da mama MDAMB231 e SKBR3, mas não em MCF10A células após o tratamento com Bezielle (Figura S1). A Figura 1B ilustra os níveis de ROS em 30 minutos e 6 horas após o tratamento. Os dados são expressos como vezes de aumento da fluorescência ao longo do que a verificada em células não tratadas carregadas com o indicador fluorescente. MDAMB231 produziu mais do que as células ROS MCF10A já após os primeiros 30 minutos de incubação com Bezielle, mas com o tempo a diferença nos níveis de ROS induzidas na linha de duas células tornou-se cada vez mais pronunciado. Aos seis horas de tratamento tanto de peróxido e superóxido mitocondrial foram aumentadas em aproximadamente cinco e seis-vezes, respectivamente, em células MDAMB231. O aumento nos níveis de ROS em MCF10A era muito mais modesto, e quase não excedeu duas vezes sobre os níveis basais ROS mesmo após 6 horas de tratamento (Figura 1B). É possível que a acumulação contínua de ROS em linhas de células tumorais é diretamente relevante para a sua sensibilidade à Bezielle

Estes resultados representam uma pergunta sobre a natureza dos radicais do tipo peróxido induzidas por Bezielle:., Ou seja, não Bezielle induzir tanto peróxido e superóxido ou peróxido é meramente um produto de conversão de superóxido mitocondrial? Considerando que superóxido é uma espécie de vida curta de oxigénio reactivas, os níveis elevados do mesmo observado a 6 horas é provavelmente devido a geração contínua de mitocôndrias. Os correspondentemente elevados níveis de tipo peróxido de ROS pode ser resultante da conversão de superóxido a peróxido por superóxido dismutase.

Para examinar o papel do superóxido mitocondrial na morte celular induzida por Bezielle, nós empregamos um método bem-testado de desactivar respiração mitocondrial por cultura de células na presença de brometo de etídio. Após cultura das células em baixa concentração de brometo de etídio durante 6 semanas, estas células (MDAMB231Rho-0) que perderam a expressão de proteínas codificadas no genoma mitocondrial mitocondrial como pode ser visto na Figura 1C, tornando mitocôndrias não funcionais. Isto foi também confirmado através da análise do consumo de oxigénio de mitocôndrias MDAMB231 Rho-0 células, que foi muito reduzida (ver a seguir, a Fig. 6). Os Rho-0 as células foram tratadas com Bezielle, e examinadas para a indução de ROS e da morte celular. A Figura 1D mostra que os MDAMB231 Rho-0 células, como esperado, não geram superóxido mitocondrial em resposta a Bezielle, confirmando o papel do transporte de electrões mitocondrial na indução de ROS por Bezielle. Os níveis de peróxido gerado em Bezielle tratados Rho-0 foram algo aumentada em 30 minutos de incubação, mas não mostrou mais aumento ao longo do tempo (Figura 1D), apoiar fortemente a sugestão de que níveis elevados de peróxido pode ser devido em grande medida a conversão de superóxido mitocondrial. Mais importante ainda, os MDAMB231 Rho-0 foram muito fortemente protegido contra a morte celular induzida por Bezielle (Figura 1E), sugerindo o papel central da mitocôndria na morte de células tumorais tratadas com Bezielle.

Potenciais outras fontes celulares de ROS induzida por Bezielle

os dados acima descritos fortemente implicam o superóxido mitocondrial gerado no Bezielle citotoxicidade. No entanto, enquanto que a indução de superóxido mitocondrial por Bezielle foi completamente prevenida em Rho 0-células, o CM-H

2DCFDA detectável tipo peróxido de ROS, como mencionado acima, não foram completamente abolida (Figura 1D). Considerámos a possibilidade de alguns outros enzimas celulares capazes de produzir peróxido ou extra-dismutase mitocondrial pode contribuir para o stress oxidativo causado por Bezielle. Temos usado inibidores de várias enzimas celulares que produzem ROS: iod�io difenileno (DPI) e apocinina para a inibição da NADPH oxidases; alopurinol para inibir a oxidase de xantina, ácido nordihidroguaiarético (NDGA) para inibir a LOX, e éster nitro-L-arginina metil (L-NAME) para inibir a sintase do óxido nítrico. MDAMB231 células foram tratadas com Bezielle na presença de cada um destes inibidores, e o grau de morte celular, bem como a indução de ROS foi quantificado em ensaios relevantes. Nenhum dos inibidores da redução dos níveis de ROS nas células tratadas com Bezielle com a excepção de DPI (não mostrado e a Figura 2A). Da mesma forma, com a excepção de DPI, nenhum mostrou quaisquer efeitos de protecção sobre a morte das células (não mostrado).

. MDAMB231 células foram incubadas com Bezielle na ausência ou na presença de 0,75 uM DPI durante 6 horas e examinadas para a produção de ROS. B. morte celular em MDAMB231cells tratados com Bezielle durante 24 horas na ausência ou na presença de 0,75 uM DPI. Todos os resultados em A e B são a média ± E.P. (N = 3). Diferença significativa (* P 0,05; ** P 0,01) entre os grupos indicados são mostrados. C, morte celular em células de carcinoma da mama tratadas com SKBr3 Bezielle durante 24 horas na ausência ou na presença de 0,75 uM DPI. Os resultados são média de dois experimentos.

Figura 2A mostra a inibição de ambos os tipos de peróxido de ROS e produção de superóxido mitocondrial pelo DPI em células tratadas com Bezielle. A forte inibição observada de superóxido mitocondrial por DPI foi inesperado, uma vez que a inibição da NADPH oxidases (NOX) não deve ter um efeito profundo sobre as mitocôndrias, embora alguns estudos publicados sugerem a existência de um cross-talk entre a ativação Nox e produção mitocondrial de superóxido [28], [29]. No entanto, o DPI foi também reportada como sendo um inibidor potente da produção de superóxido mitocondrial provavelmente através da inibição não-específica de NADH oxidoredutase-ubiquinona no complexo mitocondrial I [30].

Não surpreendentemente, a inibição da produção de ROS induzida Bezielle por DPI teve um efeito protetor sobre a morte celular induzida por Bezielle (Figura 2B). Embora DPI sozinha foi um pouco citotóxico para as células, é atenuada fortemente a morte celular induzida por Bezielle (Figura 1E). Para excluir a possibilidade de que os efeitos do tratamento de PPP são uma característica especial de células MDAMB231, examinámos os efeitos de DPI em morte celular numa linha celular de carcinoma da mama SKBR3 adicional. As células SKBr3 mostrou uma proteção ainda mais forte por DPI do que MDAMB231, indicando que o efeito protetor da DPI em direção Bezielle não é um fenômeno isolado (Figura 2C).

Temos, portanto, examinado se o NOX não-fagocíticas conhecido por ser expressa em tumores da mama [29], [31] pode ser envolvidos em Bezielle citotoxicidade. Os resultados destas experiências são mostrados na Figura S2. Resumidamente, mesmo que Nox4 parece ser regulada positivamente por Bezielle em células tumorais, o silenciamento parcial da sua expressão em células MDAMB231 indicou que Nox4 ROS produzido não desempenham um papel significativo na morte celular induzida por Bezielle.

A questão, no entanto, manteve-se ainda sobre o mecanismo da redução de ROS mitocondrial pelo DPI. Verificou-se que DPI, mesmo com a baixa concentração usada aqui, inibe a respiração mitocondrial (ver abaixo), e, assim, com efeito, actua como inibidor de FOX, semelhante à ablação da função mitocondrial em células de Rho-0.

a indução de danos no DNA

Bezielle induz dano oxidativo ao DNA, que é fundamental para a sua capacidade de matar selectivamente as células cancerosas [8]. Examinamos como a falta de mitocôndrias funcionais e tratamento com DPI afetar indução de danos no DNA por Bezielle em MDAMB231 células. As células tratadas com Bezielle foram analisados ​​por ensaio de cometa de dois parâmetros de danos no DNA: Percentagem de células com o ADN danificado, e o momento de oliva (que reflecte a extensão dos danos no DNA em células individuais). Como pode ser visto na Figura 3A, o tratamento com Bezielle conduziu a um aumento progressivo no número de células com danos no DNA de até 6 horas. Após esse ponto do tempo, as células mortas com DNA parcialmente degradadas ou severamente danificado começou a acumular, tornando a quantificação cometa difícil. Análise do momento da cauda do cometa (Figura 3B) revelou um aumento acentuado de danos no ADN por célula induzida por Bezielle ao longo do tempo. O aumento da quantidade de danos no ADN por células de uma forma dependente do tempo correlaciona-se bem com o aumento observado nos níveis de ROS (Figura 2B).

. MDAMB231 células de controlo (MM231, MDAMB231) Rho-0 variantes (RHO-), ou células MDAMB231 em presença de DPI (+ dpi) foram tratados com Bezielle durante os tempos indicados e submetidas a análise de ensaio do cometa alcalino. Os resultados são apresentados como percentagens de células formadoras de cometas, média ± S.E. (N = 3). * diferenças significativas (P 0,05; ** P 0,01) entre os grupos de Rho-0 e de controlo, bem como entre o DPI-grupos tratados e de controlo são mostrados. B. mesmos experimentos como em um, mas os resultados apresentados são médias momentos oliveiras dos cometas induzidas por Bezielle em três populações celulares. Pelo menos 50 cometas foram analisados ​​por cada ponto de tempo em quatro experiências separadas. foram observadas entre as células de controle e ambos Rho- e grupos tratados com DPI; diferenças significativas (0,01 ** P 0,05; ** P 0,01) entre as células tratadas durante 30 minutos, em comparação com ambos os 2 e 6 horas estão apresentados. análise de mancha de Western de D. activação de PARP (PAR) nas células tratadas com indicados Bezielle durante 1 hora. São também mostrados a falta de expressão da proteína codificada para as mitocôndrias (complexo IV subunidade II) em Rho-0 células, expressão de proteína mitocondrial VDAC codificada no ADN nuclear, bem como β-actina como um controlo de carga. células de E. MDAMB231 e MDAMB231-Ró-0 as células foram tratadas com Bezielle durante os tempos indicados e analisados ​​para a presença de proteínas de poli-ADP-ribosylated. β-actina serve como um controlo de carga.

MDAMB231 Rho-0 células, menos de metade das células na população tratada mostrou a presença de danos no ADN mesmo após 6 horas (Figura 3a), e análise de oliva momento detectado baixos níveis de danos de ADN por célula que não aumentou ao longo do tempo (Figura 3B). A presença de DPI tinham um efeito limitado sobre o número de células com danos no DNA, mas teve um forte efeito inibidor sobre o aumento de danos no ADN por célula ao longo do tempo. O efeito fraco de DPI sobre o número de células com danos no DNA pode estar relacionado com o efeito protetor mais fraco dos DPI contra Bezielle morte induzida em relação à protecção em Rho-0 células (Figura 1E e 2B).

Temos também analisados ​​Bezielle danos no ADN induzida em células MCF10A, e observou-se que mesmo na presença contínua de Bezielle no meio de crescimento, danos no ADN nestas células foi gradualmente reduzido ao longo do tempo (Figura 3C). Sugere-se que níveis muito baixos de ROS induzidas em células MCF10A (Figura 1B) levou a níveis limitados de danos no ADN que foi reparado com êxito. Isto poderia explicar a redução dependente do tempo em danos ao DNA em células MCF10A.

documentaram hiper activação de PARP em células tumorais tratadas com Bezielle, e o seu papel na indução de morte celular. Examinamos se PARP foi ativado em MDAMB231 Rho-0 células ou em células tratadas com DPI. Tal como mostrado na Figura 3D, PARP foi fortemente activada em células MDAMB231. Em Rho-0 células, a activação de PARP foi significativamente menos robusto. Em células tratadas com DPI, Bezielle PARP activada a níveis entre estes observada em controle versus-ró 0 células (Figura 3D). PAR-ylation de proteínas em células MDAMB231 continuada durante horas após o início do tratamento com Bezielle, mas em Rho-0 células a activação de PARP era não apenas muito mais fraca, mas também de natureza transitória (Figura 3E). Ao todo, os dados acima mostram que a falta de mitocôndrias funcionais de indução fortemente inibida de ROS, danos no DNA, ativação de PARP e morte celular por Bezielle. Concluímos, portanto, que as mitocôndrias são o alvo celular primária de Bezielle.

As células cancerosas tratadas com Bezielle sofrer um colapso do sistema de defesa oxidativo

análise publicadas anteriormente das mudanças de transcrição induzidos por Bezielle em células tumorais [8] indicaram que o sistema glutationa redox está envolvida na resposta celular ao Bezielle, uma conclusão apoiada pelos recentes análises proteômicas e metabolômica [24]. Assim, foi observada uma expressão elevada de cistationina-beta-sintase e cisteína glutamato modificador ligase GCLM em células tumorais tratadas Bezielle mas não em células não transformadas. Portanto, examinámos os níveis de glutationa reduzida (GSH) em células tratadas com Bezielle. Os resultados na Figura 4A mostram uma queda rápida e forte da GSH em células MDAMB231. Os níveis de GSH foram um pouco reduzida em MCF10A, mas o declínio da GSH foi relativamente suave e não sustentada. Em tempos de incubação mais longos, GSH foi quase totalmente esgotada em MDAMB231 células (não mostrado). GSH é um importante antioxidante, e conversão de GSH oxidada (GSSG) para GSH requer NADPH. Temos, portanto, examinou os níveis de NADPH em células tratadas com Bezielle. Mesmo depois de apenas 4 horas (Figura 4B), houve um profundo esgotamento de NADPH em MDAMB231 células. de três experiências independentes.