Abstract

Fundo

(NHP) de glúten sensibilidade foi empregado para estudar as perturbações genéticas associadas a alterações glúten da dieta em pequenos tecidos intestinais de macacos rhesus sensível ao glúten (

Macaca mulatta

).

Metodologia

Estágios de remissão e recidiva foram realizados em animais sensíveis ao glúten pela administração de dietas (GFD) e contendo glúten sem glúten (GD), como descrito anteriormente. biópsias Pin-cabeça-de tamanho, obtidos de forma não invasiva por endoscópio pediátrico do duodeno, enquanto em GFD ou GD, foram utilizados para a preparação de RNA total e perfil genético, utilizando o comercial rhesus Microarray (Agilent Technologies), visando a expressão de mais de 20.000 genes .

principais conclusões

Quando comparado com o controle normal e saudável, macacos sensíveis ao glúten mostrou expressões de genes diferenciais induzidas pelo GD. Enquanto perturbações genéticas observadas foram classificados em uma das 12 categorias que se sobrepõem – câncer, o metabolismo, a função do trato digestivo, a resposta imune, crescimento celular, transdução de sinal, auto-imunidade, desintoxicação de xenobióticos, a apoptose, a deposição de actina-colágeno, neuronais e de função desconhecida – este estudo focada em redes de genes relacionados ao câncer, como a família do citocromo P450 (função de desintoxicação) e metaloproteinases de actina-colágeno de matriz (MMP) genes.

Conclusões /Significado

A perda de função de desintoxicação em paralelo com necessidade de metabolizar substâncias cancerígenas foi revelado em animais sensíveis ao glúten, enquanto em GD. Um aumento dos fatores de promoção do câncer e uma redução simultânea nos fatores de prevenção de câncer associados com a expressão alterada de rede gene da actina-colágeno-MMP foram anotados. Além disso, macacos sensíveis ao glúten mostraram número de genes diferencialmente expressos, incluindo aqueles associados ao câncer após a retirada do glúten da dieta reduzida. Tomados em conjunto, estes resultados indicam potencialmente expandido utilidade de macacos rhesus sensível ao glúten na pesquisa do câncer

Citation:. Sestak K, Conroy L, Aye PP, Mehra S, Doxiadis GG, Kaushal D (2011) Melhor xenobióticos Metabolism e redução da susceptibilidade ao cancro em macacos Gluten-sensíveis Após a introdução de uma dieta sem glúten. PLoS ONE 6 (4): e18648. doi: 10.1371 /journal.pone.0018648

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de outubro de 2010; Aceito: 11 de março de 2011; Publicação: 12 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sestak et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede R01DK076653 e 3R01DK076653 a KS ea subvenção de funcionamento base do TNPRC RR000164. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sensibilidade ao glúten é uma das características importantes de doença celíaca (CD), que é uma doença auto-imune caracterizado pelo revestimento danificado do intestino delgado devido a respostas desencadeadas pelo glúten dietético, um complexo de proteína encontrada no trigo, centeio, e cevada [2]. Uma série de manifestações histopatológicas foram descritas em pacientes com doença celíaca, e também em macacos rhesus com enteropatia sensível ao glúten – um modelo de primata não humano recentemente estabelecido de sensibilidade ao glúten [1], [3], [4], [5]. Nos seres humanos, Marsh [6], [7] dividido lesões associadas-CD, com base na gravidade, em cinco categorias. Em macacos rhesus, as lesões foram descritas para variar entre intra-epitelial leve e lâmina própria linfocitose até achatamento quase completa e fusão das vilosidades intestinais, com a inflamação crônica da lâmina correspondente [1], [5]. modelo macaque sensível ao glúten foi recentemente utilizado para demonstrar as alterações funcionais na permeabilidade intestinal durante a fase de degradação epitelial causados ​​pelo glúten da dieta. Verificou-se que, na fase de degradação, um péptido obtido a partir de glúten, tais como alfa-2-gliadina 33-mer é capaz de penetrar por baixo do epitélio intestinal em lâmina própria, consistente com os resultados descritos no celíacos [3], [4], [5], [8]. padrão interrompido de junções apertadas intestinais e deposição de auto-anticorpos que visam a enzima que desempenha um papel vital na digestão do glúten ou seja transglutaminase do tecido 2 (TG2) no duodeno de macacos com enteropatia glúten, mas não em controles saudáveis ​​também foi notada [5].

Apesar de extenso estudo de propriedades clínicas, imunológicas e histopatológicas de CD, relativamente pouco se sabe sobre os efeitos da sensibilidade ao glúten em outras doenças e sua relação potencial. A falta de conhecimento é evidente quando se tenta estudar os factores que desencadeiam a transição de um estágio da doença para outra. Subjacente a predisposição genética que apenas começou a ser elucidado em macacos sensível ao glúten é um outro componente importante desta doença complexa. Devido a um número crescente de relatórios clínicos que sugerem associação entre CD e linfomas de células T intestinais, adenocarcinomas, diabetes tipo 1, o autismo ou a síndrome de Down [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],14], [15], [16], é importante estabelecer se as observações dos estudos acima também pode ser demonstrada ao nível molecular. Essa investigação deve fornecer romance leva para as terapias existentes não só CD, mas também as doenças acima mencionadas. A fim de estudar as redes de genes seleccionados em hospedeiro primata sensível ao glúten, foram usadas uma tecnologia de microarray gene quantitativa e modelo de macaco rhesus. Supõe-se que as perturbações em redes de genes associados ao cancro seria observada em animais sensíveis ao glúten na fase de recaída contra fase de remissão. O mínimo de perturbações induzidas por mudanças glúten dietéticos eram esperados no controle normal e saudável e em animais sensíveis ao glúten na fase de meta primária remission.The era mostrar que os primatas sensível ao glúten responder às mudanças do glúten da dieta por cima /baixo-regulação da genes seleccionados e que tais perturbações podem ser ligadas a um risco aumentado de outras doenças tais como o cancro. objetivo secundário foi determinar se a retirada do glúten da dieta é suficiente para reverter essas alterações.

Resultados

Aumento dos níveis de AGA plasma e anticorpos TG2 em macacos sensíveis ao glúten

Retirada de glúten dietético resolve em macacos sensível ao glúten avaliação clínica, assim como as manifestações imunológicas da doença, incluindo a diminuição dos anticorpos AAG e TG2 no plasma [1], [3]. Em pacientes humanos, a presença combinada dos anticorpos AAG e TG2 é considerada um preditor de alta precisão de CD [2]. Neste estudo, a transição da GFD GD foi acompanhada por significativas (p 0,05) aumento de ambos AGA e TG2 anticorpos em macacos sensível ao glúten (Figura 1). De acordo com estes e anteriores relatórios, o período de GFD com níveis de linha de base da AGA e anticorpos TG2 é indicado aqui como a fase de remissão imunológica, enquanto o período de GD com aumento significativo da AGA e anticorpos TG2, é indicado como a fase de recaída imunológica. Em macacos de controlo saudáveis, anticorpos AGA e TG2 manteve-se em níveis basais, independentemente da ingestão de glúten da dieta.

respostas de anticorpos de plasma a gliadina e TG2 foram medidos em quatro glúten-sensível (FH45, FB97, DJ68 e DE87) e quatro normais saudáveis ​​(HK31, HT24, HD60 e IA24) macacos rhesus no momento da remissão e /ou recaída. Gráfico mostra dobrável aumentos de anticorpos ao longo da linha de base após a introdução de glúten na dieta. Significativa (p 0,05). Aumentos são indicadas (*)

expressão gênica diferencial em duodeno de macacos sensíveis ao glúten

Em comparação com o controle normal e saudável, macacos sensíveis ao glúten mostrou um aumento do número de genes diferencialmente expressos durante a fase de recaída enquanto no GD (Figura 2). Embora todos os três animais sensíveis ao glúten testados apresentaram um menor número de genes diferencialmente expressos durante a fase de remissão, FH45 Macaque foi o único que normalizou a sua expressão do gene durante o tratamento GFD a um nível de linha de base – comparável com a de um HK31 controlo saudável (Figura 2). Isso não era inteiramente inesperado, uma vez que o tempo necessário para realizar a remissão pode diferir substancialmente entre diferentes indivíduos, como ele é influenciado por muitos fatores fisiológicos e genéticos [17], [18].

Um específico do rhesus comercial matriz gene foi usado para medir a expressão diferencial de genes em oito amostras do duodeno a partir de quatro macacos de estudos selecionados: normal controle saudável (HK31), andFH45, FB97 e DJ68 glúten macacos sensíveis nas fases de remissão e /ou recaída. números absolutos de genes perturbados fora de ~20,000 testado por cada amostra são mostrados.

Categorias de genes diferencialmente expressos

Todos os genes com nível diferencial de expressão foram divididos em 12 categorias que se sobrepõem : 1- câncer, 2- metabolismo, 3- função do trato digestivo, 4- resposta imune, 5- crescimento celular, 6- transdução de sinal, 7- auto-imunidade, alergia, 8- desintoxicação de xenobióticos, 9- apoptose, 10 não conhecidos função, 11- rede gene da actina-MMP-colágeno, e 12- função neuronal. Três categorias sujeitas a um exame mais detalhado incluído: câncer, desintoxicação de xenobióticos e rede de gene-actina-colágeno MMP. Essas categorias foram selecionados com base em sua participação direta ou indireta na progressão do cancro ou supressão (Figuras 3 e 4). Desde câncer (categoria 1) genes foram representados por duas subcategorias distintas ou seja, o câncer de promoção e câncer de supressão e ambas as subcategorias contidas cima e para baixo-regulados genes, de categoria 1 terminou com um padrão menos distintas de expressão diferencial de categoria 8 ou 11 (Figuras 4 e 5). Categorias 8 e 11 apresentaram padrão previsível de expressão diferencial em todos os três macacos sensíveis ao glúten: Enquanto os genes responsáveis ​​pela desintoxicação de xenobióticos eram predominantemente regulados para baixo durante a recaída (Figuras 3 e 4D, E, F), genes de actina-colágeno-MMP rede foram sobre-regulada (Figuras 3 e 4A, B, C).

seleccionados três categorias de genes perturbados em duodeno de FH45 macaque sensível ao glúten (normalizados contra normal, controle saudável HK31 macaque), enquanto na dieta sem glúten . tons de cores diferentes correspondem às quatro categorias de genes perturbados. Também foram identificados padrões semelhantes de perturbação genética em FB97 e DJ68 sensível ao glúten macacos (não mostrados)

1 -. câncer, 2 – metabolismo, 3 – A função do aparelho digestivo, 4 – resposta imune, 5 – crescimento celular, 6 – transdução de sinal, 7 – auto-imunidade, alergia, 8 – desintoxicação de xenobióticos, 9 – apoptose, 10 – não função conhecida, 11 – rede de MMP actina-colágeno, e 12 – função neuronal. Distribuição relativa das categorias de genes regulados positivamente estão apresentados nos painéis A (FH45), B (FB97) e C (DJ68) enquanto que os genes-regulada negativamente estão apresentados nos painéis D (FH45), E (FB97) e F (DJ68).

dietéticos impactos retirada do glúten distribuição relativa das categorias de genes perturbados em macacos sensíveis ao glúten. Em três categorias seleccionadas [1 (cancro), 8 (desintoxicação de xenobióticos), e 11 (actina-colágeno-MMP rede)], estas alterações incluíram diminuição do número de eventos “promotoras do câncer”, tais como a regulação negativa da categoria 8 genes e up-regulação da categoria 11 genes. Os dados gerados com FB97 e DJ68 macacos durante a fase de remissão e recidiva são mostrados. FH45 macaque tinha apenas algumas perturbações genéticas durante a fase de remissão, enquanto na dieta livre de glúten, as contagens de genes, assim, relativos não são mostrados para este animal.

Impacto da retirada do glúten da dieta sobre a expressão gênica diferencial

Apesar de existirem semelhanças na expressão dos genes de três macacos sensível ao glúten durante a fase de recaída (Figura 4), existem também diferenças durante a fase de remissão (Figura 5). A explicação mais provável para as diferenças é que, apesar de que todos os três animais sensíveis ao glúten estavam em remissão imunológica no momento do procedimento de biópsia, expressão dos genes diferencial os FB97 e DJ68 ‘macacos não foram ainda no início do estudo, apesar de passar 10 semanas sobre GFD. Isto foi mais evidente no caso de DJ68 em que FB97, enquanto base completa e sem perturbações foram vistos em FH45 Macaque durante a fase de remissão, enquanto em GFD (Figura 2). Previsivelmente, a introdução de glúten na dieta resultou em aumento de genes perturbados em três animais sensíveis ao glúten testados com DJ68 sendo os maiores (Figuras 2 e 5).

rede gene da família do citocromo P450 é regulada em glúten-sensível macacos em relação à introdução de glúten dietético

com base em observações com pacientes com doença celíaca que mostram significativa diminuição da regulação do gene CYP3A4, um membro da família do citocromo P450, bem como um aumento na incidência de linfoma e de adenocarcinoma do intestino delgado, a previsão era de que macacos sensíveis ao glúten iria mostrar a infra-regulação de genes da família P450, enquanto no GD. Esperava-se que têm uma expressão relativamente normal destes genes, enquanto em GFD. expressão diferencial de rede gene P450 em todos os três macacos sensíveis ao glúten seguido acima previsão. A rede do gene P450 de FH45 animal é mostrado para ilustração (Figura 6): Seis de sete genes perturbados na rede P450 foram regulados negativamente na fase de recaída em contraste com apenas dois na fase de remissão. O fato de que um (CYP4B1) gene foi regulada em FH45 durante a fase de recaída ilustra a relação complexa entre fatores associados à sensibilidade ao glúten. Desde CYP4B1 metaboliza agentes cancerígenos, sua função é especialmente importante na presença de múltiplos fatores de promoção do câncer.

A introdução de glúten na dieta (estágio recidiva) down-regula vários dos genes em rede P450, enquanto a retirada do glúten da dieta (remissão fase) normaliza a sua expressão para o nível da linha de base: expressão em FH45 Macaque sensível ao glúten mostra em 5 de 6 perturbado genes sendo mais sub-regulada durante a fase de recaída do que durante a fase de remissão. Vermelho significa aumento da regulação de um gene, enquanto significa verde para baixo-regulação, com o nível padrão de expressão determinado pela HK31 macaque controle normal e saudável. Intensidade de cor representa a magnitude da mudança na expressão. As linhas sólidas significa que o produto de proteína do gene afeta diretamente os níveis de proteína do gene alvo, enquanto linhas pontilhadas significa que o produto de proteína do gene altera indiretamente os níveis de proteína do gene alvo através do envolvimento de um gene intermediária.

rede gene da actina-colagénio-MMP é expresso diferencialmente em macacos sensível ao glúten após introdução de glúten dietéticos

Esta rede regula a expressão de actina e de colagénio, que são importantes para o processo de cicatrização e a formação de tecido de cicatriz. Uma sobre-regulação destes genes foi o esperado como um possível mecanismo compensatório para reparar o dano tecidual causado pelo processo inflamatório crónico e /ou a reacção auto-imune no intestino delgado. Embora FH45 e DJ68 animais sensíveis ao glúten mostrou vários destes genes que são sobre-reguladas na fase de recaída (não mostrados), a diferença com a fase de redução não era tão proeminente como era no caso da FB97 em que quase toda a rede foi perturbado durante a fase de recaída (Figura 7). Enquanto actina e diferencial de genes de colágeno expressão foi consistente com o esperado aumento da regulação e /ou formação de tecido cicatricial, os dois matriz metaloproteinases chave MMP3 e MMP9 foram regulados negativamente, contradizendo a hipótese acima “formação de tecido cicatricial”.

introdução de glúten na dieta (estágio recidiva) up-regula a maioria dos genes de actina e de colágeno, enquanto MMP3 e MMP9 está regulada para baixo. Os dados gerados com FB97 macaque sensível ao glúten durante a fase de remissão e recidiva são mostrados. Vermelho significa aumento da regulação de um gene, enquanto significa verde para baixo-regulação, com o nível padrão de expressão determinado pela HK31 macaque controle normal e saudável. Intensidade de cor representa a magnitude da mudança na expressão. As linhas sólidas significa que o produto de proteína do gene afeta diretamente os níveis de proteína do gene alvo, onde, como linhas pontilhadas significa que o produto de proteína do gene altera indiretamente os níveis de proteína do gene alvo através do envolvimento de um gene intermediária.

Vários grupos de genes associados à doença são diferencialmente expressos em macacos sensíveis ao glúten

Além de 12 categorias de genes perturbados identificadas neste estudo em macacos sensível ao glúten (Figura 4), que era de interesse para identificar genes que ligaria esta condição com outras doenças do que o cancro, como cada vez mais relatada em estudos clínicos envolvendo celíacos [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Todos os três macacos sensível ao glúten testadas mostraram expressão diferencial de vários genes que podem estar ligados com CD não só mas também com autismo, alergia alimentar, síndrome de Down, doença de Alzheimer, artrite reumatóide, doença de Parkinson e a distrofia muscular (Figura 8). Embora significado destes achados precisa ser investigado mais, ele fornece direção potencialmente nova para futuras pesquisas sobre o desenvolvimento de modelos de primatas não-humanos das doenças acima.

categorias selecionadas (a doença celíaca,. B. Glúten geral sensibilidade ou inflamação e c. a outra doença) de genes regulados positivamente em duodeno de DJ68 e FB97 macacos sensível ao glúten (normalizados contra normal, controle HK31 macaque saudável), enquanto na dieta contendo glúten. tons de cores diferentes correspondem a diferentes categorias de genes perturbados.

aTGM2 = tecido transglutaminase 2 funciona como autoantig�io doença celíaca;

bIL17B = citocina IL-17 relatado para ser produzido em celíacos, mas não em outros pacientes sensíveis ao glúten;

cMICB = ligando NKG2D sugerido para mediar a transformação de TCR-dependente CD8 + CTL para TCR-independente (NK-like) IELs efetoras em pacientes com doença celíaca;

dIFNg = interferão gama é produzida por células T e promove o fluxo péptido glúten através do epitélio intestinal;

antígeno eITGAE ou seja CD103 foi sugerido para mediar a resposta auto-imune específica-celíaca no intestino delgado.

Mamu II

composição dos macacos sensíveis ao glúten

Apesar de todos os quatro macacos sensíveis ao glúten atribuídos para este estudo tinham anticorpos durante a fase de recaída não só contra gliadina mas também TG2 (auto-antigénio), a sua

Mamu II

(

DQA1

,

DQB1

e

composição DRB

) alelo provou não ser uniforme (Tabela 1). Isto possivelmente indica que a sensibilidade ao glúten é em macacos rhesus, quer a) associado a mais de um

MHC II

alelo devido a uma maior diversidade e um repertório mais amplo de

Mamu II

que

HLA II

[19], [20] ou b) glúten sensibilidade é em macacos não geneticamente relacionados com o

Mamu II

. Estudos adicionais estão em andamento com maior número de macacos sensíveis ao glúten para elucidar esta questão.

Discussão

Um modelo de macaco rhesus sensível ao glúten foi usado para estudar as expressões de genes diferencial induzida por GD. Além disso, foi analisada a relação potencial entre a sensibilidade ao glúten e câncer. Embora não haja um número crescente de relatórios clínicos que sugerem essa relação em pacientes com doença celíaca, os estudos que incidem sobre os mecanismos moleculares que ligam essas condições estão ausentes. Conforme descrito em relatórios anteriores, a administração de GFD ou GD ao glúten-sensível macacos rhesus está associado a ausência ou presença de série da clínica, histopatológica, metabólica e sintomas imunológicos, colectivamente referidos como fases de remissão ou recidiva, respectivamente [1] , [3], [4], [5]. Consistente com nossos macacos estudo, glúten sensíveis e controle recentes foram selecionados a partir da maior coorte de 500 animais candidatos com base na presença de AGA plasma e anticorpos TG2 [5]. Desde presença combinada de AGA e anticorpos TG2 é considerado em pacientes humanos como preditor altamente confiável de CD [2], [21], é importante salientar que todos os quatro macacos sensíveis ao glúten neste estudo tinham ambos os anticorpos AGA e TG2. Em contraste com o nosso trabalho anterior [1], [5], os sinais histopatológicos não foram usados ​​como preditores de sensibilidade ao glúten desde lesão da mucosa não foi objecto deste estudo.

Uma vez que existe uma associação cada vez mais evidências sugerindo entre CD, cânceres intestinais e outras doenças, aproveitamos o modelo macaco rhesus da sensibilidade ao glúten para elucidar a) se essa relação pode ser detectado no nível de expressão genética, e B) se as alterações na influência ingestão de glúten da dieta selecionada a expressão do gene. Para este fim, nós, principalmente utilizou um microarray específicas do rhesus capaz de medir a expressão de mais de 20.000 genes em uma amostra de tecido. Diferencialmente genes perturbados foram classificados em 12 categorias que se sobrepõem, incluindo três categorias principais de interesse: cancro, função de desintoxicação, e genes de actina-colágeno-MMP. Além disso, os genes expressos diferencialmente que foram relatadas previamente para ser associada com, também foram identificados vários outros doenças (Figura 8).

Os genes do citocromo P450 intestinais, tais como a CYP3A4 participam no metabolismo de xenobióticos para reduzir os seus efeitos adversos. No entanto, a expressão de CYP3A4 em pacientes com doença celíaca é reduzida significativamente em comparação com adultos saudáveis ​​[22], [23]. Além disso, os doentes de CD mostram aumento da incidência de linfoma de células T intestinais e adenocarcinoma [17], [18]. Portanto, os níveis reduzidos de citocromos P450 pode aumentar a biodisponibilidade de xenobióticos em celíacos, aumentando assim a incidência da progressão do cancro induzido por xenobióticos. A fim de determinar se a hipótese acima pode ser contemplado em estudos com macacos rhesus sensível ao glúten, expressão de genes do citocromo P450, juntamente com outros genes associados a cancro “” foi medido em biópsias duodeno obtidos nas fases de remissão e recaída. Prevê-se que a falta de citocromos P450 expressão do gene é revertido com a retirada do glúten da dieta – colocando os macacos sensíveis ao glúten em GFD. Os resultados deste estudo mostram claramente que a regulação negativa da rede gene do citocromo P450 ocorre em macacos sensíveis ao glúten, enquanto em GD. Observou-se também que tais infra-regulação é melhorada pelo tratamento GFD embora reversão completa para um nível comparável ao indivíduo saudável normal foi realizado apenas em um dos três macacos sensíveis ao glúten testadas por microarrays. É plausível partir dos resultados obtidos que, se os macacos sensíveis ao glúten seria mantida em GFD por um período mais longo, permanecendo dois animais continuaria a inversão do citocromo P450 para baixo-regulação. A rede gene do citocromo P450 para baixo-regulação foi acompanhada com geral up-regulação da rede gene da actina-colágeno-MMP. Consistente com os nossos resultados, foi relatado que a sobre-regulação de actina e de colagénio com regulação negativa simultânea das MMP3 e MMP9 ocorre como uma medida para evitar a formação de cancro em ratinhos tratados experimentalmente [24]. Uma vez que isto foi observado em FB97 Macaque durante recaída, é provável que as perturbações genéticas em rede de actina-colagénio-MMP são indicativos de uma resposta inata de protecção contra a invasão do cancro em pelo menos alguns dos primatas sensível ao glúten (Figuras 3 e 7).

Apesar de os padrões previsíveis de expressão gênica em supracitada categoria 8 (desintoxicação) e 11 genes (actina-colágeno-MMP), categoria 1 (cancro) não seguiram esse padrão, devido à alta complexidade das interações genéticas nesta categoria, com múltiplos genes e -suppressing promotoras do câncer a ser simultaneamente afetados por mudanças de glúten da dieta. Tomados em conjunto com a categoria 8 e 11 resultados de expressão gênica No entanto, nossos resultados indicam que a fase de recaída da sensibilidade ao glúten em macacos rhesus é propício para a tumorigênese e pode ser parcialmente revertida pela retirada do glúten da dieta.

Muitas questões ainda permanecem . Alguns destes são, devido ao nosso conhecimento incompleto se macacos rhesus alelos da classe II são associados com a sensibilidade ao glúten de uma forma análoga aos pacientes humanos com doença celíaca ou seja,

DQ2 /8

alelos [2], [18], [25] , [26]. O nosso modelo atual só pode ser referido como modelo de “sensibilidade ao glúten”, tendo em mente que existem pelo menos duas categorias de sensibilidade ao glúten em primatas: a primeira das quais é

Mamu II

dependente while (CD-like) segundo é

Mamu II

independentes (alergia alimentar-like). Os nossos resultados que envolvem a análise genética de mais de 50 macacos rhesus com e sem sensibilidade ao glúten indicam que um

Mamu II

-associated predisposição para essa condição existe em macacos rhesus [Sestak et ai., Não publicado]. Relativamente alta variação na distribuição de gene diferencial neste estudo pode ser explicado por diferentes

Mamu II

fundos em animais sensíveis ao glúten selecionados (Tabela 1). A fim de melhorar o modelo de Rhesus de sensibilidade ao glúten e para torná-lo mais relevante, como um modelo de CD, selecção de macacos sensível ao glúten terá de ser efectuada no futuro também no contexto de

MamuII

pré-rastreio . Nossos resultados indicam que CD, alergia alimentar e de outras doenças genes associados à condição, incluindo os relacionados com o cancro são diferencialmente expressos em macacos sensíveis ao glúten. Finalmente, os resultados aqui apresentados mostram que as perturbações genéticas acima são melhorados e até revogada pela retirada do glúten da dieta. Estes resultados podem ser usados ​​como uma plataforma para futuros estudos que visem a elucidação da relação entre o CD e câncer.

declaração de Ética Materiais e Métodos

A aprovação para todos os procedimentos veterinários nos neste estudo foram obtidos a partir da Universidade de Tulane animal Care e do Comitê Use (Protocolo # 3508), Bem-Estar animal Assurance a-4499-01. Animais deste projeto estavam sob o cuidado integral dos veterinários da Tulane National Primate Research Center, em conformidade com as normas fixadas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH) 78-23 (revista, 1996). Todos os procedimentos veterinários foram realizados apenas com animais sedados. bem-estar animal e medidas foram tomadas para amenizar o sofrimento de acordo com as recomendações do relatório Weatherall.

Animais e dietas

Quatro sensível ao glúten-(FH45, DJ68, DE87 e FB97) e quatro normais , controle saudável (HK31, HT24, HD60 e IA24) macacos rhesus (

Macaca mulatta

) de subespécies indianos, 2-9 anos de idade, símio-retrovirais gratuitos, de ambos os sexos foram utilizados neste estudo. Uma vez que a prevalência da sensibilidade ao glúten em macacos é semelhante ao dos humanos, os animais sensíveis ao glúten foram seleccionados a partir da maior coorte de 500 candidatos, como descrito em detalhe noutro documento [5]. macacos Gluten-sensíveis foram distinguidos dos normais, saudáveis ​​pela presença de ambos anti-gliadina (AGA) e anti-transglutaminase tecidual 2 anticorpos séricos (TG2). Todos os animais sensíveis ao glúten foram mantidos, pelo menos, 10 semanas em dieta sem glúten (GFD), seguido de 10 semanas de regular, Chow contendo glúten (GD) (PMI Nutrition Intl., St. Louis, MO), para realizar a estágio de remissão e recidiva. A transição de GFD a GD foi caracterizado por significativa (p 0,05) aumento da AGA e anticorpos do soro anti-TG2 acima da linha de base (figura 1). No caso dos animais de controlo saudáveis, os níveis de anticorpos estavam sempre na linha de base, independentemente da ingestão de glúten da dieta.

intestino delgado e amostra de sangue periférico coleção

Dois ml de sangue periférico foram coletadas na fase de remissão e /ou recaída de todos os animais, tal como descrito [5]. Além disso, a amostra de duodeno distal (cinco pin-head biópsias feitas sob medida) foi cobrado na fase de remissão e recidiva de três animais sensíveis ao glúten com mais alto nível de aumento de anticorpos (Figura 1) por endoscópio pediátrico como descrito [5]. No caso de animais saudáveis ​​(HK31), o procedimento de endoscopia também foi realizada duas vezes em paralelo com procedimentos realizados em animais sensíveis ao glúten, apesar de que nenhum estágio recaída caracterizada por aumento de anticorpos significativa esteve presente em HK31 em associação com a introdução de glúten na dieta (Figura 1 ). Todas as amostras de biópsia colhidas foram imediatamente colocadas em cinco ml de solução de ARN-posterior (Qiagen, Valencia, CA) para preservar a ARN. O sangue foi processado para extrair o plasma, o qual foi armazenado a -20 ° C e testadas por ELISA indirecta para detectar a presença de anticorpos anti-gliadina e anti-TG2 [1].

isolamento de ARN, ADNc síntese

o ARN total foi extraído a partir de biópsias intestinais utilizando o kit de micro Qiagen’sRNeasy mais, seguindo as instruções do fabricante. Uma biópsia do pino-cabeça-de tamanho de cinco recolhido foi suficiente para isolar a quantidade necessária de ARN utilizando o espectrofotómetro RNeasy kit.NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE) foi usada para medir a concentração e pureza do ARN. O ARN total foi utilizado para realizar a síntese de cDNA e rotulagem corante de cianina como descrito anteriormente [27], usando o Agilent Baixa ARN de entrada linear estojo de amplificação de rotulagem (LRILAK). O cDNA marcado foi utilizado para realizar a hibridação durante a noite para macaco rhesus microarray todo genoma da Agilent, de acordo com as instruções do fabricante [28].

procedimento de Microarray e expressão gênica

A comercialmente disponível oligonucleotídeo macaco rhesus inteiros genoma Microarray abrangendo ~20,000 genes-alvo (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) foi utilizado. Arrays foram impressos utilizando o formato k 4 × 44 (Agilent Technologies). As lâminas foram lavadas de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, fotografada usando o software GenePix Pro 6.1. medições individuais foram gravadas em pelo menos dois duplicados. A resultante.

gal

arquivos foram analisados ​​por SpotfireDecisionSite, módulo de análise Microarray (TIBCO-Spotfire, Boston MA), como descrito anteriormente [28]. Após a remoção de manchas não fiáveis, os dados foram normalizados utilizando um gráfico de dispersão localmente ponderada algoritmo de alisamento (LOWESS) e as proporções resultantes das alterações no gene-expressão capturado numa escala logarítmica para duas [28]. Cada conjunto de genes diferencialmente expressos continha tanto “up-regulamentados” e “down-regulamentados” queridos.